CPE β-Pore Structure

TURMA P2, GRUPO 3
CATARINA CRUZ VAZ
FILIPA GLÁUCIA RODRIGUES LEMOS
MICAELA FARIA FREITAS
Crystal structure of Clostridium
perfringens enterotoxin displays
features of β-pore-forming toxins
ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE PROTEÍNAS: ANÁLISE DE UMA PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA
LABORATÓRIO DE BIOFÍSICA/BIOQUÍMICA
LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA
2º ano, 2º semestre
29 de Maio de 2013

Qual o mecanismo de β-pore-forming adoptado pela CPE e as características estruturais dos poros transmembranares
formados, causadores de danos na permeabilidade selectiva das células-alvo?
Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) displays
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 3 DE JUNHO DE 2011
QUESTÃO-PROBLEMA
Clostridium perfringens enterotoxin (CPE)
Toxina β-pore-forming (β-PFT)
A CPE é um agente causador de intoxicações alimentares ao alterar a permeabilidade selectiva das células-
alvo do epitélio intestinal.
O mecanismo de acção e as características estruturais dos poros formados não estão ainda devidamente
documentadas
EM CONTEXTO…

ABORDAGEM EXPERIMENTAL
CONSTRUÇÃO DE 2 PRIMERS
NcoCPE5`-aaaaccatggcgATGCTTAGTAACAATTTAAATC-3` CPEXhoI5`-aaactcgagAAATTTTTGAAATAATATTGAATAA-3`
Figura 1: Técnica de PCR
OBTENÇÃO DA CPE

CLONAGEM
Recorrendo a:
pCR2.1-TOPO TA
SEQUENCIAÇÃO
Figura 2: Plasmídeo pCR2.1-TOPO TA
OBTENÇÃO DA CPE

Aplicação de enzimas de restrição
NcoI e XhoI
Inserção no plasmídeo pET-28a(+)
Inserção da tag His6
Figura 3: Plasmídeo pET-28a (+)
OBTENÇÃO DA CPE

E. Coli BL21-CondonPlus (DE3)-
RIL(Stratagene)
Transformada com pET28a-CPEwt
Deixada durante a noite 1 L LB
medium c/
50 µg/mL de
canamicina e
50 µg/mL de
cloranfenicol
Incubação a 37 ⁰C em agitação vigorosa até que Abs600 nm = 0,6.
Inoculação 10mL
OBTENÇÃO DA CPE

Adição de IPTG até uma
concentração final de 1 mM
5000 rpm
20 min, 4⁰C
• Lavagem das células com água fria
• Ressuspensão em 50 mM de
tampão Na2PO4 pH 8,0, incluindo
0,3 M NaCl e 1 mM imidazole
12000 rpm
20 min, 4⁰C Sonifier S-350 a 4⁰C
6h depois
Indução da expressão da proteína
recombinante com IPTG
Centrifugação
Sonicação
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

12000 rpm
20 min, 4⁰C
Sobrenadante
Cromatografia em gel de
níquel-ácido nitrilotriacético
Proteína recombinante
eluída por gradiente de
concentração de imidazole
1-500 mM
Diálise
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Fracção com
CPE
Electroforese
12,5% PAGE
Centrifugação
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

Cristalização
Sitting-drop vapour diffusion
Cristais obtidos ao fim de algumas semanas
Forma triangular, de dimensões máximas 0.3 x 0.3 x 0.2 Å
Monitorização inicial: método da matriz dispersa
Gotas de 1 µL solução CPE e 1 µL solução utilizada com 25% (v/v) de polietilenoglicol 3350, 0,2M de NaCl e
0,1M de Tris-HCl, pH=8,0, a 25ºC, em equilíbrio com 500µL da solução de cristalização
Solução 8 mg/mL CPE His-tagged C-terminal em 0,01 M Tris-HCl pH 8.0

Clostridium perfringens
Manipulação genética
Proteína recombinante
Gene: CPE
Gene ID: 3897031
Escherichia coli Plasmídeo pET28a(+)
Inserção
Transformação

Figura 5: Sequência de aminoácidos e estruturas
secundárias
Fonte da proteína estudada: Clostridium perfringens
Método de obtenção: Manipulação genética – produção de uma
proteína recombinante.
Gene: CPE (Gene ID – 3897031)
Hospedeiro: Escherichia coli
Vector hospedeiro: plasmídeo pET28a(+)
Características da estrutura depositada no PDB
Coordenadas atómicas depositadas no Protein Data Bank (PDB),
sob o código 3AM2
Imagens obtidas com recurso ao software PyMol®
Classificação: enterotoxina
Método: Difracção de raios-X, resolução 2.51 Å
Em síntese…

17 folhas β e 5 α-hélices
319 aminoácidos (35 N-terminal s/ observação de densidade electrónica)
Figura 6: Monómero de CPE, com distinção dos respectivos domínios
Verde: domínio I; Azul: domínio II; Rosa: domínio III
RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Ligação do domínio I às claudinas Tyr306, Tyr310, Tyr312 e Leu315
Figura 7: Resíduos envolvidos na ligação às claudinas assinalados a vermelho na imagem

Domínio II e III
Semelhança com outras toxinas
• Aerolisinas
• ε-toxina da C.perfringens
• Lectina hemolítica do fungo
lactiporus sulfareus
Figura 8: Domínio II (azul) e domínio III (rosa).

Figura 9: Arg208 inserida na α-hélice 2
Estabilização do trímero
• Maiores interacções entre o domínio
I e III
• O domínio III interage com a
estrutura β-barril do domínio I
• A Arg208 está inserida na α-hélice 2
• A Phe268 está inserida
hidrofobicamente na hélice 310b do
domínio III
Figura 10: Phe268 inserida na hélice 310b do domínio III

DISCUSSÃO
Mecanismo de β-pore-forming
1ª hipótese
O poro forma-se através da conduta que se estabelece através da Glu94 e Glu110.
Figura 11: Resíduos de aminoácidos; E94 E E110 referem-se aos resíduos de Glu94 e Glu110, respectivamente

DISCUSSÃO
1ª hipótese
Figura 12: Resíduos de aminoácidos Glu94 e
Glu110 (ampliada)
O poro forma-se através da conduta que se
estabelece através da Glu94 e Glu110.

DISCUSSÃO
2ª hipótese
Tinha como base o canal que se formava quando a CPE se apresentava sobre a forma de trímero.
Evidências que descartaram esta hipótese:
• O canal não está rodeado por estruturas rígidas como α-hélices e barris-β
• O comprimento do trímero não é suficiente para atravessar a membrana
• A toxina encontra-se sobre a forma de monómero em solução

DISCUSSÃO
3ª hipótese
• Semelhança que existe entre os domínios II e III com os de outras toxinas
• Padrão de alternância de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos que conferem
características anfipáticas
Figura 13: Formação de
poros por outras toxinas

DISCUSSÃO
Mecanismo de β-pore-forming Região Anfipática: Val81 à Ile106
Figura 14: Região anfipática, obtida por
Jmol, representada com cores mediante a
estrutura secundária para o trímero.
Figura 15: Trímero com a região anfipática no
centro. Monómeros representados com cores
diferentes. Estrutura obtida por Jmol.

DISCUSSÃO
Região Anfipática: Val81 à Ile106
Figura 16 e 17: Trímeros com a representação da região anfipática representada com uma forma estrutural diferente,
numa visualização horizontal e vertical. Estrutura obtida por Jmol para o trímero de CPE (3AM2).

Crystal structure of Clostridium perfringens enterotoxin
(CPE) displays features of β-pore-forming toxins
RESPOSTA À QUESTÃO-PROBLEMA
Mecanismo de β-pore-forming está possivelmente associado à região anfipática
β4 + α1 e loop correspondente
Organização de um complexo oligomérico pré-pórico
Dobra no domínio II permite inserção da região
anfipática na superfície da membrana
Citolisinas dependentes do
colesterol
(modelo de comparação à CPE)
Carácter β-PFT da CPE
Mecanismo a partir da estrutura ?

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