O genoma do agente de tuberculose Mycobacterium tuberculosis codifica uma proteínaputativa de ligação de celulose (CBD2), ...
As celulases são encontrados na base de dados enzimas carboidratos Ativa (www.cazy.org)(Cantarelet al., 2009), em nove fam...
smegmatis(CP000480), Mycobacterium ulcerans (CP000325) (Stinear et al., 2007, 2008),Mycobacterium marinum (CP000854) (Stin...
RT-PCR.O RNA total foi extraído a partir de 40 ml de culturas em fase exponencial de organismos deMycobacterium. As micoba...
exemplo, as espécies de M. smegmatis estritamente ambientais, Mycobacterium sp. MCS,Mycobacterium sp. JLS, Mycobacterium s...
A ausência de ADN genómico nas nossas amostras de RNA foi ainda confirmado pela ausênciade amplificação por PCR (dados não...
aerossol, sendo responsável por surtos de tuberculose (Rodwellet al., 2008) e tuberculosebovina (Wilkins et al., 2008). Ta...
tratamento do M. tuberculosis H37Rv com mefloquina (um derivado de 4-quinolina metanol)durante 24 h (Danelishvili et ai., ...
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

O genoma do agente de tuberculose mycobacterium tuberculosis codifica uma proteína putativa de ligação de celulose

497 visualizações

Publicada em

0 comentários
0 gostaram
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

  • Seja a primeira pessoa a gostar disto

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
497
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
3
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
4
Comentários
0
Gostaram
0
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

O genoma do agente de tuberculose mycobacterium tuberculosis codifica uma proteína putativa de ligação de celulose

  1. 1. O genoma do agente de tuberculose Mycobacterium tuberculosis codifica uma proteínaputativa de ligação de celulose (CBD2), um candidato de celulase (Cel12), e uma celulasetotalmente activa (Cel6). Esta observação é intrigante, porque a celulose é um dos principaiscomponentes das paredes celulares da planta, enquanto que o M. tuberculosis é umpatogénico humano, sem contacto com as plantas conhecidas. A fim de investigar o papelbiológico de tais genes celulose segmentação em M. tuberculosis relatamos aqui a busca eanálise da transcrição desse conjunto de genes do gênero Mycobacterium. Uma em buscasilico para celulose visando ortólogos constatou que apenas 2,5% dos genomas bacterianossequenciados codificar o gene Cel6, Cel12 e CBD2 definir simultaneamente, incluindo as docomplexo M. tuberculosis (MTC) membros. A amplificação por PCR e sequenciaçãodemonstrou ainda a presença destes genes em três de cinco MTC bactérias não sequenciados.Entre micobactérias, a combinação de Cel6, Cel12 e CBD2 era única para os membros da MTC,com a excepção de Mycobacterium bovis BCG Pasteur, que carecia CBD2. RT-PCR em M.tuberculosis H37Rv indicaram que os três genes de celulose-targeting foram transcritos emmRNA. O presente trabalho mostra que os organismos MTC são da exclusiva micobactériasentre muito poucos organismos para codificar os três genes de celulose visando CBD2, Cel6 eCel12. Nossos dados apontam para um único, ainda desconhecido, a relação com hospedeirosnão plantas produtores de celulose, como as amebas.INTRODUÇÃOA celulose, um polímero linear de resíduos de glucose ligados por β-1, 4 ligações, torna-secerca de metade das paredes celulares das plantas e é tanto o polissacarídeo mais abundantee a principal fonte de carbono fotossinteticamente fixo na Terra (Doi e Kosugi, 2004 , Gilbert etal, 2008;. Lynd et al, 2002).. A resistência natural da celulose para a digestão microbianaprovavelmente guiou plantas para usá-lo para construir paredes celulares espessas, quepodem durar até vários milhares de anos. Celulases Com efeito, apenas algumas saprófitasmicro-organismos de origem fúngica ou bacteriana evoluíram, ou seja, enzimas capazes de seligar a celulose e hidrolisar a glicose (Lyndet al., 2002). Uma característica notável das celulasesé que a sua estrutura é frequentemente modular, de modo que o domínio catalítico carregaum ou mais módulos de ligação de celulose.A recente descoberta de que o Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculosehumana, codifica uma celulase funcional, Cel6 (Rv0062), foi, portanto, totalmente inesperado(Varrotet ai., 2005). A análise do genoma de M. tuberculosis Rv1090 mostra que o genecodifica potencialmente um segundo celulase (Cel12) e Rv1987 que o gene codifica umaproteína candidata celulose de ligação (CBD2). Estes três genes celulose direccionamento sãoconcluídas pela presença de um gene putativo β-glicosidase, Rv0186.
  2. 2. As celulases são encontrados na base de dados enzimas carboidratos Ativa (www.cazy.org)(Cantarelet al., 2009), em nove famílias baseadas em seqüência de glicosídeo hidrolases (GHS),ou seja, GH5, GH6, GH7, GH8, GH9, GH12 , GH44, GH45 e GH48. Destas, as duas celulases demicobactérias (Cel6 e Cel12) pertencem a famílias e GH6 GH12, respectivamente.Nas paredes de células de plantas, a celulose encontra-se incorporado em váriospolissacarídeos complexos (hemiceluloses e pectinas) e lignina (Lyndet al, 2002;. Varner e Lin,1989), e os genes de celulases são normalmente acompanhadas por genes que codificam parauma série de enzimas ativa contra xilanas e pectinas.Ortólogos dos genes de M. tuberculosis, Cel6 Cel12 e CBD2 foram encontrados em todos osgenomas de micobactériasactualmente disponíveis, incluindo três das sete espécies docomplexo M. tuberculosis (MTC), isto é, M. tuberculosis H37Rv (AL123456), M. tuberculosisH37Ra (ABQ72837), M. tuberculosis CDC1551 (AE000516), M. tuberculosis F11 (ABR05454), M.tuberculosis KZN 1435 (CP001658), Mycobacterium bovis (BX248337) e M. bovis BCG Tóquio(AP010918). Não se sabe se outros membros da MTC ou grupos não-tuberculosas, como aMycobacterium avium (MAC) ou Mycobacterium abscessus complexo também têm os mesmosgenes putativos de celulose-alvo. Da mesma forma, não há informações sobre a transcriçãodesses genes, o que dificulta uma investigação mais aprofundada sobre o papel potencial degenes de celulose-alvo em espécies de Mycobacterium. Em um esforço para compreender opapel dos genes em Mycobacterium celulose de metas, temos procurado a presença do geneCel6, Cel12 e CBD2 situado representantes dos complexos Mycobacterium e examinaram suatranscrição.MÉTODOSAnálises de bioinformática.A presença ou a ausência dos genes Cel6, Cel12 e CBD2 em 907 genomas bacterianos foiextraído a partir da base de dados cazy (www.cazy.org), que é actualizado continuamente nonosso laboratório a partir de exame do dia-a-dia do dia de lançamentos GenBank (Cantarel etal., 2009). A pesquisa foi então completado por BLAST (Altschulet al., 1990), pesquisas degenomas adicionais do MTC, MAC e outros organismos não-Mycobacterium tuberculosis(NTM), que estão disponíveis como seqüências de referência no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /). Estes genomas incluiu três membros MTC, ou seja, de M. tuberculosisH37Rv (AL123456) (Cole et al., 1998), M. bovis (BX248333) (Garnier et ai., 2003) e M. bovisBCG (Pasteur e estirpes de Tóquio) (NC_008769, AP010918) (Brosch et al, 2007;.. Seki et al,2009), dois membros do MAC, ou seja, 104 M. avium (CP00479) e M. aviumsubsp.paratuberculosis K-10 (AE016958) (Li et al., 2005), o Mycobacterium leprae Br4923(FM211192), M. leprae TN (AL450380), M. abscessus (CU458896), Mycobacterium
  3. 3. smegmatis(CP000480), Mycobacterium ulcerans (CP000325) (Stinear et al., 2007, 2008),Mycobacterium marinum (CP000854) (Stinear et al., 2008), Mycobacterium vanbaalenii(CP000511), Mycobacterium sp. MCS (CP000384), Mycobacterium sp. JLS (CP000580),Mycobacterium sp. KMS (CP000518) e Mycobacterium gilvum (CP000656). A organizaçãogenómica dos Cel6, Cel12 CBD2 e foi derivado a partir de genes de controlo do genoma deMycobacterium acima mencionados. Predição péptido de sinal foi realizado utilizando Phobius(http://phobius.cbr.su.se/).A amplificação por PCR e sequenciação.Para evitar artefactos, controlámos a qualidade do ADN genómico e de qualquer par deiniciadores de PCR utilizadas, incluindo os controlos negativos em todas as misturas de PCR.Também tomamos o cuidado de incluir todas as espécies de Mycobacterium patogênicos,incluindo os organismos da MTC, os organismos MAC e os organismos NTM. O DNA genômicoisolado dos membros da MTC (M. tuberculosis H37Rv CIP103471, M. bovis CIP105050,Mycobacterium africanum CIP105147T (tipo 1), M. bovis BCG cepa 105.060, Mycobacteriummicroti CIP104256, Mycobacterium canettii CIP140060001T, Mycobacterium pinnipedii ATCCBAA-688 e Mycobacterium caprae CIP105776T), a partir dos membros do MAC (M.aviumsubsp. hominissuis IWGMT49, Mycobacterium intracellulare CIP104243, Mycobacteriumchimaera CIP107892T e Mycobacterium colombiense CIP108962) e de M. abscessusCIP104536, a Mycobacterium marinum isolado clínico e Mycobacterium fortuitum ATCC 49404foi utilizado como um molde para a amplificação por PCR e sequenciação de M. tuberculosisCel6, Cel12 e CBD2 genes ortólogos. Pares de primers de PCR foram projetados após oalinhamento das seqüências do genoma do Mycobacterium GenBank (Tabela 1 ⇓) usandoPrimer3 Input 0.4.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Os PCRs foram realizados em umtermociclador 2720 (AppliedBiosystems) num volume final de 50 ul contendo 25 ul de H2O, 5ulde 10 x tampão (Qiagen), 25 mM de MgCl2, 100 uM de cada dNTP, 5 uM de cada iniciador(Eurogentec) , 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 5 ul de ADN de micobactérias,utilizando o seguinte programa: 5 minutos a 95 ° C, seguido de 35 ciclos consistindo de 95 ° Cdurante 30 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 90 s, e um passo de alongamento de 10 mina 72 ° C. Para cada experiência, um controlo negativo consiste de mistura de PCR sem ADNalvo foi incluída. Os produtos de PCR foram resolvidos por electroforese num gel de agarose a1,5% (w / v), e corados com brometo de etídio. Os produtos de PCR foram, em seguida,purificado por meio de adição de 50 ul de H2O destilada a uma placa de purificação (Millipore),que foi agitada durante 10 min. Misturas de sequenciação de avanço e inversa continham 3 ulde tampão (BigDye v1, AppliedBiosystems), 10 ul de H2O destilada e 1 mL de 3,2 pmol deprimer ul-1, num volume final de 16 ul. A reacção de sequenciação compreendia um passoinicial de desnaturação de 1 min a 95 ° C, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 96 ° Cdurante 10 s, hibridação a 50 ° C durante 5 s e alongamento a 60 ° C durante 3 min. Produtosde sequenciação foram purificadas utilizando uma placa de Sephadex (AmershamBiosciences),que foi centrifugado a 720 g durante 3 min, e depositados numa placa de reacção de 96 poçosMicroAmpOptical (AppliedBiosystems). Sequenciaçãoelectroforese foi realizada sobre um3100 GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems).
  4. 4. RT-PCR.O RNA total foi extraído a partir de 40 ml de culturas em fase exponencial de organismos deMycobacterium. As micobactérias foram colhidas por centrifugação a 1000 g durante 5 min e osobrenadante foi descartado. O sedimento foi ressuspenso em 1 ml de tampão de RLT(Qiagen) contendo 0,1% de 2-mercaptoetanol e transferida para um tubo de 2 ml com tampade rosca contendo contas de sílica (IEPSA Medical Diagnostics) e a mistura foi homogeneizadanum instrumento FP120 FastPrep durante 45 s em velocidade 6,5 (Qbiogene). Apóscentrifugação a 8000 g durante 1 min à temperatura ambiente, 700 ul de etanol foramadicionados e a solução foi dividida e aplicadas em duas colunas de centrifugação RNeasy(Qiagen). A centrifugação foi efectuada a 8000 g durante 15 segundos e a amostra foi, então,lavada uma vez com 700 ul de tampão de RW1 e duas vezes com 500 ul de tampão de RPE(Qiagen). O ARN foi eluído com 50 mL de água isenta de RNase por coluna, e as amostrasforam adicionalmente tratados com DNase I para eliminar qualquer contaminação do ADNgenómico. A análise de RNA foi feita por electroforese em formaldeído a 1,5% de gel deagarose. Para a RT-PCR, o RNA de 10 ul foi misturada com 25 ul de 2 × Master Mix (Invitrogen),1 ul (10 uM) dos iniciadores específicos do gene para a frente e reverso ⇓ (Tabela 2) e 2,5 U deDNA polimerase Platinum PFX (Invitrogen) , e fez-se a 50 mL com água destilada. A reacção foirealizada num termociclador 2720 nas seguintes condições: 45 ° C durante 30 min, 95 ° Cdurante 2 min, seguido de 25 ciclos consistindo de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 45 s e 72° C durante 1 min e um passo de 5 min de elongação a 72 ° C. Produtos de RT-PCR foramresolvidos por electroforese em gel de agarose 1,5% e corado com brometo de etídio.RESULTADOSanálises de bioinformáticaFora dos 907 genomas bacterianos analisados no banco de dados cazy (Novembro de 2009),apenas 2,5% abrigam os Cel6, Cel12 e CBD2 genes simultaneamente (Tabela 1 ⇑). 23 Estesgenomas incluem um grupo de 16 organismos saprófitas e sete membros MTC ⇓ (Fig. 1). Valeressaltar que a maioria dos degradadores da parede celular vegetal não aparecem nesta lista,já que raramente um porto Cel12 ortólogo. Entre os membros da MTC, apenas com M. bovisBCG Pasteur 1173P2 estirpe não tem o gene CBD2 (Mahairaset al., 1996). O gene Cel12 foiencontrado para estar presente em todos os membros do MTC e ausentes em todas as outrasespécies de Mycobacterium em estudo. A estrutura deste gene é invulgar, sendo compostapor dois fragmentos que se sobrepõem (CelA2a e CelA2b). Apesar da similaridade desequência com bonafide Cel12 proteínas tais como a de Streptomyceslividans (Sulzenbacheretai., 1997) é significativa, as proteínas MTC Cel12 todas parecem ter um truncamento queeliminou o péptido de sinal e os 40 primeiros aminoácidos. O significado e as consequências datruncagem não são claros, uma vez que não afectam a região catalítica da proteína (dados nãoapresentados). Não MTC micobactérias, como as Mycobacterium avium 104, M. aviumsubsp.paratuberculose K-10, gilvum M., M. marinum e M. vanbaalenii, codifica apenas dois dos trêsgenes (Tabela 1 ⇑). Algumas outras micobactérias porto e apenas um dos três genes (por
  5. 5. exemplo, as espécies de M. smegmatis estritamente ambientais, Mycobacterium sp. MCS,Mycobacterium sp. JLS, Mycobacterium sp. KMS eo agente da úlcera de Buruli M. ulcerans).Finalmente, o agente patogénico humano intracelular M. leprae falta a três celulose-targetinggenes completamente (Tabela 1 ⇑).A disposição dos três genes de celulose-alvo dentro dos genomas de vários membros MTC foisemelhante (fig. 2 ⇓). Essa semelhança na organização também é verdade que para o tamanhoe os espaçadores intergênicas entre esses genes. Em 104 M. avium e M. aviumsubsp.paratuberculose K10, o espaçador intergénica entre Cel6 e CDB2 foi de 2,4 Mb, semelhante aode M. vanbaalenii, enquanto que em M. marinum, era duas vezes maior. A orientação dessesgenes no genoma foi semelhante em todos os MTC, MAC e alguns membros de MNT, exceptopara M. e M. vanbaaleniigilvum (Fig. 2 ⇓).Cel6 CBD2 e produtos de genes putativos foram encontrados para possuir um péptido de sinalentre o género Mycobacterium, enquanto o produto do gene Cel12 faltava um péptido desinal em todos os membros do MTC. Observou-se que a região de 31,27 kb do genoma de M.marinum, que contém o gene Cel6 foi excluído em M. ulcerans, uma observação semelhantefoi feita ao alinhar a região genómica Cel12 em M. tuberculosis H37Rv com a regiãocorrespondente em M. marinum e M. avium genomas, que carecem deste gene. Entre osmembros da MTC, o gene Cel6 interespécies semelhança seqüência de nucleotídeos variou de97,6% entre M. e M. microticanettii para 99,7% entre M. microti e M. caprae. Nós nãoencontramos nenhuma exclusão ou inserção no gene Cel6 nas cepas de referência MTC. Asequência do gene de M. canettii CBD2 exibiu 99,4% de semelhança com a sequência dereferência M. tuberculosis H37Rv MTC, enquanto M. caprae, M. microti, M. africanum e M.pinnipedii rendeu 100% CBD2 similaridade de sequência com a sequência do gene dereferência do MTC , M. africanum, M. caprae, M. microti, M. pinnipedii e M. canettii rendeuseqüências idênticas para o gene Cel12. Estes dados mostram que os três genes de celulose dedireccionamento são altamente conservadas entre os membros do MTC.A amplificação por PCR, sequenciação e RT-PCRA amplificação por PCR e sequenciação mostrou que Cel6, Cel12 e CBD2 genes estavampresentes no genoma de M. canettii, M. africanum, M. pinnipedii, M. microti, M. caprae, M.tuberculosis H37Rv e M. bovis, enquanto o M .bovis BCG Pasteur estirpe faltava o gene CBD2.Todos os originais Cel6, Cel12 e CBD2 seqüências de nucleotídeos dos membros não-seqüenciadas MTC foram depositadas no GenBank (Tabela 3 ⇓). Em cepas MAC, Cel6 e CBD2foram detectados em M. intracellulare, M. quimera, M. colombiense e M. aviumsubsp.hominissuis, enquanto que em estirpes de MNT, Cel6 o gene estava presente em M.smegmatis e M. fortuitum. Experimental amplificação por PCR e os dados de sequenciaçãoobtidos nos membros MTC correlacionados com dados in silico, usando uma pesquisa BLASTcom as sequências de M. tuberculosis H37Rv de nucleótidos de referência, dos Cel6, Cel12 eCBD2 genes (acesso GenBank n. NC 000962) (Cole et al., 1998) como seqüências de consultano banco de dados não redundante do NCBI.
  6. 6. A ausência de ADN genómico nas nossas amostras de RNA foi ainda confirmado pela ausênciade amplificação por PCR (dados não mostrados). Amplificação por RT-PCR utilizando ARNisolado a partir de M. tuberculosis H37Rv CIP103471 mostrou que Cel6, Cel12 e CBD2 foramtranscritos em mRNA. Uma única banda de a (200 pb) de tamanho esperado foi detectada(dados não mostrados). O produto de RT-PCR foi sequenciado e a sequência produziu 100% desimilaridade com a sequência de referência M. tuberculosis H37Rv. Nenhuma banda de PCR foidetectado em controlos negativos ADNase I-tratados. Isto indica que os Cel6, Cel12 e CBD2genes presentes no genoma de M. tuberculosis H37Rv são transcritos em mRNA.DISCUSSÃOUsando análises de bioinformática observou-se a presença de um conjunto de três genes decelulose de segmentação em espécies de Mycobacterium com um genoma completamentesequenciado. O estudo foi concluído por meio de experimentos baseados em PCR paraidentificar, amplificar e determinar as sequências de três genes de celulose-alvo em outras 14espécies de Mycobacterium DNA e mRNA. De acordo com nossa pesquisa de banco de dados,o conjunto de três genes de celulose-alvo, Cel6, Cel12 e CBD2, está presente em apenas 2,5%das bactérias com uma seqüência completa do genoma (Tabela 1 ⇑ e S1 suplementarestabela). Estes incluem bactérias habitantes do solo e organismos marinhos em contato complantas em decomposição. Porque celulose quase nunca ocorre como um componente puroem paredes de células de plantas, saprófitas têm um espectro completo de enzimas para todosos constituintes das paredes celulares da planta, e os micróbios celulolíticas normalmenteproduzem uma coorte de enzimas de pectinase e hemicelulase, juntamente com os seuscelulases. Em contraste, os membros da MTC se destacam porque os putativos genes celulosesegmentação não são acompanhadas por outras enzimas celulares parede digerir plantas. Ofacto de os membros do MTC máquinas celulolítica é tão focada sugere que a parede celularda planta pode não ser o alvo real para a atividade celulolítica em organismos MTC.A falta de Cel6, Cel12 e CBD2 genes no genoma de M. leprae, é congruente com a redução dogenoma severa que acompanha a evolução da espécie para uma vida estritamente parasitárias(Cole et al., 2001). Cinco espécies de Mycobacterium (Tabela 1 ⇑) codificados e apenas um dostrês genes de celulase de segmentação, o que sugere uma actividade limitada para a celulose,se houver. A grande maioria das espécies de Mycobacterium (Tabela 1 ⇑ e S1 suplementarestabela) codificado Cel6 e um gene putativo CBD2. O facto de os organismos de mamíferos(CMT-associados espécie responsável pela tuberculose) eram os únicos organismos deMycobacterium para expor o conjunto completo de Cel6, Cel12 e CBD2 genes foi inesperado.M. bovis tem sido mostrado para ser transmitido a partir de bovinos para bovinos e de bovinospara os humanos (Ashfordet ai., 2001), por via oral, sendo assim potencialmente em estreitocontacto com os géneros alimentícios contendo celulose no tracto digestivo dos animaisvertebrados, tais como ratinhos (Boulahrouf et ai., 1990) e porcos (Varel et ai., 1984). Damesma forma, temos mostrado recentemente que organismos vivos de M. tuberculosispodem ser detectados nas fezes de pacientes com tuberculose pulmonar (El Khechineet al.,2009). M. bovis, no entanto, também é eficientemente transmitido diretamente pela via
  7. 7. aerossol, sendo responsável por surtos de tuberculose (Rodwellet al., 2008) e tuberculosebovina (Wilkins et al., 2008). Também tem sido demonstrado que a M. bovis pode sobreviver aingestão por amebas, o que sugere que os protozoários poderia melhorar significativamente asobrevivência de M. bovis no solo e, portanto, pode ser um instrumento para a transmissão datuberculose bovina (Taylor et al., 2003) . Da mesma forma, o M. tuberculosis é principalmentetransmitida directamente por via aerossol e não tem conhecido reservatório ambiental (Rileyetal., 1995). No entanto, o fato de que esses três genes de celulose de metas são altamenteconservadas em organismos MTC argumenta contra a idéia de que esses genes estariam emum estado degenerado.Um relatório recente identificou a pneumophila estirpe Legionella 130b Cela gene, o que foimostrado para degradar a celulose e carboximetil celulose microcristalina (Pearce &Cianciotto,2009). Porque L. pneumophila reside no amebas que produzem celulose, tem sido sugeridoque Cela poderiam estar envolvidos no crescimento intra-amiba de Legionella. No entanto,tem-se observado que um mutante de L. pneumophila Cela deficiente e de uma estirpe de tiposelvagem tanto exibem um crescimento comparável em trofozoítos amebas e macrófagos epersistência comparável nos pulmões, o que indica que celA não é necessária para a vidaintracelular nem para a infecção pulmonar (Pearce &Cianciotto, 2009). Com base nestesdados, tem sido sugerido que a proteína Cela poderia promover o crescimento desteorganismo em ambientes aquáticos naturais que contêm níveis mais elevados e / ou diferentestipos de polissacáridos, incluindo celulose produzida por plantas, amebas ou outras bactérias.Nossa observação de que os organismos MTC também possuem celulose de metas genes emseu genoma é um pouco semelhante a este relatório recente. Em 104 M. avium, M.tuberculosis a região de 7,8 kb que inclui Cel12 foi eliminado, deixando uma região de 2,1 kbcobertas por duas proteínas hipotéticas e um espaçador (fig. 3 ⇓), nenhum delescorrespondente a M. tuberculosis e Cel12a Cel12b genes, sugerindo que estas proteínas nãoeram Cel12 ortólogos. Esta observação sugere que o gene Cel12 foi mantida exclusivamenteno MTC estirpes de um ancestral Mycobacterium. Árvores filogenéticas baseadas emMycobacterium Cel6 e CBD2 seqüências mostram que os oito membros da MTC se agrupam(Recurso Figos S1 e S2). Esta observação sugere que estes genes são típicos de MTC eorganismos de Mycobacterium e que não ocorreu nenhuma recente transferência lateral degenes.A capacidade de um gene para responder aos sinais internos / externo pode ser determinadapela sua capacidade de ser transcrito em ARNm. Temos estudado a transcrição das Cel6, Cel12e CBD2 genes, e os três foram transcritos para mRNA. A transcrição de Cel6 era previsível, estegene foi clonado e a proteína codificada é expressa em Escherichia coli, de uma forma activa(Varrotet ai., 2005). Além disso, o gene Cel6 tem sido mostrado para ser reprimidos em M.tuberculosis, um mutante sem SIGF (Geimanet ai., 2004), indicando que a regulação destegene é SIGF-dependente. O gene Cel12 carece de um péptido de sinal e apresenta umaestrutura potencialmente fragmentada que poderia sugerir decaimento do gene. Demonstrou-se que a segunda parte do gene Cel12, nomeadamente CelA2b, é regulada por meio de
  8. 8. tratamento do M. tuberculosis H37Rv com mefloquina (um derivado de 4-quinolina metanol)durante 24 h (Danelishvili et ai., 2005). Esta observação sugere que, mesmo que o gene de M.tuberculosis Cel12 apresenta uma estrutura fora do comum, que está implicado nosmecanismos de resistência a mefloquina em M. tuberculosis. Muitas celulases partilham umaarquitectura de base comum, que compreende um domínio catalítico ligados a um domínio deligação à celulose (CBD), que determina a eficácia da degradação da celulose insolúveis. Emnosso estudo, verificamos que o M. tuberculosis CBD2 foi transcrito em mRNA, e este genetambém possui um peptídeo sinal, o que certamente aponta para um papel extracelular.Pesquisas Bioinformatics combinados com análises de PCR revelaram que um conjunto de trêsgenes de celulose de segmentação (Cel6, Cel12 e CBD2) está presente no genoma de membrosMTC. A única excepção é a estirpe de M. bovis BCG Pasteur, em que o gene CBD2 foi perdidojuntamente com várias outras porções de ADN. Verificámos que os genes-alvo de celulose sãotranscritos em mRNA e tem sido demonstrado anteriormente que a proteína Cel6 codificadapode ser expressa como uma proteína activa (Varrot et ai., 2005). Observações preliminaressugerem que este grupo Cel12 CBD2 e também pode ser clonada e as proteínas expressas emE. coli (F. MbaMedie e outros, observações não publicadas).Tem sido demonstrado que a análise de todo o genoma de um micro-organismo fastidiosopode ajudar a criar um meio de cultura adequado (Renestoet ai., 2003). Aqui nós mostramosque a análise da seqüência do genoma também podem revelar características metabólicasinesperados ou habilidades. De fato, a presença de proteínas de celulose visando relatado aquilevanta a questão de uma possível ainda desconhecido fase, ambiental em bactérias MTC,talvez como saprófitas do solo ou como hospedeiros de organismos produtores de celulose,como as amebas, como sugerido por M. bovis( Hagedorn et al, 2009;. Taylor et al, 2003)..

×