Fabrication and characterization of chemical sensors made from nanostructured...
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos
1. 21
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
ARTIGO ORIGINAL
¹ Universidade Estadual de Campinas –
UNICAMP–Campinas, SãoPaulo,Brasil
² Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo – FCMSCSP – São
Paulo,SãoPaulo,Brasil
³ G r u p o d e P e s q u i s a e m
Nanoneurobiofísica (GNN), Departamento
de Física, Química e Matemática (DFQM),
Universidade Federal de São Carlos –
UFSCar – Campus de Sorocaba, São Paulo,
Brasil
4
Faculdade de Medicina de Jundiaí –
FMJ–Jundiaí,SãoPaulo,Brasil
Endereçopara Correspondência:
Gustavo Ferreira Simões - Laboratório
de Regeneração Nervosa, Instituto de
Biologia, Universidade Estadual de
Campinas – UNICAMP, Rua Monteiro
Lobato, 255, CEP: 13083-970, Campinas,
SP, Brasil. Tel.: +55 19 3521-6646 e-mail:
gfsimoes2@gmail.com
Suporte para apesquisa:
Este trabalho teve auxílio financeiro da
Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES -
Programa Nacional de Pós-Doutorado
C A P E S / P N P D , P ro j e t o n ú m e ro :
23038006985201116) e do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq – Proc. 471632/2012-
0).
Nãoháconflitosdeinteresse.
Todos os direitoseditoriaisadquiridos.
Artigorecebidoem:02deAgostode2014.
Artigoaceitoem:12deOutubro de2014.
RESUMO
INTRODUÇÃO: A esclerose múltipla é
uma doença autoimune de caráter
progressivo no SNC (Sistema Nervoso
C e n t r a l ) . O m o d e l o d e E A E
(Encefalomielite Autoimune Experimental)
é capaz de reproduzir a patogenicidade da
esclerose múltipla associada à resposta
i m u n i t á r i a . O s l i n f ó c i t o s T
encefalitogênicos têm papel importante na
esclerose múltipla e tem-se tentado modular
essas células através de estratégias
terapêuticas. A pregabalina é um fármaco
análogo ao ácido gama-aminobutírico
(GABA) que atua como anticonvulsivante, o
qual reduz a liberação de noradrenalina e
glutamato, bem como tem a capacidade de
modular a transmissão sináptica excitatória
e promover efeitos antiapoptóticos e anti-
inflamatórios. OBJETIVOS: Analisar
morfologicamente, in vitro, a neuroproteção
promovida pela pregabalina em culturas de
células neuronais com meio condicionado
contendo linfócitos T encefalitogênicos.
MÉTODOS: Camundongos C57BL/6
fêmeas de seis semanas de idade foram
induzidos para EAE. Decorridos dez dias da
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória
de linfócitos T encefalitogênicos.
Pregabalin protects neurons of pro-inflammatory action of the T lymphocytes encephalitogenic.
Palavras-chave: Encefalomielite Autoimune Experimental; Sistema Nervoso Central; Técnicas de Cultura de Células; Pregabalina.
Key words: Encephalomyelitis, Autoimmune, Experimental; Central Nervous System; Cell Culture Techniques; Pregabalin.
Gustavo Ferreira Simões¹,²,³
Rodrigo Fabrizzio Inácio¹
Giuliano Roberto Gonçalves¹
4
Taize Machado Augusto
Rodolfo Thomé¹
Liana Verinaud¹
Alexandre Leite Rodrigues de Oiveira¹
Fábio Lima Leite³
2. 22
indução de EAE, os animais foram mortos e
os baços coletados assepticamente para o
preparo de suspensões celulares, as quais
foram enriquecidas em linfócitos T. Os
sobrenadantes das culturas foram coletados
e utilizados para o preparo de meio
c o n d i c i o n a d o d e l i n f ó c i t o s T
encefalitogênicos. Células Neuro2A foram
cultivadas e, posteriormente, foram tratadas
com meio condicionado contendo os
linfócitos T encefalitogênicos e pregabalina
sendo posteriormente processadas para
imunocitoquímica (anti-Sinapsina).
RESULTADOS: Células Neuro2A tratadas
somente com meio condicionado
apresentaram redução do número total de
células, 24 horas após início do tratamento.
Após o tratamento com pregabalina
observamos neuroproteção, evidenciada
pelo número total de células e aumento da
imunorreatividade anti-sinapsina.
CONCLUSÃO: A pregabalina demonstrou
ser um fármaco com potenciais efeitos
neuroprotetoresduranteocursodaEAE.
ABSTRACT
Multiple sclerosis is an autoimmune
disease of the CNS (Central Nervous
System) with progressive character. The
e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e
encephalomyelitis (EAE) model is able to
reproduce the pathogenicity of multiple
sclerosis-associated immune response. The
encephalitogenic T lymphocytes play an
important role in multiple sclerosis and have
been shown to modulate these cells through
therapeutic strategies. Pregabalin is a
Gamma-Amino Butyric Acid (GABA)
analog drug, with GABA-like activity, that
acts as an anticonvulsant which reduces the
release of norepinephrine and glutamate,
and have the ability to modulate the
excitatory synaptic transmission and
promote anti-apoptotic and anti-
inflammatory effects. OBJECTIVES:
Morphologically analyze in vitro
neuroprotection promoted by pregabalin in
neuronal cells cultured with conditioned
medium from encephalitogenic T
lymphocytes. METHODS: C57BL/6
females six weeks old were EAE induced.
After ten days from EAE induction, the
animals were sacrificed and the spleens
collected aseptically for preparation of cell
suspensions, which were T lymphocytes
enriched. Culture supernatants were
collected and used for preparation of
conditioned medium from encephalitogenic
T lymphocytes. Neuronal cells were
cultured and then treated with conditioned
medium and pregabalin at 30, 150 and 300
µg/ml and subsequently processed for
immu n o cy to ch emis tr y ( s y n ap s in
antiserum). RESULTS: Neuronal cells
treated with conditioned medium alone
showed reduction in total cell number 24
hours after initiation of treatment. After
treatment with pregabalin we observed
neuroprotection, as evidenced by the total
n u m b e r o f c e l l s a n d i n c r e a s e d
i m m u n o r e a c t i v i t y f o r s y n a p s i n .
CONCLUSION: Pregabalin is a drug with
potential neuroprotective effects during the
courseofEAE.
INTRODUÇÃO
Aesclerose múltipla (EM) é uma doença
autoimune de caráter progressivo,
caracterizada pela destruição da bainha de
m i e l i n a , c o m p e r d a e v e n t u a l d e
oligodendrócitos1. A desmielinização da
substância branca do sistema nervoso
central (SNC) desencadeia vários sintomas
neurológicos2-5. A mortalidade, em
pacientes com EM, não é muito diferente da
observada em indivíduos sem a doença.
Porém, a progressão dos déficits
neurológicos ocorre em todos os portadores
da doença. Sabe-se que após 15 anos do
início da doença, cerca de 50% dos pacientes
necessitam de auxílio para deambular e,
após 25 anos, a maioria está incapacitada
para tal. Esta e outras incapacidades
parecem se relacionar com o número e a
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
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3. 23
gravidade de surtos nos primeiros anos do
cursodaEM6.
Um modelo para o estudo da EM é a
encefalomielite autoimune experimental
(EAE), cuja investigação, como modelo
animal, tem sido de grande utilidade, pois é
possível observar degeneração axonal
similar à observada em humanos com EM 2.
Aindução da EAE pode ser ativa ou passiva.
A forma ativa baseia-se na imunização de
ratos ou camundongos com baixas doses de
proteína básica de mielina (MBP),
proteolipoproteína (PLP) ou glicoproteína
da mielina de oligodendrócitos (MOG),
administradas em conjunto com um
adjuvante apropriado 7,8. Já a forma passiva
é caracterizada pela transferência de
linfócitos ou células T encefalitogênicas
ativadas, provenientes de animais
sensibilizados7.
A resposta inflamatória associada às
lesões desmielinizantes caracteriza-se por
infiltrado contendo células CD4, CD8 e
macrófagos 9. Acredita-se que essa resposta
imunitária seja dirigida contra antígenos
derivados do SNC 10. O modelo de EAE
reproduz essa patogenicidade associada a
este tipo de resposta imunitária, sendo
possível demonstrar que existem linfócitos
autorreativos (CD4+ e CD8+), que são
células efetoras, capazes de conduzir o
processo de desmielinização do SNC.
Recentemente, descobriu-se que existem
subtipos de células CD4 (Th1 e Th17) com
características diferentes e que podem
contribuir para lesão no SNC através de
diferentes tipos de mediadores inflamatórios
10. Por outro lado, tem sido demonstrado
que existe uma população de células T com
capacidade imuno-regulatória (designadas
de células T reguladoras) que são capazes de
prevenir ou limitar a neuroinflamação 11-
13. Existem também, outras populações
reguladoras, entre elas as células T natural
killer(NKT) 14.
Dada a importância das células T na
patogênese da EM, tem sido propostas
várias estratégias terapêuticas que se
baseiam no controle dessas células. Essas
estratégias podem se basear em eliminação
física das células T, sua modulação ou
sequestro. Desta forma, os estudos
envolvendo a interação entre culturas
celulares e fármacos podem facilitar a
análise neuroprotetora que estes possuem
sobre as células nervosas nos modelos
experimentaisdaEAE.
A pregabalina é um fármaco análogo ao
GABA (ácido gama-aminobutírico) 15 que
atua como anticonvulsivante e possui efeitos
positivos no tratamento de pacientes com
dores neuropáticas severas, como por
exemplo, neuropatia diabética, neuralgia
pós-herpética 16-20. Seu uso é aprovado
pela Food and DrugAdministration (FDA) e
pela Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), sendo considerada
uma substância de controle especial. Como a
gabapentina, a pregabalina se liga à
subunidade α2δ (tipo1) dos canais de cálcio
21,22
voltagem dependentes e, assim, atenua o
influxo de cálcio para o interior da célula
23
neuronal reduzindo a liberação de
23,24 25
noradrenalina e de glutamato . A
pregabalina possui, também, a capacidade
de modular a transmissão sináptica
26 27
excitatória , reduzir a atividadeneuronal e
promover efeitos antiapoptóticos e anti-
28
inflamatórios .
OBJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi
analisar morfologicamente, in vitro, a
neuroproteção promovida pelo tratamento
com pregabalina em culturas de células
Neuro2A, com meio condicionado contendo
linfócitosTencefalitogênicos.
EXPERIMENTOSINVIVO
ANIMAIS
Camundongos C57BL/6 fêmeas, com
seis semanas de vida, foram adquiridos do
Centro Multidisciplinar para Investigação
Biológica na Área da Ciência emAnimais de
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
4. 24
Laboratório (CEMIB/UNICAMP) e
mantidos em condições S.P.F. (specific-
pathogen free) com água e ração
autoclavadas ad libitum, tendo a
temperatura e o fotoperíodo em ciclos de 12
horas controlados durante todo o
experimento. Os protocolos envolvendo
animais de laboratório foram executados de
acordo com as normas da Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL/COBEA) e aprovados
pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA/UNICAMP), sob o número de
processo2687-1.
INDUÇÃO DAEAE
Através de uma seringa de vidro,
foram injetadas 100µg de glicoproteína de
mielina de oligodendrócitos (MOG),
correspondendo à sequência de aminoácidos
35-55, em emulsão de igual volume,
contendo adjuvante completo de Freund,
subcutâneamente nas patas posteriores dos
animais. Após a indução, os animais foram
agrupados em gaiolas plásticas e
acompanhados diariamente até surgirem os
primeirossinaisclínicos.
Diariamente, foi realizada a análise e
classificação dos sinais e sintomas da
doença, com a finalidade de identificar o
período de surto (que ocorre entre o 9° e 14°
após a indução). Os primeiros sinais da
doença são evidenciados com a flacidez da
c a u d a d o a n i m a l ( q u e o c o r r e m
aproximadamente no 9° dia após a indução –
grau 1), depois ocorre a paralisia parcial de
um membro posterior (aproximadamente no
11° dia após a indução – grau 2), seguido de
paraplegia (aproximadamente no 13° dia
após a indução – grau 3) e tetraplegia
(aproximadamente no 14° dia após a
indução – grau 4). Após a exacerbação da
doença, o animal começa a se recuperar e
restando sinais residuais da EAE
(aproximadamente no 20° dia após a
indução).
E N R I Q U E C I M E N T O D E
LINFÓCITOS T E PREPARO DE MEIO
CONDICIONADO
Decorridos dez dias da indução de EAE,
os animais foram submetidos à eutanasia e
os baços coletados assepticamente para o
preparo de suspensões celulares, as quais
foram enriquecidas em linfócitos T de
acordo com protocolo previamente
descrito29. Brevemente, as células foram
ressuspendidas em solução de Percoll
(SIGMA-ALDRICH, USA) 37% e
sobrepostas em solução de Percoll 65%.
Após centrifugação a 320 G por 20 minutos,
as células presentes na interface das
densidades de Percoll foram recolhidas e
lavadas em meio RPMI (SIGMA-
ALDRICH, USA), suplementado com 10%
de Soro Fetal Bovino (SFB, CULTILAB,
BRASIL).
Posteriormente, as células foram
semeadas em placas de cultura de seis
cavidades e incubadas a 37ºC por 72h em
meio RPMI+10%SFB na presença ou
ausência de peptídeo MOG (10 µg/mL). Os
sobrenadantes das culturas foram coletados
e utilizados para o preparo de meio
c o n d i c i o n a d o d e l i n f ó c i t o s T
encefalitogênicos. Para utilizarmos o meio
condicionado sobre as culturas neuronais, o
mesmo foi diluído a 30%, utilizando-se
meio de cultura de crescimento para células
neuronais.
EXPERIMENTOS “IN VITRO” -
CULTURAS CELULARES
Células Neuro-2a (ATCC®CCL-
131™) foram obtidas da American Type
Culture Collection (ATCC – University
Boulevard Manassas, VA/USA). Após seu
r e c e b i m e n t o , a s c é l u l a s f o r a m
descongeladas e lançadas em garrafas para
cultura (COSTAR, USA) contendo meio
com 42.5% DMEM (NUTRICELL,
BRASIL), 10% de soro fetal equino e 5% de
soro fetal bovino e 42.5% de meio HAM-
F12 em incubadora, sob temperatura de
37°C e atmosfera de 5% de CO2. Após
atingirem confluência de 90%, as células
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
5. 25
foram tripsinizadas (70 µl de tripsina/EDTA
em 4 ml de PB por três minutos) e,
posteriormente, foi adicionado soro fetal
bovino para bloqueio da ação enzimática. A
solução resultante foi colocada sobre um
coxim de BSA (bovine serum albumin,
albumina bovina 4% em DMEM) e
submetida à centrifugação (1.300 rpm por
10 minutos). Após a centrifugação, o
precipitado foi ressuspendido em meio de
cultura completo adicionado com 10% de
DMSO. A solução foi aliquotada em
criotubos de 2 ml (SIGMA-ALDRICH,
USA) e submetida ao congelamento gradual
paraobterumestoquedecélulas.
Ao longo do experimento, as células
foram descongeladas à temperatura
ambiente, conforme demanda, e lançadas
em garrafas de 25 cm² em meio contendo
42.5% DMEM (NUTRICELL, BRASIL),
10% de soro fetal equino e 5% de soro fetal
bovino e 42.5% de meio HAM-F12. Ao
atingirem 90% de confluência, as células
foram tripsinizadas (70 µl de tripsina/EDTA
em 4 ml de PB por três minutos) e,
posteriormente, foi adicionado soro fetal
bovino para bloqueio da ação enzimática.As
células foram lançadas em placa para cultura
(COSTAR, USA) contendo 24 poços (300 µl
em cada poço), sendo mantidas em
incubadora sob temperatura de 37°C e
atmosfera de 5% de CO2. Após 24 horas,
deu-se início ao tratamento com pregabalina
(princípio ativo) na dosagem de 300 µg/ml,
150 µg/ml e 30 µg/ml durante 24
horas30,31.
Para melhor compreensão dos
resultados, os grupos foram denominados da
seguinte maneira: Controle (células
N e u r o 2 A t r a t a d a s c o m m e i o d e
c r e s c i m e n t o ) , C o n t r o l e + m e i o
condicionado (células Neuro2A tratadas
c o m m e i o c o n d i c i o n a d o ) , M e i o
condicionado + 30 µg/ml (células Neuro2A
tratadas com meio condicionado +
tratamento com 30 µg/ml de pregabalina),
Meio condicionado + 150 µg/ml (células
Neuro2Atratadas com meio condicionado +
tratamento com 150 µg/ml de pregabalina) e
meio condicionado + 300 µg/ml (células
Neuro2Atratadas com meio condicionado +
tratamentocom300µg/mldepregabalina).
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Finalizado o período de tratamento, as
células foram fixadas com paraformaldeído
4% em DMEM. Após a fixação, as células
foram lavadas em PB sem cálcio e magnésio
(0,1M, pH 7,4, NUTRICELL, BRASIL) e
incubadas durante duas horas com anticorpo
primário burro anti-sinapsina (1:200,
SANTA CRUZ, USA). Foram, então,
novamente lavadas em PB estéril e
incubadas durante 45 minutos com
anticorpo secundário anti-burro conjugado
com CY-3 (JACKSON LAB., USA).
Concluído o tempo de incubação, as células
foram lavadas, sendo posteriormente
realizada citoquímica com DAPI (4-6-
diamidino-2-fenilindol) que evidencia o
núcleo celular, intercalando-se às moléculas
de DNA utilizando filtro para luz
ultravioleta acoplado em microscópio de
fluorescência. Desse modo, foi possível
quantificar o número de células presentes
após o tratamento com meio condicionado e
pregabalina utilizando o programa Adobe
Photoshop CS5. Após finalização da
técnica, as culturas foram mantidas em
glicerol/PB 0,01M (3:1), para observação ao
microscópio de fluorescência (LEICA, DM
5500B), equipado com uma câmara de
fluorescência (DFC345FX) e software
LAS-AF (Versão 4.2) do Laboratório de
Regeneração Nervosa, IB-UNICAMP. Para
cada grupo (controle e tratados com
pregabalina), três poços com culturas de
células foram incubadas com o anticorpo,
num total de nove poços por grupo. Assim,
dez áreas representativas de cada poço
foram documentadas para quantificação da
densidade integrada de pixels. A média
aritmética foi calculada para cada poço e,
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
6. 26
através da análise desses valores, foram
realizadas as comparações entre os grupos.
O controle negativo da reação foi realizado
omitindo-seaetapadoanticorpoprimário.
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS
RESULTADOS
Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão. A análise de eventuais
diferenças intergrupos foi realizada
inicialmente pela ANOVA de uma via,
seguido pelo pós-teste Bonferroni para
comparação intergrupos. Para a análise
estatística, foi considerada uma
significânciamínimadep<0,05.
RESULTADOS
IMUNORREATIVIDADE PARA
SINAPSINA
A imunorreatividade da proteína
sinapsina, em células Neuro2A tratadas e
não tratadas com pregabalina está
demonstrada na Figura 1. Na Figura 1A-C
destaca-se a marcação para o grupo de
células controle, onde podemos observar o
crescimento normal das células Neuro2A.
Na figura 1 D-F, podemos observar o grupo
de células submetidas ao tratamento com
meio condicionado contendo linfócitos T
encefalitogênicos, sem tratamento com
pregabalina. Esse grupo, em particular,
apresentou redução da imunorreatividade
anti-sinapsina, em relação ao grupo controle
(Controle, 23.424 ± 2.603; Controle + meio
condicionado,14.789±1.656,p<0,01).
Quando analisamos o grupo de células
tratadas com meio condicionado sem
pregabalina, podemos observar que houve
redução significativa da expressão de
sinapsina, em relação ao grupo controle.
Adicionalmente, nota-se manutenção da
expressão de sinapsina em relação ao grupo
controle + meio condicionado, sendo
significativa no grupo 30 µg/ml (Controle +
meio condicionado, 14789 ± 1656; Meio
condicionado + 30 µg/ml, 20848 ± 1862,
p<0.05).
Nos demais grupos, 150 µg/ml e 300
µg/ml, podemos observar tendência de
aumento na expressão de sinapsina em
relação ao grupo meio condicionado +
pregabalina, porém sem significância
(Controle + meio condicionado, 14789 ±
1656; Meio condicionado + 150 µg/ml,
20233 ± 891, p>0.05 e Controle + meio
condicionado, 14789 ± 1656; Meio
condicionado + 300 µg/ml, 17173 ± 1179,
p>0.05).
E F E I T O S I N V I T R O D O
TRATAMENTO DA PREGABALINA EM
CÉLULAS NEURO2A TRATADAS COM
MEIO CONDICIONADO
Após realizarmos o tratamento com
meio condicionado nas células Neuro2A,
pudemos observar que as mesmas
apresentaram uma taxa de proliferação
menor (47%), em relação às células que
foram mantidas somente com meio de
crescimento (Controle, 143.7 ± 7.50;
Controle + meio condicionado, 73.8 ± 4.05,
p<0.001, Figura 2). Após serem tratadas
com meio condicionado, nas doses de 30
µg/ml, 150 µg/ml e300 µg/ml durante 24
horas, pudemos observar um aumento
significativo do número de células em
relação ao grupo tratado com meio
condicionado – 56%, 49% e 52%,
respectivamente – (Controle + meio
condicionado, 73.8 ± 4.05; Meio
condicionado + 30 µg/ml, 168 ± 8.44,
p<0.001: Controle + meio condicionado,
73.8 ± 4.05; Meio condicionado + 150
µg/ml, 154.4± 4.40, p<0.001: Controle +
meio condicionado, 73.8 ± 4.05; Meio
condicionado + 300 µg/ml, 151 ± 3.50,
p<0.001).
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
7. Figura 2: Análise quantitativa do número da
sobrevivência celular após tratamento com meio
condicionadoepregabalina.
SINAPSINAControle+meioControle30µg/ml150µg/ml300µg/ml
27
DISCUSSÃO
A esclerose múltipla é caracterizada
p o r i n f l a m a ç ã o f o c a l , a g u d a ,
desmielinizante, com perda axonal e com
limitada remielinização, culminando em
placas escleróticas multifocais 1-5. Vários
estudos estão voltados para a compreensão
dos mecanismos que envolvem o SNC e o
sistema imunológico em modelos murinos e
em culturas celulares. Neste estudo foram
utilizadas células Neuro2A para se avaliar
morfologicamente as alterações e a
neuroproteçãopromovidapelapregabalina.
Ao ser utilizado meio condicionado
contendo linfócitos T encefalitogênicos, foi
promovido às células Neuro2A, um
microambiente semelhante ao do SNC de
camundongos induzidos à EAE. Isso nos
proporcionou um estudo morfológico da
consequência do tratamento do meio
condicionado nas células Neuro2A e,
também, dos efeitos protetores da
pregabalina após as células serem expostas
ao meio condicionado por linfócitos T
encefalitogênicos, os quais possuem
características imunológicas para produzir
processos inflamatórios no SNC e,
consequentemente degeneração e morte
Pregabalina protege neurônios da ação pró-inflamatória de linfócitos T encefalitogênicos. - Gustavo Ferreira Simões e cols.
Figura 1: Imunomarcação anti-sinapsina. Figuras A e B,
mostrando imunomarcação para sinapsina e DAPI,
respectivamente, no grupo controle; Figura C, mostrando
a sobreposição sinapsina + DAPI; Figuras D e E,
mostrando imunomarcação para sinapsina e DAPI,
respectivamente, no grupo controle + meio condicionado;
Figura F, mostrando a sobreposição sinapsina + DAPI;
Figuras G e H, mostrando imunomarcação para sinapsina
e DAPI, respectivamente, no grupo 30 µg/ml de
pregabalina; Figura I, mostrando a sobreposição
sinapsina + DAPI; Figuras J e K, mostrando
imunomarcação para sinapsina e DAPI, respectivamente,
no grupo controle 150 µg/ml; Figura L, mostrando a
sobreposição sinapsina + DAPI; Figuras M e N,
mostrando imunomarcação para sinapsina e DAPI,
respectivamente, no grupo controle 300 µg/ml; Figura O,
mostrando a sobreposição sinapsina + DAPI. Figura P,
análise quantitativa da densidade integrada de pixels.
Escala=50μm.
Perspectivas Médicas, 25(3): 21-30, set./dez. 2014. DOI: 10.6006/perspectmed.20140303.0265557174
8. 28
celular10-14.
Nossos resultados mostram que as
células Neuro2A, tratadas somente com
meio condicionado, apresentaram uma
redução do número total de células, 24 horas
após início do tratamento. Acreditamos que
o meio condicionado, contendo linfócitos T
encefalitogênicos, atuou sobre as células
n e u r o n a i s p r o m o v e n d o e f e i t o s
i n f l a m a t ó r i o s , c i t o t ó x i c o s e ,
consequentemente, morte celular. Isso ficou
evidenciado quando analisamos a
imunorreatividade para sinapsina em células
tratadas somente com o meio condicionado
onde observamos redução de 37% na rede
sináptica, evidenciada pela redução de
imunomarcaçãoanti-sinapsina.
Quando utilizamos a pregabalina, nos
grupos tratados com meio condicionado,
observamos neuroproteção. Isso ficou
evidenciado quando quantificamos o
número total de células após tratamento com
pregabalina, onde ocorreu aumento
significativo em relação ao grupo controle +
meiocondicionado.
Tendo-se em vista suas propriedades
neuroprotetoras, podemos inferir que a
pregabalina atua positivamente, após
exposição de agentes pró-inflamatórios
provenientes da exacerbação da EAE, em
células neuronais. Uma possibilidade para
esta resposta está no fato da redução do
influxo de cálcio, que promove redução da
liberação de glutamato25. Este, quando em
excesso, promove neurodegeneração e,
consequentemente morte celular. Também
podemos propor que, ao atuar na modulação
sobre a transmissão sináptica excitatória, a
pregabalina promoveu às células Neuro2A,
um ambiente favorável para seu
crescimento.Portanto,apregabalina
Em conjunto, concluímos que
pregabalina é um fármaco com potenciais
efeitos neuroprotetores durante o curso da
EAE e que estudos mais detalhados
envolvendo mecanismos moleculares
devem ser elaborados, para melhor
compreensão da atuação desse fármaco nos
processos imunomoduladores. Através de
futuros estudos a pregabalina pode ser tornar
um em potencial fármaco neuroprotetor para
portadores de esclerose múltipla,
amenizando os sintomas da doença e
promovendo uma melhor qualidade de vida
paraessas pessoas.
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