O documento descreve uma análise bioinformática de elementos reguladores de fator de transcrição (TFREs) no promotor do citomegalovírus (CMV) em células HEK293. Foram identificados 80 possíveis reguladores de transcrição e vários TFREs constituintes do promotor CMV. Testes funcionais in vitro mostraram que a atividade do promotor CMV é regulada por interações entre os TFREs e o repertório de fatores de transcrição expressos nas células HEK293.

1. Abstrato
genes recombinantes em células HEK293
Engenharia do promotor CMV para expressão controlada de
3Syngensys Ltd., Sheffield, Reino Unido
Este é um artigo de acesso aberto sob os termos da Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações, que permite o uso e distribuição em qualquer
Engenharia Biológica, Universidade de Sheffield,
www.biotechnology-journal.com
Biotecnologia. J. 2022;17:2200062. https://
doi.org/10.1002/biot.202200062
David C. James, Departamento de Química e
Biologics, Cambridge, Reino Unido
PALAVRAS-CHAVE
Engenharia, Universidade de Sheffield, Sheffield,
1Departamento de Química e Biológica
E-mail: dcjames@sheffield.ac.uk
1 de 11
Mappin St., Sheffield S1 3JD, Reino Unido.
Recebido: 31 de janeiro de 2022 Revisado: 7 de abril de 2022 Aceito: 23 de abril de 2022
2Desenvolvimento de Linha Celular, REGENXBIO Inc.,
Reino Unido
© 2022 Os Autores. Jornal de Biotecnologia publicado pela Wiley-VCH GmbH.
Correspondência
Endereço atual: Yusuf B. Johari, Lonza
meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado, o uso não seja comercial e não sejam feitas modificações ou adaptações.
Rockville, Maryland, EUA
DOI: 10.1002/biot.202200062
Promotor de CMV, células HEK293, fator de transcrição, regulação transcricional, gene transitório
expressão
TPM, transcrições por milhão; ORF, quadro de leitura aberto; RNA-Seq, sequenciamento de RNA de última geração; TF, fator de transcrição; TFRE, elemento regulador do fator de transcrição; TGE, gene transitório
expressão; TSS, local de início da transcrição.
Abreviaturas: AAV, vírus adeno-associado; CHO, ovário de hamster chinês; CMV, citomegalovírus; CRM, módulos cis-regulatórios; GFP, proteína fluorescente verde; HEK, rim embrionário humano;
Yusuf B. Johari1 Joseph M. Scarrott1
Ayda Mayer2 Adam J. Brown1,3 David C. James1,3
Thilo H. Pohle1 Ping Liu2
Promotores derivados de CMV podem ser projetados para exibir transcrição até 50% maior
TFREs discretos ou variantes de exclusão de CMV identificamos os principais componentes de TFRE e grupos
de TFREs (módulos reguladores cis) dentro da sequência de CMV. Nossos dados revelam que
incluindo AhR:ARNT, CREB, E4F, Sp1, ZBED1, JunB, c-Rel e NF-ÿB. Também identificamos elementos
ativadores upstream dependentes de Sp1 críticos perto do início da transcrição
ção de proteínas recombinantes e vetores virais. Esses sistemas frequentemente empregam
A atividade do CMV nas células HEK293 é uma função dos promotores de vários TFREs constituintes
A expressão de genes recombinantes em células HEK293 é frequentemente utilizada para a produção
desconhecido e, consequentemente, não há estratégias para projetar o CMV para controle
mRNAs do fator de ção dentro do transcriptoma HEK293 revelaram 80 possíveis reguladores
elementos reguladores de fator (TFREs) dentro da sequência e transcrição do CMV humano
a base mecanicista da ativação transcricional mediada por CMV em células HEK293 é
que mediam a transrepressão. Nosso estudo mostra pela primeira vez que o novo e compacto
promotor de citomegalovírus (CMV) para conduzir a transcrição de genes recombinantes. No entanto,
expressão de genes recombinantes. Extensas análises bioinformáticas de transcrição
sítio que foram necessários para transcrição eficiente e sítios de ligação YY1 e RBP-Jÿ
ARTIGO DE PESQUISA
comparado ao homólogo do tipo selvagem.
interações. Através de testes funcionais in vitro usando construções repórter que abrigam
eficiência operacional (atividade por unidade de sequência de DNA) ou aumento de 14% na atividade total com
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2. 2 de 11 JOHARI ET AL.
2.1 Culturas de células HEK e CHO
2. MATERIAIS E MÉTODOS
1. INTRODUÇÃO
2.2 Construção vetorial
Regiões discretas da sequência do promotor de CMV foram amplificadas por PCR e
inseridas a montante do promotor central de CMV. Profissional mutante
motor e íntron quimérico de pmaxGFP foram deletados por digestão com
A linha celular de rim embrionário humano 293 (HEK293) é a linha celular humana mais
comumente utilizada para a fabricação de proteínas terapêuticas e vetores virais. A
linhagem celular serve como um hospedeiro de expressão adequado
células (Thermo Fisher Scientific) foram cultivadas em Expi293 Expression
Células HEK293 intratáveis.
criar plasmídeos repórter TFRE, oligonucleotídeos sintéticos contendo
construtos motores foram sintetizados e inseridos a montante do CMV
sistemas de produção baseados em HEK293, a transcrição de genes recombinantes é
tura e transfecção permitem a expressão gênica transiente (TGE) meth
quadro de leitura aberto (ORF) do promotor menos o backbone de vetor. UMA
células por mL. A viabilidade celular e a densidade celular viável foram medidas usando
O promotor CMV pode ser reprojetado especificamente para células HEK293 para
de clonagem EcoRI e HindIII. Um promotor hCMV-IE completo
desenvolvimento de células e processos foram realizados para melhorar
O promotor CMV é fundamentalmente sub-ótimo para uso em processos específicos
não naturais, como a expressão do gene recombinante em células HEK293.
fiado usando um kit QIAGEN Plasmid Plus (Qiagen). A sequência de todos os plas
in vivo[18,19] e in vitro[20,21 ]. Com relação a este último, temos
e aprimorado. A engenharia de processos sintéticos fundamentais em fábricas de
células de mamífero, como HEK293, permanece, portanto, um objetivo altamente
desejável.
motor. Realizamos uma extensa análise de bioinformática no pro
O vetor pmaxGFP (Lonza) foi utilizado como uma espinha dorsal. O profissional CMV
e cultivadas em meio Dynamis (Thermo Fisher Scientific) suplementado com L-glutamina
(Thermo Fisher Scientific). Expi293F
células HEK293. Demonstramos, pela primeira vez, que o tipo selvagem
inserido nos locais de clonagem a montante do promotor central de CMV.
e inserido diretamente a montante da proteína verde fluorescente (GFP)
Como
com atividade transcricional aumentada.
conduzem a transcrição do gene recombinante, e a falta dessa informação mecanística
atualmente torna a otimização da TGE orientada por CMV em
para estabelecer infecção latente.[16,22–24 ] Assim, é provável que o
combinação específica de interações entre TFREs constituintes do promotor e o
repertório de células de TFs endógenos.[ 17 ]
fatores de transcrição (TFs).[14 ] Isso não é surpreendente, considerando que
e Bak.[7] Esforços adicionais para aumentar os níveis de TGE são exemplificados por
meio de estratégias de engenharia de processo, implementando hipotermia leve[8,9 ]
bem como a adição de indutores químicos, como ácido valpróico[6,10]
diretamente a montante da ORF GFP. Plasmídeos derivados de clonagem foram puri
expressão específica e dependente do tipo de célula foi observada tanto
compreensão de como a atividade transcricional do CMV pode ser controlada e foram subcultivados a cada 3 a 4 dias por semeadura em 3 × 105 viáveis
produção de vírus adeno-associado (AAV).[2] Além disso, o cultivo celular fácil
em células HEK293 através da dissecção mecanicista do CMV pro
Plasmídeo GFP (Addgene) por digestão com KpnI e AgeI e inserido
Por isso, a atividade de transcrição do promotor de CMV é altamente contextual
(hCMV-IE) , [6,8–10,12,13] embora haja pouco mecanismo
candidatos e expressão de genes virais tóxicos.[ 3,4 ]
Apesar disso, nenhum estudo anterior examinou as interações específicas do promotor
de CMV dentro da paisagem transcricional HEK293 que
depois digerido, extraído em gel (kit QIAquick Gel Extraction; Qiagen) e
As células HEK293 adaptadas à suspensão foram fornecidas pela REGENXBIO
expressão para identificar elementos funcionais (sequências TFRE e módulos
reguladores cis [CRMs]) que controlam criticamente a atividade do promotor em
é um elemento altamente complexo que compreende sítios de ligação (elementos
reguladores de fator de transcrição [TFREs]) para numerosos ubiquamente expressos
TGE em células HEK293. Exemplos incluem otimização de métodos de transfecção,[5]
e co-expressão dos genes que codificam os reguladores do ciclo celular p18 e p21[6] ou
knock-out dos genes pró-apoptóticos Bax
sequenciamento (Eurofins Genomics).
também sintetizado e inserido diretamente a montante da ORF GFP. Para
modificações, [1] e possui genes E1 integrados necessários para
repressores como YY1 — conferindo ao citomegalovírus a capacidade
suplementado com L-glutamina 8 mM. As células foram mantidas em frascos Erlen
meyer (Corning) a 37ÿC, 140 rpm sob 5% de CO2, 85% de umidade
No entanto, a atividade do promotor em qualquer hospedeiro é regulada por um sistema
promotor central mínimo de CMV (ÿ36 a +48 em relação ao TSS) foi
mais frequentemente dirigido pelo citomegalovírus humano imediato
ods sejam efetivamente empregados para a produção rápida de drogas potenciais
para proteínas com necessidade particular de pós-tradução humana
promotor do núcleo. O promotor CBh foi excisado de pSpCas9(BB)-2A
7 × cópias repetidas das sequências de TFRE na Tabela S1 foram sintetizadas,
amplificadas por PCR (Q5 de alta fidelidade 2 × master mix; NEB) e purificadas (kit
QIAquick PCR Purification; Qiagen). Os produtos de PCR foram
e butirato de sódio.[11 ] Apesar dessas melhorias, no centro da
o promotor evoluiu para funcionar em um amplo tropismo celular.[15,16 ]
composição de TFRE de moter, juntamente com uma análise comparativa in vitro
detalhada da influência relativa das partes componentes do CMV no gene
Neste estudo, identificamos os reguladores da TGE mediada por CMV
mid foi confirmado por análise de enzimas de restrição e DNA
promotor hCMV-IE (doravante referido como o promotor CMV)
(ÿ550 a +48 em relação ao TSS) foi sintetizado (Eurofins Genomics)
derivar novos promotores altamente compactos e transcricionalmente eficientes
um Vi-CELL XR (Beckman Coulter).
por exemplo, demonstrou que TGE induzida por CMV em células de ovário de hamster
chinês (CHO) era em grande parte uma função de transativação mediada por apenas
dois TFREs discretos (NF-ÿB e CREB).[22 ] Além disso,
o promotor CMV compreende sítios de ligação de vários
BsrGI e KpnI e substituídos por um pequeno fragmento de DNA contêm
meio (Thermo Fisher Scientific). Células CHO-S (Thermo Fisher Scientific) foram
cultivadas em meio CD CHO (Thermo Fisher Scientific)
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3. 3 de 11
JOHARI ET AL.
As células HEK293 foram semeadas em 1 × 106 células viáveis por mL e cultivadas
com mais de duas transcrições por milhão (TPM) pode ser considerado
potenciais TFREs. Observamos que dois TFREs podem ter características idênticas ou superiores
Reagente e armazenado a –80ÿC. Bibliotecas de RNA-seq foram preparadas e
turar todos os sítios de ligação possíveis de diferentes subtipos de TF dentro do pro
o local de ligação de TF específico foi removido e que nenhum TFRE de sobreposição de
ping foi perturbado nem um novo TFRE foi introduzido.
(DPBS; Sigma) e depois transferido para uma microplaca de 96 poços a 3 × 105
em células HEK293 (fase exponencial log2 TPM < 1; Figura 1A). Além disso, como
queríamos identificar os principais elementos regulatórios, focamos nossa
levantamento bioinformático de (i) TFREs putativos (locais de ligação) no pro
de NaCl (150 mM; Polyplus-transfecção), combinado e incubado a
frasco, crescido até 1 × 106 células por mL e alíquotas de 10 mL foram adicionadas
leitor (Molecular Devices) 48 h pós-transfecção. Antes da leitura de fluorescência (excitação:
485 nm, emissão: 535 nm), o meio de cultura foi
74 famílias TF foram identificadas no promotor CMV em números de cópias
TFREs com sítios de ligação substancialmente sobrepostos e dois selecionados
(usegalaxy.org) e software R foram usados para analisar os dados de RNA-seq
foi realizado pela mutação de pelo menos um dos quatro altamente conservados
células transfectadas com um vetor sem promotor.
Software Genomatix Gene Regulation (MatInspector Versão 8.4 e
fornece informações úteis sobre o perfil geral de expressão de TF onde os genes
os pellets foram imediatamente ressuspensos em 300 ÿL de RNAprotect Cell
foram ressuspensos em 750 ÿL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco
de transativação de genes recombinantes em células HEK293, realizamos
PEI MAX (1 mg mL-1; Polysciences) foram pré-diluídos em 150 ÿL
variando de um a seis. No entanto, a análise de expressão gênica indicou que 22% (24/108)
dos TFs cognatos dos TFREs não foram expressos
mostra o mapa de TFREs selecionados no promotor CMV. Para medir o
Para minimizar o pool de TFRE para testes funcionais, filtramos
matriz (totalizando 116; Tabela S2) foi obtida de
obtido de Lambert et al.[26] (ver Tabela S3).
amostras compreendendo células HEK293 e Expi293F, a análise foi realizada usando
ANOVA de dois fatores com replicação com valor de p < 0,05
cate culturas durante exponencial (ÿ5 × 106 células por mL) e estacionária
que não foram expressos na última fase da cultura - rendendo 80
L-1 arginina e 20 g L-1 de serina. O RNA total foi extraído de dupli
sequenciado por GENEWIZ usando um Illumina NovaSeq (Illumina). Galáxia
Científico). A fluorescência/absorvância de fundo foi determinada em
Um dia antes da transfecção, as células foram subcultivadas em um Erlenmeyer
A expressão de GFP foi quantificada usando uma microplaca SpectraMax iD5
sis não permite a quantificação precisa dos níveis de TF ativos,
conjuntos de dados. Com relação a este último, embora a análise da expressão gênica
pode se estender além do tipo de célula), eliminando assim quatro TFs adicionais
85% de umidade.
analisado usando o Citômetro de Focagem Acústica Attune (Thermo Fisher
meio contendo 130 g L-1 de glicose, 29,23 g L-1 L-glutamina, 25 g
estudos listados no MatBase. Mutação seletiva de um TFRE específico
TFREs de cada família TF — gerando um subconjunto de 25 TFREs. Figura 1B
(em vez de Famílias Matrix), com o Core Similarity definido como 0,80 e
células viáveis foram coletadas por centrifugação a 200 × g por 5 min. Célula
de www.ensembl.org. Um banco de dados com curadoria de ~1600 TFs humanos foi
O teste t de Student com valor de p < 0,05 foi considerado significativo. Por
analisar o promotor CMV para encontrar TFREs humanos putativos. Para limitar
foi submetido à mesma análise usando o software para garantir que
A Tabela S2 lista os TFREs identificados e seus TFs cognatos.
entre os meios (expressão de GFP) de duas construções de promotor. Por
a Matrix Similarity definida como 'Otimizada'. TF cognato de cada TFRE
moter, e (ii) o repertório TF de células HEK293 com base em RNA-seq
pesquisar em TFs que exibem atividades de expressão gênica em ambas as fases
exponencial e estacionária da cultura (ou seja, expressão “específica do contexto”
temperatura ambiente por 4 min antes de ser adicionado à cultura. As células transfectadas
foram cultivadas por 48 h a 37ÿC, 230 rpm sob 5% de CO2,
células (150 ÿL) por poço. Para medir a eficiência de transfecção, as células foram
como descrito acima. A partir do dia 3, as células foram alimentadas diariamente (1% v/v) com ração
foi considerado significativo.
moter, a análise foi realizada usando a função Matriz Individual
fases (~1,6 × 107 células por mL) de crescimento. Para cada amostra, 3 × 106
amostras compreendendo apenas células HEK293, a análise foi realizada usando
MatBase Versão 11.2; Precigen Bioinformática Alemanha) foi usado
a cada tubo do biorreator TubeSpin (TPP). 8 ÿg de DNA e 24 ÿL de
removido por centrifugação a 200 × g durante 5 min. 1,5 × 106 células viáveis
A fim de identificar potenciais elementos regulatórios em CMV capazes
nucleotídeos (sequência central) definidos em MatBase. Sequência mutante
ativo.[27 ] Usando a ferramenta de pesquisa Genomatix, 108 TFREs discretos de
sequências de lapidação dentro do promotor de CMV (por exemplo, NF-ÿB e NFAT5).
O Microsoft Excel 2016 (Microsoft) foi usado para analisar a diferença
usando a ferramenta de alinhamento de salmão e arquivos humanos GRCh38 GTF e FASTA
2,5
expressão
reguladores da atividade de transcrição do promotor de CMV
Transfecção transitória mediada por PEI
elementos regulatórios
Análise in silico do fator de transcrição
2.6
Análise estatística
3. RESULTADOS
2.7
em vitro
Identificação in silico e in vitro de
2.3
Análise do fator de transcrição HEK293
2.4 Medição da expressão de GFP recombinante
3.1
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4. 4 de 11 JOHARI ET AL.
Figura 3A). A Figura 3B mostra a produção de repórter GFP transiente de
proporcional aos níveis de expressão de TF cognatos). Deduzimos, portanto,
expressão significativamente aumentada (> 10 vezes, p < 0,01) sobre a expressão basal
respectivamente), em linha com nosso estudo anterior que identificou esses
um promotor central mínimo de CMV (–36 a +48 em relação ao TSS, contendo uma
caixa TATA e um motivo Inr) conforme descrito anteriormente.[25,28 ]
ÿ 94% com uma viabilidade celular de ÿ 90% em 48 h pós-transfecção (mea
Além disso, os TFREs geralmente ocorrem juntos em clusters como reguladores cis.
identificados no promotor CMV foram posteriormente analisados para a
mecanismos de ativação transcricional mediada por TF ou subótimo
em relação ao local de início da transcrição; TSS) foi pesquisado para o
podem ser resolvidos utilizando sua sequência de consenso (por exemplo, CREB e
composição indicou que todos os reguladores positivos identificados no
para mediar a ativação da transcrição do gene recombinante em HEK293
expressão gênica em células HEK293, inserimos sete CRMs de 150 pb
nível (transcrições por milhão; TPM) de cada TF amostrado em exponencial
observado em células CHO (observamos que as atividades relativas de TFRE não foram
CREB foram altamente ativos em células CHO (133% e 62% de CMV ativo
mid é mostrado na Figura 2A. Esta análise revelou oito TFREs com sig
upstream do núcleo CMV em vetores repórter GFP (CRMs 1-7;
Em seu contexto natural, o promotor CMV pode ser dividido em dois componentes
modulares, os intensificadores proximais e distais (Figura 3A).[14 ]
usando o software Genomatix. Cento e oito TFREs discretos
aumento significativo da GFP acima do nível de controle central, sugerindo alternativas
O DNA em suspensão de células HEK293 rendeu uma eficiência de transfecção de
produzindo 67% da atividade transcricional do CMV. Análise do TFRE
gama mais ampla de TFREs.
genes transcritos. (B) Sequência do promotor CMV com 25 selecionados
paisagem transcricional de células HEK293 que influenciam a TGE mediada por CMV,
testamos as sequências NF-ÿB e CREB em células CHO,
experimentos preliminares confirmaram que a intensidade de fluorescência GFP em
Para identificar as regiões da sequência de DNA que são necessárias para regular
promotor (Figura 2A), indicando que os TFREs foram essencialmente capazes
reguladores da atividade do promotor de CMV. Promotor CMV (–550 a +48
instâncias, sequências de TFRE com sítios de ligação concorrentes (sobrepostos)
nível de expressão gênica relativa de TFs. Os pontos representam a expressão
parceiros TFRE adjacentes ou próximos para impulsionar a transcrição.[30 ]
(A) A análise de RNA-seq do transcriptoma da célula HEK293 determinou o
exibiu entre 10 e 53 vezes um aumento na expressão sobre o núcleo
expressão. Transfecção transitória de plasmídeo mediada por PEI otimizada
é muitas vezes insuficiente para conduzir níveis detectáveis de gene recombinante
do que NF-ÿB em células HEK293, a atividade foi apenas um quinto daquela
promotor (Tabela S1). Esta análise (Figura 2B) indicou que NF-ÿB e
transfecção transitória de células HEK293 com cada plasma repórter TFRE
transcrições por milhão (log2 TPM > 1) foi considerado como ativo
A fim de confirmar e demonstrar ainda mais a distinção
em células HEK293, criamos um conjunto de construções repórter GFP que continha
sete cópias repetidas de um TFRE específico em série, a montante de
CREB/E4F, Sp1, ZBED1, JunB, c-Rel e NF-ÿB. Notamos que em alguns
geralmente mais ativos do que os distais, com CRM 1 sozinho
FIGURA 1 Identificação in silico de potenciais transcricionais
ao contrário de CHO, foi uma função de interações cooperativas entre um
módulos (CRMs) onde alguns elementos podem exigir interações com
presença de seus fatores de transcrição cognatos (TFs) em células HEK293.
Sequências de ligação de TF. Para elucidar este último, testamos a sequência de
consenso de MYBL1, Oct e E2F (selecionada com base no conhecimento posterior).
Esta análise revelou que as sequências de consenso
ção do promotor de núcleo mínimo, ou seja, AhR:ARNT, CREB/ATF1,
segurado usando um vetor que abriga um promotor de CMV). Além disso, pré
Notamos que a saída de transcrição de um único sítio de ligação de TF
bem como a sequência da subunidade p65 do NF-ÿB que não está presente no CMV
O hospedeiro da célula HEK293 é diretamente proporcional aos níveis de mRNA de
GFP após a transfecção (Figura S1).[29 ] Medição da expressão de GFP após
TFREs para análise in vitro. O TSS é indicado com uma seta
e fases estacionárias da cultura. Genes com mais de dois
capacidade relativa de TFREs para ativar a transcrição de genes recombinantes
presença de elementos reguladores do fator de transcrição putativo (TFREs)
E4F; Figura 2A). Outras construções de repórter TFRE não exibiram obvi
cada CRM. CRMs de dentro da sequência de intensificador proximal foram
que a regulação específica da célula HEK293 da atividade do promotor de CMV, em con
dois elementos como reguladores positivos chave da atividade promotora de CMV
específica da célula CHO.[22 ] Enquanto a subunidade p65 do NF-ÿB foi cinco vezes mais ativa
células usando a atividade de TF disponível.
3.2 Expressão gênica mediada pelo promotor de CMV em
As células HEK são reguladas por elementos proximais
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5. JOHARI ET AL. 5 de 11
FIGURA 3 Atividade de transcrição relativa exibida por elementos estruturais do promotor de CMV. (A) O promotor CMV contém os intensificadores proximais e distais e
grupos de TFREs (módulos reguladores cis; CRMs). Cada elemento foi clonado a montante de um promotor de núcleo mínimo de CMV em plasmídeos repórter GFP
enquanto o promotor CBh (793 pb) foi inserido diretamente a montante do quadro de leitura aberta GFP. (B) Os plasmídeos repórter foram transfectados em células HEK293
usando PEI e cultivados em biorreatores tubulares a 37ÿC. A expressão de GFP foi quantificada 48 h após a transfecção. Os dados são expressos como uma porcentagem
em relação à expressão de GFP de um vetor contendo o promotor CMV. Os dados mostrados são o valor médio ± SD de dois experimentos independentes, cada um
realizado em duplicata
estavam em sua maioria inativos na tela funcional.
Por outro lado, CRMs do meio do promotor CMV (ou seja, CRMs
tela funcional (Figura 2A) ocorreu no CRM 1, com uma cópia cada
4 e 5) não apresentou atividade observável (ÿ 7% de CMV). Isso foi
de AhR:ARNT, CREB/ATF1, CREB/EF4, ZBED1, JunB, c-Rel e NF-ÿB
nada inesperado, considerando que os TFREs constituintes desses CRMs
FIGURA 2 Identificação dos elementos reguladores do fator de transcrição ativo (TFREs). (A) A sequência TFRE derivada do promotor CMV (barras pretas) ou sua
sequência consenso (barras cinzas) foi clonada em série (7 × cópias) a montante de um promotor central mínimo de CMV em vetores repórter GFP. As células HEK293
foram transfectadas com cada TFRE-repórter homotípico usando polietilenoimina (PEI) e cultivadas em biorreatores de tubo giratório a 37ÿC. A expressão de GFP foi
quantificada 48 h após a transfecção. (B) A sequência de consenso de NF-ÿB p65 foi clonada em série (7 × cópias) a montante de um promotor central mínimo de CMV em
vetores repórter GFP e transfectada em células HEK293 e CHO-S ao lado de construtos NF-ÿB e CREB/E4F de A As células foram cultivadas em biorreatores tube-spin a
37ÿC e a expressão de GFP foi quantificada 48 h após a transfecção. Os dados são expressos como uma porcentagem em relação à expressão de GFP de um vetor
contendo o promotor CMV. Os dados mostrados são o valor médio ± SD de dois experimentos independentes, cada um realizado em duplicata
e duas cópias do Sp1. Além disso, várias cópias de CREB/E4F e Sp1
estiveram presentes nos CRMs 6 e 7, gerando de 32% a 42% da atividade da CMV.
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6. 6 de 11 JOHARI ET AL.
linha, cultivada em meio Dynamis e meio Expi293 Expression
potenciador enquanto o Gfi1 (um sítio de ligação) está localizado na região proximal
hipótese.
similaridade 0,734, limite ideal da matriz 0,76) sugerindo que o
para o nível mais baixo, ou seja, ~ 25% em comparação com o tipo selvagem proximal
por outros elementos). Mutação seletiva foi realizada no núcleo
potenciador imal funcionou sinergicamente para conduzir a transcrição, e (ii)
na região 3' do CRM 1. Em relação ao primeiro, a aparente
células fibroblásticas.[34 ] Nós levantamos a hipótese de que o promotor CMV poderia ser
otimizado para TGE interrompendo a transrepressão mediada por esses TFREs.
Nossos dados (Figura 4B) também mostram que a remoção de NF-ÿB e ZBED1
TFREs específicos dentro do potenciador proximal. Para expor essa observação,
sobreposição (Figura 3A), sugerindo que TFREs adicionais dentro do
atividade fraca do promotor homotípico Sp1 na Figura 2A, nossos dados não
A fim de determinar especificamente os principais reguladores de mediados por CMV
Regulação do promotor CMV. Para avaliar isso, determinamos
totalmente antecipado para o ZBED1 relativamente ativo. Utilizando o TFRE
expressão gênica em células HEK293, criamos variantes do promotor de CMV
as células foram medidas 48 h após a transfecção.
Intensificador de CMV/promotor híbrido de ÿ-actina de galinha (CBh) (Figura 3A).[32 ]
suportam alta atividade de transcrição sozinho. Deduzimos, portanto, que
removida simultaneamente (mutações 3+5) a expressão de GFP foi reduzida
elementos de sequência (Figura 1) também identificaram dois componentes TFRE
Os promotores de CMV são mostrados na Figura 4B. Observamos que as atividades
promotoras relativas foram muito semelhantes em ambas as linhagens celulares, invalidando nossa
tificou um sítio de ligação ZBED1 fraco na sequência mutada (matriz
sítios de ligação) e RBP-Jÿ (um sítio de ligação) estão localizados na região distal
reguladores essenciais de TGE mediada por CMV em HEK293 foram localizados
observações feitas acima, inferimos que (i) TFREs dentro do prox
porando os sítios de ligação NFATc1, NF1 e LEF1. Mesmo que esses
rins, YY1 e RBP-Jÿ, [23] bem como Gfi1, onde sua superexpressão demonstrou reprimir a
atividade do promotor hCMV-IE em camundongos.
linha de células HEK293, bem como a célula Expi293F disponível comercialmente
cialmente variam em seus repertórios de TF que podem influenciar significativamente
a função reguladora vital do Sp1. No entanto, considerando a relativa
que já demonstraram regular negativamente a transcrição
promotor apresentou um aumento de 15% na atividade (p = 0,007; Figura 3B),
CMV proximal do tipo selvagem, respectivamente. Além disso, a remoção do Sp1
A montagem de CRMs e a comparação de suas atividades relativas forneceram uma
análise mais aprofundada das funções individuais de CRM (Figura 3B). Combinando CRM
1 e CRM 7 (67% e 42% da atividade CMV, respectivamente)
promotores com elementos repressores nocauteados e inseridos
limiar de matriz 0,94). Níveis de expressão de GFP em HEK293 e Expi293F
que o NF-ÿB teve uma atividade muito mínima em células HEK293, mas não foi
Para comprovar isso, construímos um vetor repórter utilizando um
(CRM 1+4; p = 0,005). Esses dados implicam uma interação sinérgica de spe
exibiu atividade 64% menor do que o CRM 1, apesar de uma sequência significativa
–90 a –42 em relação ao TSS).
em vetores repórter GFP (Figura 5A,B). Notamos que o YY1 (três
na região 3' da sequência intensificadora proximal (ou seja, aproximadamente
TGE mediada por CMV em células HEK293, sintetizamos CMV (derivado)
expressão. Este resultado está de acordo com a descoberta acima (Figura 2A)
descartou a possibilidade de um efeito específico de transrepressão do CRM 2.
uma sequência de ligação fraca neste estudo (semelhança de matriz 0,889, ótimo
do promotor CMV-IE murino em camundongo infectado por citomegalovírus
a atividade dos construtos sintéticos de CMV proximais em nosso padrão
diminuição das atividades do promotor. Criticamente, quando os dois sítios Sp1 foram
A análise in silico acima da regulação da atividade do promotor de CMV por
respectivamente. Medição da produção de GFP após a transfecção transitória de células
HEK293 e Expi293F com o nocaute proximal
TSS respectivamente).[31 ] Criticamente, os dados na Figura 3B revelam que o CRM 2
As sequências de TFRE não estavam ativas por conta própria (Figura 2A) a extensão estendida
do CRM 1, exibiu apenas 41% da atividade da CMV. Combinando tudo
transcrição mediada por promotor em células HEK293.
atividade) em vez do promotor CMV completo foi utilizado para o impacto máximo de um
único knock-out TFRE (ou seja, "ruído" potencial mínimo
CRM 1 melhorou significativamente a atividade de transcrição para 86% de CMV
diferentes hospedeiros HEK293 (em diferentes formulações de meio) podem potencializar
Os sítios de ligação de CREB/ATF1 e Sp4 reduziram individualmente a atividade do
promotor para ÿ 62%, ÿ 74% e ÿ 44% (p < 0,008) daquela derivada de
Sp4 foi mutado em conjunto com os dois sítios Sp1 - indicativo de
reguladores críticos da atividade do promotor de CMV em HEK293 foram localizados
Avaliar a atividade funcional desses TFREs como reguladores de
sítios de ligação, individualmente ou simultaneamente, não reduziram a GFP
aumento na atividade GFP do CRM 1+2 em comparação com o CRM 1 (veja acima)
efeitos iniciais. Por outro lado, adicionar CRM 4 inativo (7% CMV)
potenciador. Além disso, estudos anteriores sugeriram um quarto sítio de ligação YY1 em
-343 a -353 em relação ao TSS[14] que foi identificado como
possivelmente via interação NFATc1–c-Rel (–117 e –57 em relação ao
local com CREB/ATF1 ou Sp4 (mutações 3+4 e 3+6) levou a
produziu um promotor com apenas 90% de atividade de CMV (CRM 1+7), sugerindo uma
função parcialmente redundante do intensificador distal e/ou spa
sequência de um TFRE específico para romper o sítio de ligação sem perturbar a
sobreposição ou a introdução de novos TFREs (Figura 4A). Pelagem
O promotor, que compreende um intensificador de CMV praticamente completo além
os dois sítios Sp1 atuam como um elemento ativador a montante[33 ] para CMV
construímos um vetor de repórter CRM 1 estendido (CRM 1+2) incor
A região 5' de CRM 2 funcionou para regular negativamente a transcrição, ou
não suporta a conclusão de que os blocos Sp1 (ou qualquer outro TFRE) poderiam
com TFREs específicos dentro de –107 a –45 em relação ao TSS ''nocauteado''. CMV
proximal (–300 a +48 em relação ao TSS, ÿ 84% CMV
então, dada a complexidade do promotor CMV, nós hipotetizamos que a diferença
A mutação ZBED1 não eliminou totalmente o TFRE. Remoção de Sp1,
CMV. Nenhuma redução adicional na atividade do promotor foi observada quando o
ferramenta de identificação com um rigor mais baixo, a análise in silico iden
3.4 A eliminação de elementos repressores resulta em
3.3 Sítios de ligação Sp1 perto da caixa TATA são
expressão em células HEK293
expressão gênica aumentada em variantes do promotor de CMV
essencial para o gene mediado pelo promotor de CMV eficiente
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7. JOHARI ET AL. 7 de 11
nas condições empregadas. Isto é possivelmente devido ao TF positivo-
TFREs constituintes). Com base nas observações acima, construímos
O promotor CMV pode ser projetado para TGE aprimorado em HEK293 através da
interrupção da transrepressão mediada por YY1 e RBP-Jÿ e remoção de
enquanto nenhuma mudança significativa foi observada com a remoção adicional de Gfi1
em comparação com o controle do tipo selvagem (p > 0,603), sugerindo que
região 3' do potenciador efetivamente removeu a transrepressão mediada por
CMV (ver Figura S2). Neste construto promotor, a remoção de YY1 e
FIGURA 4 Um promotor CMV proximal desprovido de dois locais Sp1 perto da caixa TATA é incapaz de conduzir a transcrição em células HEK293. (A) Tipo selvagem
Para confirmar a capacidade de YY1 e RBP-Jÿ para mediar transrepres
A grande maioria dos atuais sistemas TGE de células HEK293 utilizam o CMV
a região 5' do potenciador (promotor 2.01) que resultou em um ÿ
(observamos que a remoção da ligação YY1 sozinha aumentou o pro
Remoção dos elementos repressores em CMV de comprimento total (promoção
sequências promotoras mais curtas exibiram atividades semelhantes para promover
aumento na expressão (p = 0,005; Figura S2), sendo 25% menor em
(log2 TPM = 2,23) enquanto os genes YY1 e RBP-Jÿ exibiram níveis de expressão
acima do percentil 90 (log2 TPM = 5,51 e 5,53 respectivamente; Figura 1A).
potenciadores contendo apenas um sítio de cada YY1, RBP- Jÿ e Gfi1
dos sítios de ligação YY1 e RBP-Jÿ aumentaram a atividade do promotor
introdução de novos TFREs. (B) A atividade relativa de cada construto promotor de CMV proximal foi determinada em células HEK293 e Expi293F.
Interações TFRE dentro do potenciador proximal diminuindo a gripe
promotor 4.01 que foi desprovido de elementos repressores, mantendo
h pós-transfecção. Os dados são expressos como uma porcentagem em relação à expressão de GFP de um vetor contendo o promotor CMV de comprimento total.
observado com a remoção adicional de Gfi1 (promotor 2.03) - isso não foi
vetores de expressão lentivirais e AAV melhorados .[13,35,36] Nossa comparação
o quarto motivo repressor YY1 (excluído em nossa pesquisa in silico de CMV
Os sítios de ligação RBP-Jÿ aumentaram a atividade do promotor em 12% (promotor
ção da transcrição do gene recombinante em células HEK293,
(WT) e promotores de CMV proximais mutados (–300 a +48 em relação ao TSS) com TFREs específicos nocauteados (KO) foram sintetizados e clonados
os TFREs não foram reguladores críticos que afetam a atividade transcricional
promotor para a produção de proteínas terapêuticas de alto rendimento[6,8 ] e
análises de expressão transitória ativa revelaram que o promotor de CMV
ers 1,01 e 1,02; Figura 5C) não resultou em aumento da expressão GFP
s 2.01–2.03. A este respeito, assumimos que a deleção de distal
13% de redução na atividade de transcrição em comparação com o tipo selvagem
sequências redundantes.
maior atividade em ÿ 7% [p = 0,053]; dados não mostrados). Além disso, esses
Os dados mostrados são o valor médio ± SD de dois experimentos independentes, cada um realizado em duplicata
as regiões ativas. Este promotor CMV projetado exibiu cerca de 14%
tamanho em comparação com o CMV de tipo selvagem. Para ilustrar a capacidade
aprimorada dos promotores na condução da transcrição, calculamos uma “eficiência
transcricional” para cada promotor em função da saída transcricional por comprimento
do promotor. Esta análise indica que os promotores 3.03 e 4.01 foram ~ 50% mais
eficientes em termos de transcrição em comparação com o promotor CMV de tipo
selvagem (Tabela S4). Concluímos que o
idade em 11% (p = 0,031) em comparação com sua contraparte não mutada
ência de processos mediados por potenciadores distais (ver acima, Figura 3A,B).
Os plasmídeos repórter foram transfectados em células HEK293 usando PEI e cultivados em biorreatores de tubo giratório a 37ÿC. A expressão de GFP foi quantificada 48
Para investigar ainda mais o impacto do potenciador proximal, truncamos
totalmente inesperado, considerando que o gene Gfi1 foi pouco expresso
(promotores 3.01–3.03; veja CRM 1+7 acima). Como previsto, a remoção
2,02; p = 0,023), indicando que os TFREs podem atuar como reguladores negativos do
promotor CMV em células HEK293. Nenhum aumento adicional foi
variantes do promotor CMV estruturado com mínimo proximal e distal
em vetores repórter GFP. A mutação seletiva foi realizada em um TFRE específico para interromper o sítio de ligação sem perturbar a sobreposição ou
4. DISCUSSÃO
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8. 8 de 11 JOHARI ET AL.
atividade nas células HEK293 foi uma função de vários fatores do promotor.
caracterizados simultaneamente por meio do uso in vitro de métodos de triagem de alelos
de alto rendimento, permitindo a determinação de sua afinidade de ligação ideal. O grande
desafio com tais testes funcionais é a dificuldade em identificar TFREs que sustentam a
regulação mais complexa
a arquitetura do promotor CMV, eliminando a necessidade de caracterizar
com efeito, gerou uma nova biblioteca de sequências promotoras (Figura 2)
formam a base da engenharia de promotores contendo ligações aprimoradas
transcrição eficiente do promotor de CMV e replicação de citomegalovírus
FIGURA 5 A remoção da transrepressão mediada por YY1 e RBP-Jÿ e sequências redundantes aumenta a atividade de CMV. (A) Mutação seletiva
promotores de núcleo sintético indicaram que os sítios de ligação Sp1, quando colocados
que a família Sp1 é predominante no promotor, de acordo com a noção
promotores podem ser utilizados em vetores multigênicos para dar previsibilidade
Expressão de GFP de um vetor contendo o promotor CMV de tipo selvagem. Os dados mostrados são o valor médio ± SD de dois experimentos independentes cada
razão de cadeia leve),[39 ] especialmente com sequências não sobrepostas para
de ilhas CpG.[40 ] É importante ressaltar que nossos resultados mostram que cada uma das
qual Sp1 se liga às suas sequências cognatas a montante da caixa TATA
Vetores de repórter GFP. As localizações dos elementos repressores no promotor CMV estão sublinhadas. Os números denotam o TFRE correspondente
TFREs substituintes incluindo AhR:ARNT, CREB, E4F, Sp1, ZBED1, JunB, c
governando a transativação sinérgica[30,31 ] que exigiria
construto promotor foi determinado em células HEK293 e Expi293F. Os plasmídeos repórter foram transfectados em células HEK293 usando PEI e cultivados
sempre, essa limitação pode ser contornada usando a tecnologia TF decoy desenvolvida
neste laboratório[38 ] para inibir TFRE(s) específico(s) dentro de
sítios,[37 ] ou podem ser utilizados diretamente como blocos de construção modulares para
construir promotores sintéticos de novo.[25,28] Identificamos ainda várias sequências de
ligação de TF sub-ótimas (MYBL1, Oct, E2F) que sugerem uma imensa oportunidade de
maximizar a produção transcricional do promotor CMV. Centenas de variantes de sequências
de motivos TFRE podem ser
em células de fibroblastos humanos.[41 ] Mecanismo de ativação de transcrição semelhante
para controlar a expressão gênica em uma ampla faixa. Estes altamente compactos
foi realizado em um TFRE específico para interromper o sítio de ligação sem perturbar a sobreposição ou a introdução de novos TFREs. (B) CMV de tipo selvagem (WT)
realizado em duplicata
evitar o silenciamento mediado por recombinação homóloga (veja abaixo).
dois sítios de ligação Spl próximos à caixa TATA contribuem para a ativação completa do
promotor CMV em células HEK293 — assemelhando-se ao relato anterior em que a mutação
desses sítios de ligação Sp1 causou inef
efeitos espaciais entre dois pares de motivos TFRE. Além disso, este trabalho,
estequiometrias (por exemplo, otimização da cadeia pesada do anticorpo monoclonal
em biorreatores tubulares a 37ÿC. A expressão de GFP foi quantificada 48 h após a transfecção. Os dados são expressos como uma porcentagem em relação ao
que o elemento é essencial para a prevenção da metilação de novo
aumentou a atividade da RNA polimerase II.[42,43] De fato, análises de
knock-out em A. Um quarto sítio de ligação YYI putativo excluído pela análise de TFRE neste estudo é mostrado entre colchetes. (C) A atividade relativa de cada
Rel e NF-ÿB. Esta é uma descoberta muito significativa e útil, pois
Análise bioinformática na sequência do promotor de CMV indicada
nismo foi relatado para o promotor do vírus símio 40 (SV40) em
cate telas de pares de motivos TFRE com função sensível à posição. Quão
promotores (-550 a +48 em relação ao TSS) e variantes mutantes de CMV com TFREs específicos nocauteados (KO) foram sintetizados e clonados em
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9. JOHARI ET AL. 9 de 11
nível nacional (por exemplo, engenharia de elementos 5'UTR) que geralmente não é
dependente do tipo de célula.[45 ]
Os autores têm um pedido de patente depositado com base no trabalho neste
vantagens adicionais em condições de bioprocessos dinâmicos em resposta a
Também é interessante notar que nossa análise bioinformática indicou que
abordagens podem ser usadas para desconstruir e reconstruir outras
e a transrepressão mediada por RBP-Jÿ do promotor de CMV pode ser
Joseph M. Scarrott https://orcid.org/0000-0002-6046-7687
upstream de uma caixa Inr e/ou TATA, atuou como um elemento ativador upstream para
uma iniciação de transcrição eficiente in vitro[33 ] e em células HEK293.[44 ] No entanto,
nossos estudos anteriores[22,25,38] bem como dados em A Figura 2B mostrou que as
células CHO foram
capazes de conduzir a transcrição de genes recombinantes eficiente na ausência de tal
ativador a montante
a análise da expressão gênica nos dados transcriptômicos HEK293 mostrou
no potenciador distal como mencionado acima. Promotores 3.03 e 4.01
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Outro resultado importante deste estudo é a identificação de
para equipar as células HEK293 com novas opções de maquinaria de transcrição
A sequência de CMV pode ser funcionalmente redundante para o gene recombinante
ORCID
regulação da atividade de transcrição recombinante e com
gestando que o impacto positivo do knock-out RBP-Jÿ seria mais
removeu indiretamente um desses elementos repetidos, evitando assim
A atividade motora deve ser específica do tipo de célula para máxima eficácia. Nós
AGRADECIMENTOS
papel.
um pré-requisito de design para a construção de produtos sintéticos/híbridos fortes
David C. James https://orcid.org/0000-0002-1697-151X
deleção do gene. Com relação a este último, pode ser possível reduzir
CONFLITO DE INTERESSES
Thilo H. Pohle https://orcid.org/0000-0003-4437-3231
que RBP-Jÿ foi (levemente) regulado positivamente da fase exponencial média para
estacionária inicial ( mudança de dobra log2 = 0,362, p-adj = 0,0012), sug
bilidade. Dinucleotídeos CpG mínimos também são uma característica desejável para
vetores de terapia gênica nos quais motivos CpG têm efeitos imunoestimuladores (por
exemplo, o promotor 3.03 contém 20% menos dinucleotídeos CpG em comparação com o
promotor CMV de tipo selvagem; Tabela S4).[48 ] Consequentemente, deve ser agora ser
possível projetar racionalmente variantes do promotor CMV sintético em
para funcionalidades ótimas em determinados tipos de células.
Por fim, os dados apresentados neste estudo podem oferecer benefícios para sistemas
além da TGE. Por exemplo, a expressão estável de longo prazo pode ser comprometida
pela ocorrência de características de sequência, como elementos repetidos (silenciamento
mediado por recombinação homóloga)[46 ] e ilhas CpG (silenciamento mediado por
metilação).[47 ] Com relação ao para mer, o promotor CMV contém duas cópias do motivo
repetido de 21 pb
TFREs com nenhuma/baixa atividade, minimizando assim a formação de
perfeitamente adequado para uma finalidade específica. Prevemos que semelhante
expressão em células HEK293. Especificamente, nossos resultados mostraram que YY1
Yusuf B. Johari https://orcid.org/0000-0001-9933-5764
mudanças na paisagem transcricional celular. Por exemplo, diferencial
o promotor CMV não continha os sítios de ligação dos TFs associados à resposta da
proteína desdobrada (ATF4, ATF6, eIF2ÿ e XBP1),
silenciamento epigenético mediado por metilação ligado à produção insta
TFs celulares de ação negativa, e que uma proporção substancial dos
motores para células HEK293. Isto está em contraste com a modulação no trans
Os dados que sustentam os achados deste estudo estão disponíveis no material
complementar deste artigo.
tamanho do promotor pequeno. Os promotores de engenharia podem ainda conferir
pronunciado em processos de produção em lotes alimentados de longo prazo, por exemplo.
o número de dinucleotídeos CpG dentro do promotor CMV por mutação
potenciais eventos de recombinação homóloga genética associados a
Este estudo foi apoiado por REGENXBIO Inc., EUA Os autores agradecem a Adrian Bourke
(Universidade de Sheffield) pela assistência técnica na análise de RNA-seq, Selase
Enuameh (REGENXBIO) e Jie Li (REGENXBIO) pelas discussões úteis.
conjecturar ainda que um elemento ativador a montante dependente de Spl é
removido projetando construções de CMV projetadas com sítios de ligação cognatos
inativos. Vale a pena notar que estudos anteriores também mostraram que ERF (Ets-2
Repressor Factor) foi capaz de reprimir o promotor de CMV ligando-se aos motivos repetidos
de 21 pb que se sobrepõem a YY1 e Sp1 dentro do intensificador distal (ver Figura S3),[24 ]
e que o gene ERF foi altamente expresso em células HEK293 (log2 TPM = 4,91; Tabela
S2). Portanto, postulamos que a deleção da região 3' do intensificador distal (promotores
3.03 e 4.01) removeu efetivamente o YY1
bem como um sítio de ligação ERF, permitindo uma definição mais definida e melhorada
sugerindo que a atividade do promotor do CMV não é afetada pelo estresse celular que
pode resultar da superexpressão do gene recombinante.
Adam J. Brown https://orcid.org/0000-0002-3290-4560
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INFORMAÇÕES DE APOIO
e2200062. https://doi.org/10.1002/biot.202200062
Informações adicionais de suporte podem ser encontradas online no Suporte
Como citar este artigo: Johari, YB, Scarrott, JM, Pohle, T.
Engenharia do promotor CMV para expressão controlada de
H., Liu, P., Mayer, A., Brown, AJ, & James, DC (2022).
seção de informações no final deste artigo.
genes recombinantes em células HEK293. Revista de Biotecnologia, 17,
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