Seleção de probiótico para acará bandeira

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA
JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS
SELEÇÃO DE PROBIÓTICO NA AQUICULTURA
ORNAMENTAL DO ACARÁ BANDEIRA (Pterophyllum
scalare LIECHTENSTEIN, 1823)
BRAGANÇA
2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA
BRAGANÇA
2014
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a
Faculdade de Engenharia de Pesca, da Universidade
Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel
em Engenharia de Pesca.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Martins Cordeiro
UFPA – Campus de Bragança
Co-Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fujimoto
EMBRAPA – Tabuleiros Costeiros

Trabalho julgado para a obtenção do grau de Bacharel em Engenheiro de Pesca do
Curso de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança.
DATA DE AVALIAÇÃO: 17 de Novembro de 2014
CONCEITO:
BANCA EXAMINADORA
Prof.ª. Drª. Cristiana Ramalho Maciel
IECOS/UFPA
Prof. Msc. Dioniso de Souza Sampaio
IECOS/UFPA
BRAGANÇA
2014

“O êxito do trabalho não se mede pelo caminho que
você conquistou, mas sim pelas dificuldades que
superou em percorre-lo”
Adaptado de Abraham Lincoln

Dedico este trabalho aos meus pais, Antônio
Lázaro Meireles Dias e Ângela Maria
Rodrigues Dias, pelo apoio, carinho e
credibilidade durante essa caminhada, assim
como aos meus irmãos Sileno Julho Rodrigues
Dias que sempre esteve presente em todos os
momentos de minha vida e ao meu irmão
Silvano Sandro Rodrigues Dias.

AGRADECIMENTOS
Por mais que eu não seja uma pessoa muito religiosa, acho que sou muito é do
considerado aos olhos de Deus, aquém agradeço incondicionalmente e peço para que
todas as manhãs ilumine meu caminho e conceda-me forças para nunca desistir dos
meus objetivos.
Ao Orientador Carlos Alberto Martins Cordeiro e Co-Orientador Rodrigo Yudi
Fujimoto por toda dedicação, amizade, disposição e confiança durante essa trajetória
que se concretiza na realização de um sonho.
Aos companheiros de Laboratório Bruna Palheta, Aline, Ryuller, Talita, Rudã
Mendes, Henrique Malta, Marcela Gabay, Fabrício Ramos, Micaelle, Josi, Laís e
Debora. Aos amigos que contribuíram para a realização deste trabalho Valéria Couto,
Natalino Sousa, Danielle e Arthur. Ao Laboratório de Genética Aplicada em especial a
Dr° Grazielle Gomes, ao mestrando Raimundo Evereste pela dedicação, apoio e análise
dos dados genéticos, assim como a minha grande amiga Ivana Menezes.
Agradeço incondicionalmente ao Programa de educação tutorial PETpesca, pelas
oportunidades vividas, portas que abrimos e conhecimentos impares adquiridos sobre as
tutorias do Dr° Rodrigo Fujimoto 2007/2011 e atual Drª Marileide Alves, que sempre
agiram com afinco para a continuação e êxito do programa, assim como aos petianos.
Ao Laboratório de Camarões Marinhos da UFSC, em especial ao Dr° José Luiz
Mouriño, a mestranda Sheila e pós Doutoranda Gabriela, em terem me acolhido e
contribuído com muita atenção e dedicação ao andamento do trabalho.
A todos os lugares que tive oportunidade de estagiar e conhecer um pouco mais
de perto e exercer com afinco as atribuições que cabem ao profissional de Engenharia
de Pesca, Gomes da Costa em especial a Keyti e ao Adão, ao Oceanário de Pernambuco
com o professor Ricardo, ao sr° Robert do Piauí, a Maria do Socorro da DNOCS Ceará,
ao Blachã de Tanguanika Ceará, a empresa Poytara, ao sr° Victor Uliana do Projeto
Arapaima em Belém, a AMASA ao Eng. De Alimentos Alessandro, ao Eng. De Pesca
José Geison da Secretaria de Pesca de Augusto Corrêa, dentre outros.
A minha excelentíssima turma de Engenharia de Pesca 2010 e a turma de técnico
em pesca 2009 do IFPA. E é claro destinar esse singelo espaço em agradecimento
aqueles que sempre me deram, apoio, raiva, felicidades, madrugadas em claro fazendo
trabalho, ajuda sempre que possível no laboratório, companheirismo, festas e cervejada,
a vocês meus Brothers Gerson Leandro, John Lennon e Diego Bazílio. Sem dúvidas

incondicionalmente grato pela benção que Deus me concedeu em colocá-los nesse
capítulo de minha vida.
Esse cantinho dedico, para ele, mais uma vez supracitado um parceirão que
somando ao parágrafo anterior têm extrema importância nessa caminhada, pela sua
parceria, amizade, sinceridade e fidelidade, de uma amizade indescritível, que além de
me conceder extremas alegrias de confraternização, tenho o seu apoio para análise de
dados, discussão para concretizados e perspectivos trabalhos, nem sempre sai uma
concordância 100%, mas é isso ai quem manda ser inteligente, papo cabeça. Caramba!
Como a vida nos surpreendeu nessa jornada, quanto à pedra no caminho, retirar? Não,
lapidar. E o tempo esta nos dando essa revira volta e como foi difícil sermos julgados
pelos nossos acertos e apedrejados pelos erros alheios hum... hum... Concluindo é o
cara, meu amigão de faculdade e com certeza de trabalho, é dele mesmo que estou
falando Higo Abe o famoso INHA.
Agradeço também com muito carinho, respeito e admiração às pessoas com
quem eu tive a oportunidade de conviver em alguns metros quadrados e adotado a
denominação de “família”. Agradeço sem sombras de dúvidas a minha amigona,
Tamyres Barbosa (Tatah), uma “menina” extremamente iluminada, dedicada e amorosa,
praticamente a irmãzinha que tive durante a graduação, assim como agradeço ao Breno
Silva (Gordinho), esse sim fez história em Bragança e deixou muitas saudades, meu
irmãozinho, como estou feliz por você também está concretizando o seu sonho, desejo a
você e toda a sua família muita paz, amor, sucesso e alegrias, você sabe que cada um
tem um apelidinho especial e carinhoso que os batizei, mas não cabe para esse momento
citar (risos), te amo irmãozão. Luciene (Luluh), Matheuzinho (Crazy Life) e ao meu
amigo Bruno Brito (missão).
Agradeço as amizades de Bragança, aos meus grandes amigos Wyller Mello,
Wallacy Mello e Allana Seixas, praticamente oito anos de amizade, vocês estão
concretizados em minha história.
Aos meus pais Antônio Lázaro e Ângela Maria por todo amor, carinho,
paciência, dedicação, credibilidade e apoio que sempre me deram, para a consolidação
de meus objetivos, nem sempre concordando, mas apoiando as minhas tomadas de
decisões. Ao meu grande irmãozão Sileno Dias e Silvano Dias, minhas princesas
Clarina e Bia, minhas cunhadas Luciana e Rosa. E por fim a minha querida prima
Andrea Dias, a quem tenho grande amor, companheirismo e amizade e a toda aminha
família.

SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA.........................................................................................................1
1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL.........................................................................1
1.2 ACARÁ BANDEIRA Pterophyllum scalare...........................................................2
1.3 PROBIÓTICO NA AQUICULTURA......................................................................4
1.4 Enterococcus faecium...............................................................................................8
1.5 BACTERIOSE NA AQUICULTURA.....................................................................9
1.6 SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS in vitro................................................................10
2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................13
CAPÍTULO II
3 RESUMO...................................................................................................................27
3.1 ABSTRACT............................................................................................................28
4 INTRODUÇÃO.........................................................................................................29
5 OBJETIVO................................................................................................................32
5.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................32
5.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.......................................................................................32
6 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................33
6.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL
PROBÓTICO.................................................................................................................33
6.2 IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE...........................................................................34
6.3 SELEÇÃO in vitro...................................................................................................35
6.4 INIBIÇÃO DE PATÓGENOS................................................................................36
6.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO...........................................................................36
6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................37
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................38
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO III
9 CONCLUSÃO...........................................................................................................70
9.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................70

1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL
A produção de espécies com potencial ornamental vem se destacando no
mercado aquícola mundial, sendo a modalidade apontada com crescimento de 14%
desde meados da década de 90, contribuindo com valores monetários de
aproximadamente US$ 200 milhões em comercialização, sendo 60% deste capital
oriunda da economia de países em desenvolvimento (FAO, 2007). Com o progresso da
atividade, diversos países vêm apontando grandes investimentos na cadeia produtiva
comercial das espécies, destacando os Estados Unidos, Japão, União Europeia e
Cingapura como os principais países consumidores nesta área (LIMA, 2003; PANNÉ,
2008; CARDOSO & IGARASHI, 2009).
Os países asiáticos como principais produtores, enfatizando Cingapura com
produção de US$ 68,00 milhões em 2006 (AVA, 2007). Este comércio desenvolvem
significativas tendências que intensificam o seu sistema de produção, relacionando a
variabilidade das espécies, elevadas taxas de retorno e remuneração de capital, melhor
utilização de espaço e instalações, podendo ser implantado positivamente em centros
urbanos, e atingir elevados valores de produtividade (PRANG, 2007).
Na América do Sul os principais produtores no mercado ornamental são
Colômbia, Peru e Brasil, sendo o território brasileiro de grande reconhecimento pelo seu
potencial geográfico, hídrico e climático, que é favorável à produção de diversas
espécies com potenciais a aquicultura, além de possuir grande diversidade em sua
ictiofauna ornamental. O potencial produtivo aquícola nacional apontam para
progressivos avanços no setor, com á Regiões Norte (12,1%), Nordeste (2,1%), Sudeste
(13,2%), Sul (6,1%) e Centro-Oeste (1,3%), destacando como principais espécies
produzidas, as nativas da Bacia Amazônica (IBAMA, 2008; PANNÉ, 2008; TORRES
et al., 2008).
No entanto, é a pesca extrativista amazônica que vêm contribuindo com dois a
três milhões de dólares para a economia nacional, com taxa média de crescimento de
28,8% anualmente nas exportações dentre os anos de 2002 a 2005 e US$ 3,9 milhões,
em 2007, comercializando aproximadamente 6,7 milhões destes organismos,
destacando-se o Pará e Amazonas, (PANNÉ, 2008; TORRES et al., 2008). Destes
estados, o Pará, no ano de 2005, atingiu o ranking nacional de segundo maior produtor
de peixes ornamentais, oriundos do Rio Xingu e Rio Tapajós (TORRES et al., 2008).

O comércio ornamental, principalmente às espécies nativas, encontra-se em
intensa expansão a nível internacional, decorrentes da grande variabilidade dentre os
gêneros e exuberância dessa espécie (PRANG, 2007). Entretanto o Brasil apresenta-se
emergente na competitividade dos mercados externos, sendo de suma importância o
apoio à atividade e incentivos em tecnologias de reprodução, nutrição, manejo, genética
e sanidade que preservem os estoques selvagens e aprimorem as tecnologias de
produção, visando estabelecer uma atividade social, produtiva, econômica e sustentável
(SALES & JANSEM, 2003; GODINHO, 2007).
1.2 ACARÁ BANDEIRA Pterophyllum scalare
A espécie pertence à família Cichlidae apresenta características fenotípicas
como; corpo triangular, perfil afilado, nadadeiras dorsal e anal longas e eretas,
nadadeira pélvica fina e comprida e linha lateral interrompida (DIAS & CHELLAPA,
2003; LIMA, 2003). O acará bandeira, Pterophyllum scalare (LIECHTENSTEIN,
1823), é uma espécie endêmica da bacia Amazônica, com ampla distribuição,
encontrado nas águas continentais do Peru, Colômbia, Guianas e Brasil. Habita
ecótonos dulcícolas e lênticos de águas ácidas e de baixa dureza, podendo atingir 15 cm
de comprimento. Na natureza são comumente encontrados em cardumes com
estabelecimento de hierarquias nas proximidades de troncos, raízes e vegetação
submersa, servindo de abrigo e proteção contra predadores. Se alimentam de pequenos
crustáceos, larvas de mosquito e vegetais, considerando-se uma espécie de hábito
alimentar onívoro-carnívora (CACHO et al., 1999; FUJIMOTO et al., 2006;
RODRIGUES & FERNANDES, 2006).
A maturidade sexual da espécie supracitada é alcançada entre oito a doze meses
de idade, apontando para uma elevada complexidade em seu comportamento por
competição territorial, coorte, acasalamento e cuidado parental, sendo a atuação do
macho de grande importância no cuidado da prole contra predadores, além de adotarem
como característica reprodutiva a monogamia serial. O dimorfismo sexual da espécie é
pouco acentuado, possuindo o macho uma maior protuberância na região cefálica e a
fêmea uma acentuada papila urogenital, que facilita a deposição dos óvulos. Sua
reprodução ocorre quando o casal progenitor assepsia o substrato de desova com a boca,
seguido da fêmea que pode expelir de 20 a 500 óvulos, que são fecundados
posteriormente pelo macho, ficando a prole sobre o cuidado parental do casal dentre

duas a três semanas, até o consumo do saco vitelínico e natação das larvas (DIAS &
CHELLAPA, 2003; CACHO et al., 2007; BALDISSEROTTO & GOMES, 2010).
As variedades de acará bandeira como: koi, marmorato, leopardo, ouro, preto,
fumaça e palhaço, produzidas em sistemas de confinamento, são linhagens
geneticamente modificadas para fins ornamentais desenvolvidas por produtores da
Europa, Estados Unidos e Ásia a partir de matrizes selvagens da região amazônica. Com
isso, apresentam valores monetários de comercialização de até dez vezes mais elevados,
quando comparados aos exemplares naturais (RIBEIRO et al., 2009; VIDAL JÚNIOR,
2005; HULATA, 2001). O tamanho mínimo de comercialização do organismo é de 2,5
cm de comprimento padrão, entretanto indivíduos de 4-6 cm, são mais atrativos para o
comércio, consequente de seu período de engorda que varia entre três a quatro meses
para alcançarem o tamanho adulto, apontando para valores monetários variáveis de
acordo com o tamanho do corpo e nadadeiras (VIDAL JÚNIOR, 2005).
Pesquisas realizadas com o ornamental utilizando dietas peletizadas ou
extrusadas melhoraram o desempenho e P. scalare quando comparados a alimentos
farelados RODRIGUES & FERNANDES (2006) e RIBEIRO et al. (2007), avaliaram as
exigências proteicas do ornamental, encontrando resultados próximos a 32% de proteína
bruta. RIBEIRO et al. (2007), ao analisarem o fornecimento de dietas isoenergéticas
com 26 a 32% de PB e ZUANON et al. (2006) com níveis de proteína de 34-46% de PB
na dieta de juvenis do acará bandeira, concluíram que 32 e 34% de PB, respectivamente,
e 3.200 kcal de ED/kg de ração, atendem as necessidades nutricionais da espécie
(RIBEIRO et al., 2007). Comparando os sistemas de criação da espécie em mono e
policultivo com camarão-da-amazônia (Macrobrachium amazonicum, HELLER 1862),
obteve-se melhores resultados zootécnicos, quando comparados em sistema de criação
em aquários (VASQUEZ, 2008). Avaliando as exigências nutricionais de P. scalare,
com dois níveis de arraçoamento e duas refeições ao dia concluiu que, o arraçoamento
com 6% do peso vivo do animal, proporciona-o melhores resultados.
O ornamental amazônico P. scalare, é uma das espécies mais criadas e
comercializadas em âmbito nacional e internacional, justificada pela à sua fácil
adaptação às condições de confinamento, boa expressão monetária de mercado, fácil
reprodução em cativeiro e boa aceitabilidade as rações industrializadas. Apesar de
grandes perdas de produção pouca tecnologia é desenvolvida para a profilaxia e
tratamento de doenças ictiológicas, sendo a falta de informação técnica responsável pela
intensificação da prática errônea de tratamentos quimioterápicos e antibióticos, que

além de não solucionar as enfermidades, causam degradação ao meio ambiente,
resistência dos patógenos e intoxicação da espécie produzida, sendo de grande
importância a profilaxia e o uso de tecnologias que sessem a presença de
microrganismos que comprometam a sanidade da espécie (FUJIMOTO et al., 2006;
DIAS, 2004; CARROLA et al., 2009).
1.3 PROBIÓTICO NA AQUICULTURA
A definição utilizada para se classificar um probiótico na aquicultura segue os
estudos de GASTESOUPE (1999), que resume o termo como micro-organismo vivo
que ao se inserir no sistema de criação coloniza a microbiota intestinal do hospedeiro,
beneficiando a sua saúde e equilíbrio homeostático. Além de contribuir para o
crescimento e melhorar a resposta imunológica dos organismos produzidos, aponta para
benefícios na qualidade das variáveis da água, na decomposição da matéria orgânica,
inibe a propagação de bactérias patógenas no meio de criação, incluindo também os
conceitos de biorremediação e biocontrole (MAEDA et al., 1997; GATESOUPE, 1999;
KESARCODI-WATSON et al., 2008).
A produção de alimentos funcionais cresce a taxas de 14% anualmente, valores
que se acentuam comparados à produção de alimentos convencionais, que registram
índices dentre 3% a 4% na produção mundial. A comercialização deste mercado a nível
nacional aponta para 1% da produção total alimentícia no Brasil, sendo os probióticos
com aproximadamente 65% deste total. Sendo essa tecnologia quando aplicada na
cadeia produtiva das espécies aquícolas é uma ferramenta eficaz e não invasiva, que
corrobora na restauração da flora natural do intestino de seu hospedeiro (ROLFE, 2000;
GRANATO et al., 2010)
Tecnologias que aprimorem o uso de probióticos na produção de organismos
aquáticos crescem progressivamente com a exigente demanda empresarial, na busca de
técnicas mais saudáveis no escalonamento produtivo da aquicultura (RAMIREZ et al.,
2013). Os probióticos são suplementos alimentares não digeríveis, que além de atuarem
positivamente no alimento suplementado, surtem efeitos benéficos ao seu hospedeiro.
Quando inseridos são capazes de suportar as condições adversas fisiológicas do
hospedeiro, como: resistir à acidez estomacal, colonizar o intestino e resistir às
condições naturais e antrópicas do sistema de criação (GIBSON, 1999; LEE et al.,
1999).

Uma diversidade de micro-organismos pode ser utilizada como organismos
probióticos, sendo o principal grupo estudado os das bactérias ácidas lácticas, (RINGO
& GASOUPE, 1998; RINGO et al., 2003). Estas são bactérias Gram positivas,
caracterizadas por possuírem morfologia de bacilos e cocos, não esporuladas, inertes,
anaeróbicas obrigatórias ou aerotolerantes e produtoras de ácido láctico como
fundamental carboidrato durante o processo de fermentação (MELLO et al., 2013).
Essas bactérias apresentam características de grande interesse à aplicação na criação
animal como: fácil multiplicação e resposta imune não específica do hospedeiro,
pertencente à microbiota endógena das espécies aquáticas em produção (RINGO et al.,
2003; SALINAS et al., 2006; GATESOUPE, 2008; SOUZA et al., 2010).
O potencial das bactérias lácticas utilizadas como probióticos, referem-se a sua
resistência no trato gastrointestinal, desempenharem características terapêuticas,
profiláticas e promotoras de crescimento, além de apresentarem um caráter seguro, não
havendo o risco de causar enfermidades, modular a resposta imunológica do hospedeiro,
apropriadas características organolépticas, pertencer a microbiota natural do intestino do
animal, desempenhar efeito antagônico às bactérias patogênicas, na adesão das células
epiteliais do intestino, desta forma produzindo defensinas e muco, que inibem o
crescimento patogênico na superfície da mucosa intestinal, tolerar a ação dos ácidos
graxos e da bile, transmudar a lactose em ácido láctico, reduzindo o pH do trato
gastrointestinal, produzir substâncias antimicrobianas (bacteriocinase e peróxido de
hidrogênio) (OUWEHAND et al., 2002; SENOK et al., 2005; SALINAS et al., 2006;
BALCÁZAR et al, 2008; SOUZA et al., 2010; GATESOUPE, 2008; LEBEER et al.,
2010).
Inibindo desta forma o crescimento bacteriano patogênico pela adesão aos sítios
superficiais do epitélio intestinal, competição por nutrientes, de fácil manejo as
condições de armazenamento, ser resistente ao processamento de rações industriais, ser
agente modulador as respostas imunológicas e contribuir no processo fagocitário da
ração, proporcionando assim maior ganho de peso e resistência ao animal (FULLER,
1989; VINE et al., 2006; SUGITA et al., 2007; BALCÁZAR et al., 2008; REGITANO
& LEAL, 2010; QINGHUI AI et al., 2011; FARIAS, 2012).
A aplicação de bactérias probióticas na nutrição animal pode contribuir
economicamente a cadeia produtiva piscícola, proporcionando menor conversão
alimentar e melhores aproveitamentos de nutrientes e aminoácidos fornecidos na ração,
tendo em vista que a proteína é de suma importância para o crescimento do organismo,

porém esse composto acaba sendo o mais caro e nem tanto aproveitado, desse modo à
indução de micro-organismos que facilitem a fagocitose de absorção e digestibilidade
da proteína, é fundamental à redução dos custos de produção (LIU et al., 2009;
GASTESOUPE, 2008).
As espécies utilizadas para produção de probióticos na criação de camarão
(GARRIQUES & AREVALO, 1995; MORIARTY, 1997) e peixes (SUZER et al.,
2008), estão catalogadas como: Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L.
crispatus, L. delbruechii, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnssonii, L. paracasei, L.
plantarum, L reuteri, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. lactis, L. salivarius,
Bifidobacterium adolescentes, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B.
longum, Lactococcus lactis, Leuconstoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici,
Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium,
Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus toyoi, Propionibacterium freudenreichii,
Saccharomyces cerevisiae e S. boulardii (GASTESOUPE, 2008; HOLZAPFEL, 2001).
As bactérias presentes na microbiota intestinal de organismos com
potencialidade à aquicultura são apresentadas em seu maior volume por micro-
organismos gram positivo, catalase negativa, não esporulados, morfologia bacilos ou
cocos e produção de ácido láctico na fermentação dos carboidratos. A maior gama de
gêneros catalogados na literatura com potencial probiótico se destacam os
Lactobacillos, Leuconostoc, Pediococcus e Wisella (VINE et al., 2006; MOURIÑO,
2012).
Os estudos de probióticos na piscicultura ornamental vêm crescendo e
apontando para resultados científicos significativos nos índices zootécnicos,
imunológicos e redução na conversão alimentar, quando comparados a animais nutridos
com ração basal utilizando a espécies Xiphophorus helleri Heckel, 1848 (Peixe Espada),
assim como para as espécies de Poecilia reticulata Peters, 1859 (Guppy), Poecilia
shenops Valenciennes, 1846 (Molinésia Negra) e Xiphophorus maculatus Gunther,
1866 (Plati) (GHOSH et al., 2007).
A redução das bactérias que apresentam patogenicidade ao hospedeiro, podem
ser inibidas com a modificação da microbiota gastrointestinal do animal, fornecendo a
este suplementação alimentar e/ou exposição de bactérias probióticas no sistema de
criação (GOMEZ-GIL et al., 2000; RINGO et al., 2003; RAMIREZ et al., 2006;
VASEEHARAN, 2007; WANG, 2007; TSENG, 2009). Trabalhos comprovam a
modificação da microbiota intestinal com o fornecimento de bactérias probióticas como

suplemento alimentar ou na água de criação (GULLIAN, 2004; VENKAT et al., 2004;
DIAS et al., 2007; JATOBÁ et al., 2008; RENGPIPAT et al., 2008; DIAS et al., 2011).
A fauna microbiológica do trato intestinal da espécie em produção, pode ser
apontado como um recurso natural e seguro, no esforço em inibir a proliferação dos
agentes patogênicos nas pisciculturas (VAHJEN, et al., 2009). Essa estratégia está
relacionada à tecnologia na suplementação das rações funcionais com probióticos, cuja
técnica é desenvolvida visando reduzir a colonização bacteriana patogênica, dos animais
confinados em empreendimentos aquícolas. Apontando como alternativa a adoção dos
antibióticos nos sistemas de criação, cujos atuam no balanço microbiótico intestinal,
reduzindo desta forma os micro-organismos benéficos ao hospedeiro (GOMEZ-GIL et
al., 2000). Além dos probióticos apontarem como potencialidade a ausência na
produção de toxinas e resíduos, que gerem resistência ou contaminação ao bioma de
produção (MOURIÑO et al., 2012).
O perfil na fermentação da glicose, a velocidade de crescimento em distintas
temperaturas, a configuração na produção de ácido láctico, a habilidade de crescimento
em soluções salinas, assim como sua tolerância frente à acidez ou alcalinidade,
classificam as bactérias ácido lácticas em distintos gêneros (VAHJEN, et al., 2009).
Como pode ser visto na criação de peixes já existem comprovações que a
utilização de probióticos na alimentação dos animais pode melhorar a resistência
imunológica e contribuir para o seu bom desempenho (KUMAR et al., 2008; NAYAK,
2010). Compostos antimicrobianos com potencial probiótico, apontam para êxito no
combate a patogenicidade por bactérias, Li et al., (2006) ao utilizarem o probiótico
Arthrobacter XE-7, inibiu o crescimento de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
anguillarum e Vibrio nereis.
Os probióticos além de beneficiarem o desempenho do animal em produção,
podem agir de forma positiva na qualidade da água, sendo as bactérias com esse
potencial, gram positivas, que em sistemas aquícolas podem atuar na conversão da
matéria orgânica em CO2 de forma mais eficaz, assim como minimizar o excesso de
carbono orgânico dissolvido no sistema de produção (DALMIN, 2001). No entanto o
uso dos probióticos na piscicultura ornamental, apesar de emergente, ainda são escassos
exigindo do meio técnico científico maiores estudos afim de contribuir na viabilidade
desta tecnologia na saúde animal e fornecer melhorias de viabilidade econômica,
otimizando as respostas ambientais e comerciais da cadeia produtiva aquícola.

1.4 Enterococcus faecium
A espécie Enterococcus faecium é classificada como uma bactéria ácido láctica,
Gram positiva, com distribuição oblíqua, não virulenta e não resiste a ação de
antibióticos relevantes, garantindo a sua segurança quando ingerida. Micro-organismo
esse encontrado na fauna microbiológica intestinal de humanos e animais, assim
também como no solo, água e alimentos fermentados (PIMENTEL, 2007;
BYAPPANAHALLI, 2012), com fundamental importância na suplementação de
alimentos, produzindo bacteriocinas que inibem a ocorrência de agentes patogênicos no
hospedeiro e conferem as características organolépticas do produto suplementado,
sobrevivência ao processo de estocagem e colonização gastrointestinal nas espécies
produzidas (BHARDWAJ et al., 2008; PIMENTEL, 2012).
Entre a caracterização das bactérias ácida láctica, os gêneros Lactobacillus (L.
reuteri, L. johnsonii, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. casei, L.
rhamnosus, L. salivarius, L. fermentum e L. plantarum,) e Bifidobacterium (B.
thermophilum, B. bifidum, , B. lactis, B. longum e B. breve) são mais relatadas, porém
trabalhos avaliando o potencial probiótico de outras classes de micro-organimos menos
explorados, constatam o uso probiótico na resposta profilática, terapêutica e de
desempenho em animais, como as espécies da variação Lactococcus lactis, Leuconstoc
mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus
thermophilus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, utilizadas com fins
probióticos na produção animal e de compostos lácticos (JIN et al., 2000; SANDERS e
KLAENHAMMER, 2001; POLLMAN et al., 2005).
A inclusão de Enterococcus faecium na ração animal corrobora na redução da
gordura visceral, a partir de estímulos da ativação no sistema enzimático hepático do
hospedeiro, capacidade de estimular à resistência sanitária e ganho de peso. A espécie
E. faecium é denominada como micro-organismos colonizador permanente e/ou
transitório, no aparelho digestivo animal (DUPRE et al., 2005; POLLMAN et al., 2005;
SIVIERI et al., 2007).
O micro-organismo se acentua dentre outras, pela sua rápida atividade
microbiológica de crescimento e produção de compostos antimicrobianos, no combate a
flora patogênica intestinal, reduzido tempo de duplicação, com reprodução de até três
vezes mais intensa, elevada resistência às condições ácidas estomacais, com reduzida
capacidade de perda na densidade floral, quando veiculado na suplementação oral e
rápida adesão aos sítios de ligação na parede intestinal do hospedeiro, expressiva

capacidade de auto-agregação, característica essa de grande importância para fins
probiótico, pois a sua coagregação em um curto intervalo de tempo contribui a formação
da barreira física intestinal, impedindo a colonização de agentes patogênicos
(NALLAPAREDDY et al., 2000; LUND & EDLUND, 2001; KÓS et al., 2003).
Enterococcus faecium se destaca por apontar uma grande absorção intestinal dos
nutrientes e capacidade de colonização no intestino do hospedeiro, a partir dos dias
iniciais de suplementação alimentar. Trabalhos utilizando E. faecium para uso
probiótico, progridem linearmente na avaliação de diferentes cepas da espécie à
suplementação alimentar (MARCIÑÁKOVA et al., 2004; POLLMAN et al., 2005;
VAHJEN et al., 2009).
Com satisfatórios resultados em distintas aplicações, para variadas espécies
animais, Kinouchi (2006) e Sivieri et al. (2007), utilizando fêmeas de camundongos
com tumores biologicamente induzidos, obtiveram reação anticarcinogênica, nos
tratamentos de indivíduos suplementados com E. faecium, na dieta. Assim como na
aquicultura Wang (2007), Merrifield et al. (2010), Kim et al. (2012) e Dias et al. (2007),
comprovam a eficácia probiótica na suplementação alimentar de tilápias, linguados,
trutas e rãs, utilizando Enterococcus faecium como promotor no desempenho
zootécnico e resistência imunológica às espécies.
1.5 BACTERIOSES NA AQUICULTURA
As bacterioses são enfermidades no sistema de produção animal responsáveis
pelos incalculáveis prejuízos econômicos, comprometendo a saúde e comercialização
das espécies (CAMPOS, 2010). Com a expansão da produção aquícola, apontam para
limitações em sua cadeia produtiva relacionadas aos aspectos sanitários presentes pela
intensificação da atividade, ocasionadas pela elevada densidade de estocagem e
negligentes manejos, tornando o ambiente propício ao surgimento de doenças nas
espécies produzidas. Sendo as principais causas dessas atribuídas a deterioração da
matéria orgânica, resultado de um errôneo manejo alimentar e produtivo,
comprometendo a qualidade da água, estresse ocasionado pelo impróprio manejo de
transporte e produção, contribuindo a um ambiente susceptível a proliferação dos
agentes oportunistas e patogênicos (ALKAHEM, 1994; SAKAI, 1999; FUJIMOTO et
al, 2005).
Sistemas de produções aquícolas são vulneráveis as enfermidades e condições
ambientais. Apontando para surtos parasitários como grandes entraves monetários ao

produtor, podendo impactar na perda parcial ou total de seus recursos produzidos,
consequentes da intensa proliferação patogênica bacteriana em curto espaço de tempo
(FAO, 2012; PEIXOTO, 2012).
As bacterioses mais frequentes que comprometem significativamente a cadeia
produtiva da piscicultura continental, se destacam as Pseudomonas aeroginosa,
Streptococcus aureus, Enterococcus durans, Micrococcus luteus, Escherichia coli e
Aeromonas durans (MARTINS, 2008). Suas transmissões ocorrem de forma horizontal,
sendo os seus surtos associados às mudanças climáticas, ambiente sanitário produtivo
inadequado, negligentes formas de manejo e transporte (PAVANELLI, 1998; AUSTIN
& AUSTIN, 2007; DUNG, 2008).
Em implantações aquícolas continentais são causadoras de lesões ulcerativas na
derme, equimoses, hemorragias, exoftalmia, acúmulo de secreção nos tecidos nos peixes
em confinamento, além de grande causadoras de anemia, sessões nos rins e fígado,
baixa imunidade e estresse animal (KIROV et al., 2002).
Surtos parasitários ocasionados por micro-organismos patogênicos são
denominados como principais entraves na cadeia produtiva aquícola mundialmente,
neste senário estas espécies, se encontram com alto grau patogênico em ambientes
sanitários de produção piscícola, principalmente as espécies continentais dulcícolas
brasileiras, intervindo em drásticas perdas produtivas e comercialização de peixes
(ZMYSLOWSKA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).
Estes gêneros são considerados de grande patogenicidade, tanto na produção
animal, quanto para humanos, micro-organismos gram positivo/negativo autóctone da
fauna intestinal de peixes saudáveis, porém organismos oportunistas, que em ambientes
sanitários inapropriados e desequilíbrio homeostático do animal desempenham
patogenicidade na aquicultura, causadoras da septicemia hemorrágica bacteriana.
Apontando como diagnóstico a ruptura dos vasos sanguíneos, lesões na epiderme,
descamação, hemorragias ao longo do corpo do animal, despigmentação corpórea,
acentuado batimento opercular, anemia, natação errática, exoftalmia, curvatura do corpo
e mortalidade (WOO e BRUNO; 2003; DUNG, 2008; SILVA et al., 2012). Espécies
classificadas mais vulneráveis nos empreendimentos aquícolas, capazes de produzirem
enzimas extracelulares e toxinas: citosinas, hemolisinas e proteases (MARTINS, 2000;
KOZINSKA, 2007).
1.6 SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS in vitro

A seleção de bactérias in vitro é de grande importância para atenderem as
premissas à potencialidade probiótica. Para isto Vine et al. (2004) ressalta, sendo
fundamental o isolamento de cepas pertencentes à fauna intestinal do organismo em
produção e a realização de ensaios in vitro que instiguem, a não patogenicidade do
micro-organismo, resistência às ações fisiológicas do animal, assim como aos efeitos
antrópicos e naturais do sistema de produção, como nas medidas profilática com NaCl e
as oscilações das variáveis físico-químicas do ambiente, inibição de organismos
indesejáveis, a partir de compostos inibitórios, e competição por espaço e nutriente à
microbiota patogênica. Com o exposto, apontando como pré-requisito para maior
segurança alimentar animal e ação probiótica, ao serem inseridas aos estudos in vivo.
Ensaios de tolerâncias das cepas probióticas frente a concentrações salinas
condizem à atividade osmótica da parede celular do procarioto, quando expostas aos
sais expelidos pela bile , medidas profiláticas e desempenho dos animais em produção e
viabilidade produtiva das espécies continentais com organismos marinhos, apontando
relevante às análises in vitro para a capacidade de difusão osmótica do probiótico
(HILL, 1990; FABREGAT et al., 2006; RIBEIRO, 2011).
A atuação do suco gástrico no aparelho digestivo do animal intervém como
barreira enzimática com escalas críticas de acidez e ação emulsificante dos sais biliares,
letal aos micro-organismos (HILL, 1990; MARTINS et al., 2005; NITHYA &
HALAMI, 2013). Assim como também a alcalinidade, podendo intervir tanto, no
sistema de produção animal, durante os processos de calagem, quanto à fisiologia de seu
intestino posterior (MOMOYAMA, 2004; BALCÁZAR et al., 2008; VINATEA et al.,
2010).
A ação antagônica dos micro-organismos é conceituada como uma zona de
inibição do crescimento formado no entorno de discos embebidos em cultura bacteriana
candidatas a probiótico, frente a meios de crescimento bacteriano, semeados com
organismo patogênicos (VASEEHARAN & RAMASAMY, 2003). A partir de sua
capacidade em produzir compostos como: ácidos orgânicos e bacteriocinas, na inibição
de bactérias patogênicas gram positivas e peróxido de hidrogênio, bem como a
produção de ácidos orgânicos e ácido acético no combate ao crescimento de procariotos
gram negativos (VÁSQUEZ et al., 2005; GILLOR et al., 2008).
Na avaliação do potencial de crescimento e tempo de duplicação do probiótico,
são de grande importância seus testes in vitro, para eventual viabilidade de produção,
manutenção na densidade microbiológica intestinal para perspectivas análise in vivo,

simulando a elevada capacidade em multiplicação para competir por espaço e nutriente,
aos agentes patogênicos no hospedeiro (VINE et al., 2004; SANZ, 2007; VELEZ et al.,
2007; VASILJEVIC & SHAH, 2008).

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3 RESUMO
A espécie Pterophyllum scalare aponta para expressivos valores monetários em
comercialização, sendo exportada principalmente para os países Europeus, Americanos
e Asiáticos. Porém com a intensificação do sistema de produção animal, surtos
parasitológicos, principalmente atribuídos a bactérias patogênicas, vêm comprometendo
a cadeia produtiva ornamental. Para isso, como alternativa segura e eficaz de combate e
prevenção a enfermidades, vêm sendo adotado o uso de rações funcionais
suplementadas com imunoestimulantes prebióticos e/ou probióticos, que garantam
melhores valores de desempenho e resposta imunológica a espécie em produção. Para a
eficácia de cepas probióticas, é fundamental o seu isolamento e seleção do animal em
produção, exigindo uma série de desafios in vitro que comprovem a sua eficácia,
resistindo às barreiras fisiológicas e produtivas a aquícola ornamental do P. scalare. O
objetivo do trabalho foi isolar e selecionar in vitro cepas de micro-organismos ácido
láctico de potencial uso probiótico do acará bandeira (Pterophyllum scalare), realizando
uma série de desafios in vitro fundamentada em múltiplas características. Definindo o
melhor ideótipo, por artifício das maiores médias entres as cepas avaliadas frente aos
caracteres tolerância ao NaCl (0,5: 1,0: 1,5: 2,0: 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 8 e 9), sais
biliares (5%), halo de inibição contra seis patógenos continentais, velocidade máxima
de crescimento, contagem final de células viáveis e das menores médias para o tempo
de duplicação dos procariotos. De cinco cepas isoladas do trato gastrointestinal do
animal com potencial uso probiótico, identificadas molecularmente como Enterococcus
faecium nomeadas nas variedades Probc 1, 2, 3, 4 e 5. Dentre as cepas avaliadas a todas
atenderam as premissas para uso probiótico animal, com destaque para a variedade
Probc 4 que apontou melhores resultados.
Palavras-chave: Desempenho zootécnico, piscicultura, ornamental, sanidade.

3.1 ABSTRACT
The specie Pterophyllum scalare was point the signficants monetary values in
comercialization, being exported mainly to the Eurpean countries , americans and
asiatics. But with a intensification of a animal production system, pathologics outbreak,
mainly attribute to pathogenics bacteria, was compromising the ornamental production
chain. For this as safe and effective alternative to combat and prevent the diseases, have
been adopted using functional ration supplemented with probiotics immunostimulants
and/or probiotics, that ensure better values of performances and imunes response to
species production. To the effectiveness of probiotics strains, it is fundamental to their
isolation and selection of animal production, resisting physiological barriers to
productive and ornamental aquaculture of P. scalare . The objective of this research
was isolate and select in vitro micro-organism acid lactic of potential probiotic use for
acara-bandeira (Pterophyllum scalare), to carring a challenge series in vitro unfounded
in multiple characters. Defining the best ideotype, by artificie of biggest measure
between the strains to value in charge the tolerate characters to NaCl (0,5 ; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5 and 3%), pH (4, 5, 6, 8 and 9) biliar salts (5%) halo of inhibition against six
continental pathogens, maximum velocity of growth, countdown to feasibles cells and
the smallest measures to the time of duplication of prochariotics. The five strains
isolated in the gastrointestinal tract animal with a potential use probiotics identified by
the molecules as Enterococcus faecium mentioned in varieties Probc 1,2,3,4 and 5.
Between the strains was valued to served the premise to the use of animal probiotic,
with prominent to the variety Probc 4 that was point better results.
Keyboards: Zootechnic performance, fishculture, ornamental, sanity.

4 INTRODUÇÃO
A produção de peixes com potencial ornamental cresce linearmente no mercado
internacional, apontando para valores monetários de aproximadamente US$ 200
milhões em comercialização, com 60% deste capital oriundo da economia de países em
desenvolvimento (FAO, 2007). Na América Latina, o Brasil se destaca apresentando
grande variedade da ictiofauna ornamental proveniente de suas bacias hídricas
continentais, estando catalogadas mais de 2.500 espécies com distintos fenótipos em
cores, tamanhos e formas. Entre essas regiões destacam-se os Estados do Baixo
Amazonas, que contribuem para que o País ocupe a décima oitava posição no ranking
dos países exportadores de peixes ornamentais do mundo (ALBUQUERQUE-FILHO,
2003; GODINHO, 2007; CARDOSO e IGARASHI, 2009; RIBEIRO, 2009).
As espécies ornamentais nativas como o acará-bandeira (Pterophyllum scalare
Liechtenstein, 1823), acará-disco (Simphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904), apaiari
(Astronotus ocellatus Agassiz, 1831) e o cardinal (Paracheirodon axelrodi Schultz,
1956), estão classificadas entre as espécies de maior exportação comercial (CHAPMAN
et al., 2000; GODINHO, 2007). P. scalare é um ornamental com grande potencial de
comércio no mercado nacional e internacional, apontando para atrativas características
morfológicas no mercado da aquariofilia e fácil adaptação aos diversos sistemas de
produção animal (LIMA, 2003; PRANG, 2007).
A intensificação dos sistemas de criação de peixes vem acarretando aumento de
enfermidades podendo ocasionar em mortalidades e consequentes prejuízos econômicos
à cadeia produtiva (SAKAI, 1999). A responsabilidade por essa problemática é
atribuída principalmente às bactérias patogênicas, de característica oportunista a
ambientes sanitários inadequados, alta densidade de estocagem, manejo alimentar
inapropriado, estresse animal, dentre outros fatores (ALKAHEM, 1994). Para prevenir e
combater as enfermidades bacterianas na piscicultura comumente são administrados
antibióticos, em sua maioria, de forma negligente e errônea, podendo fornecer
resistência aos micro-organismos patogênicos (VÁSQUEZ et al., 2005; DIAS et al.,
2011), além do que em ambientes aquícolas esse efluente pode ser fonte de poluição
(BOYD e MASSAUNT, 1999).
Como medida alternativa ao uso de antibióticos nos últimos anos vem sendo
adotado o fornecimento de rações funcionais suplementadas com imunoestimulantes,
prebióticos e/ou probióticos, aumentando os lucros e reduzindo os impactos ao corpo

hídrico. Essa estratégia produtiva aponta para a prevenção de surtos de micro-
organismos patogênicos no sistema de produção (OLIVEIRA et al., 2002).
Os probióticos são micro-organismos com potencialidades antagônicas aos
agentes patogênicos, através da colonização destes no trato digestivo do animal,
competindo desta forma por nutrientes e produzindo metabólicos inibidores, aplicados
em diversas áreas médicas, na agricultura e na produção animal, tendo aplicação na
aquicultura a partir da década de 80, contribuindo significativamente na sanidade
animal, a partir do estímulo de seu sistema imunológico (KOZASA, 1986; RAMIREZ,
2006; VINE et al., 2006; BALCAZR et al., 2008; GATESOUPE, 2008; TINH et al.,
2008).
Em produções aquícolas os probióticos são definidos como células microbianas
que ao serem inseridas no sistema de criação colonizam o trato digestório dos animais,
contribuindo com o desempenho e resposta imune do animal através do estímulo
produtivo de vitaminas, ácidos graxos de curta cadeia, minerais e lipídeos, além de
melhorar o aproveitamento proteico, otimizando a digestibilidade e assimilação dos
nutrientes essenciais, ocasionado pelo aumento da viscosidade intestinal, melhorando,
com isso, o desempenho zootécnico do indivíduo (GATESOUPE, 1999; SUGITA e
ITO, 2006; KESARCODI-WATSON et al., 2008; SOUZA et al., 2010).
Dentre os micro-organismos utilizados como probióticos, destacam-se as
bactérias ácido lácticas, por apontarem fácil crescimento, produção de compostos
antimicrobianos (ácido láctico, peróxido de hidrogênio, ácidos orgânicos e bactericidas)
e estímulos à resposta imune não especifica em seu hospedeiro (RINGO e
GATESOUPE, 1998; GATESOUPE, 2008).
A eficácia dos probióticos é comprovada quando inseridos nos sistemas de
produção aquícola, de acordo com MORIARTY (1998), ao suplementar a dieta com
micro-organismos probióticos, obtendo melhorias nas variáveis da água e na sanidade
de espécies aquáticas, assim como BOYD e MASSAUT (1999) comprovou seu efeito
biorremediador na decomposição da matéria orgânica e na qualidade da água na
aquicultura, promovendo redução nas taxas de fósforo e dos compostos nitrogenados,
amônia, nitrito e nitrato.
Assim, o isolamento de bactérias com interesse probiótico do trato
gastrointestinal da espécie em produção é fundamental para a sua eficiência, porém este
processo está associado ao isolamento de centenas de micro-organismos para este fim,
entretanto a abundância dessas bactérias inviabiliza a realização de ensaios com todas as

cepas com este potencial, sendo a produção desse suplemento alimentar exige a
realização de uma série de desafios de seleção “in vitro”, para inibição de agentes
patogênicos, conhecer a cinética de crescimento, a resistência a sais biliares e os efeitos
naturais e antrópicos que possam estar presentes no sistema de produção animal (ALY
et al., 2008; BALCAZAR et al., 2008; EH-RHMAN et al., 2009).
Um micro-organismo que atenda as premissas de um probiótico deve apontar
para o maior número de características específicas, que garantam a sua eficiência como:
não ser patogênico, ausente de genes que resistam a antibióticos, tolerante aos sais
biliares e pH, aderência à mucosa intestinal, elevado crescimento e reprodução,
capacidade de colonizar a superfície do epitélio intestinal, registro como aditivo
alimentar, boa atividade antagônica aos patógenos com grande expressão de surtos a
espécie produzida, especificidade ao hospedeiro, preferencialmente de origem autóctone
do animal (MERRIFIELD, 2010).
Portanto, o objetivo deste trabalho é isolar e selecionar “in vitro” cepas de
micro-organismos ácido lácticos de potencial probiótico do peixe ornamental
amazônico acará bandeira Pterophyllum scalare baseada em múltiplos desafios.

5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Isolar e selecionar a bactéria com potencial probiótico, obtida do trato
gastrointestinal do peixe ornamental amazônico acará bandeira Pterophyllum scalare.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Isolar bactérias ácido lácticas do trato gastrointestinal do acará bandeira
Pterophyllum scalare;
 Avaliar “in vitro” as cepas isoladas submetidas a desafios com NaCl, pH, sais
biliares, inibição de patógenos;
 Cinética de crescimento; velocidade máxima de crescimento e tempo de
duplicação;
 Identificar as cepas com potencial probiótico.

6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL
PROBÓTICO.
As cepas das bactérias com potencial probiótico foram isoladas do trato
digestório de dez juvenis saudáveis do peixe ornamental amazônico acará-bandeira
Pterophyllum scalare, obtidos a partir de reprodução natural em cativeiro, com valores
zootécnicos de 38,77 ± 0,58mm, 21,95 ± 0,17 mm, 32,63 ± 0,26 mm e 775,71 ± 0,15
mg para comprimento total, comprimento padrão, altura e peso, respectivamente,
mensurados com o auxílio de paquímetro e balança de precisão.
Os organismos foram submetidos a jejum de 24 horas, para esvaziamento
intestinal. Os peixes foram eutanasiados com secção na medula espinhal, desinfetados
externamente com solução de álcool 70%, e eviscerados, realizando a excisão do
intestino do animal em condição estéril, com peso de 0,1g, utilizando bisturi, tesoura e
placa de petri previamente esterilizados.
Após coletado, o material foi macerado em solução salina de NaCl a 2%,
utilizando gral e pistilo de porcelana, posteriormente transferidos para tubos Falcon
contendo 9 ml de meio de cultura em caldo para Lactobacillus Man Rogosa Sharpe
(MRS), meio exclusivo para o crescimento de bactérias lácticas, homogeneizado com
agitador de tubos vortex e incubados por 24 horas a 35°C.
Após incubada, a solução foi novamente homogeneizada e semeada em placas
de petri com volume de 15 ml de meio de cultura agar Man Rogosa Sharpe (MRSA) em
duplicata, homogeneizadas com esferas de micropérolas, contendo 10% de azul de
anilina como indicador de cepas probióticas (RAMIREZ et al. 2006) e incubadas por
um período de 48 horas a 35 °C em estufa esterilizada. Os meios de cultura foram
elaborados em soluções contendo água destilada e concentrações de soluto coerente às
instruções do fabricante. Esterilizados em autoclave a temperatura de 120 °C durante 20
minutos. Após o processo, os meios de cultura foram transferidos para a capela de fluxo
laminar, até atingirem a temperatura ambiente, a seguir esterilizados com luz ultra
violeta por 20 minutos, para posteriormente serem semeadas as cepas em meios de
cultura em caldo e placa (BULLER, 2004).
As colônias de interesse (bacilos e cocos gram-positivas), foram isoladas por
esgotamento de estrias em meio agar MRS e avaliadas quanto à produção de catalase,

descartando para as etapas de inibição in vitro as cepas catalase positivas (JATOBÁ et
al., 2008).
Após o isolamento em estrias as colônias desenvolvidas no meio de cultura
foram reconhecidas e classificadas utilizando o método de Gram. As colônias com
relevância para uso probiótico, cocos e bacilos gram-positivas, foram semeadas em um
novo meio de cultura Ágar MRS para esgotamento em placa.
6.2 IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE
O material genético para identificação das cepas, foi extraído de isolados puros
mantidos em meio semissólido, no Laboratório de Probióticos da Universidade Federal
do Pará. Onde cada cepa foi semeada com o auxílio de uma alça de platina estéril em
meio caldo MRS com 10 ml, incubados a 35 °C após 24 horas de crescimento
bacteriano.
Para a extração do DNA dos procariotos seguiu a metodologia de Sambrook et
al. (1989), adaptado por Jin (2006), sendo após o cultivo das cepas, 1,4 ml de cada
cultura foi centrifugada a 12000g durante 2 minutos, sendo o pellet ressuspenso em 530
µl de TE (100mM de Tris e 1 mM de EDTA), posteriormente adicionada um alíquota de
28 µl de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 20%, e 2 µl de proteinase K (2mg/ml).
Mantidas em estufa a 37 °C por duas horas sem agitação, para posterior extração,
utilizando 500µl de feno/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Em seguida o
sobrenadante foi retirados e 500µl expelidos em um novo micro túbulo com capacidade
de 1,5 ml, adicionado 10 µl de NaCl a 5 M, para uma concentração final de 10 mM, no
precipitado com duplicata de etanol absoluto gelado. Após esses procedimentos o DNA
foi congelado à -20 °C durante duas horas, para posterior centrifugação á 12000g em
dez minutos, sendo o precipitado lavado com solução de álcool a 70% e ressuspenso em
100 µl de TE e tratado com 2 µl de RNAse H (10 mg.ml-1
). Para posterior análise de 4
µl por eletroforese em gel de agarose a 1 % para quantificação.
A quantificação do DNA extraído foi realizada pela metodologia de
fluorescência (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Uma vez quantificado o material
genético das cepas de bactérias com potencial probiótico, prosseguiu o processo de
amplificação dos genes selecionados para sequenciamento e posterior identificação dos
isolados do trato-gastrointestinal do acará bandeira. A região foi isolada e amplificada
via PCR phenylalanyl-tRNA synthase (pheS), utilizando os seguintes iniciadores: pheS-
21-F (5' CAYCCNGCHCGYGAYATGC 3') e pheS-23-R (5'

GGRTGRACCATVCCNGCHCC 3'), eficaz para analise taxonômica de procariotos
ácido lácticos (NAESER et al. (2007). Em seguida foi realizada a amplificação do
fragmento de DNA a partir da técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR).
As reações foram conduzidas com um volume de 15 µL, sendo 2,4 µL de DNTPs (1,25
mM), 1,5 µL de tampão (200 Mm Tris-Hcl- PH 8, 500 Mm KCl), 0,6 µL de MgCl2 (50
Mm), 0,6 µL de cada um dos iniciadores (50 ng/ µL), aproximadamente 50 ng de DNA
molde, 0,1 µL de Taq Polimerase (5 U/ µL ) e água ultrapura para completar o volume
da reação.
Após o resultado de PCR o sequenciamento das amostras foi efetuado pelo
método de dideoxiterninal (SANGER et al., 1977), no sequenciador automático ABI
3500 XL, utilizando reagentes do kit BigDye (ABI Prism TM Dye Terminator Cycle
Sequencing Reading Raction – PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). As
sequências foram alinhadas e editadas com o auxílio do programa BioEdit (HALL,
1999).
Após sequenciado o material genético foi extraído em um arquivo individual
para cada cepas em formato FASTA, para leitura no programa Basic Local Alignment
Search Tool-BLAST. A identificação das cepas foi realizada inicialmente pela
comparação com sequências depositadas no acervo mundial de sequências GenBank
(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/), sendo a busca realizada com o algoritmo
MEGABLAST. Posteriormente, as relações filogenéticas foram estimadas com
construção de uma árvore de agrupamento de vizinhos, utilizando 1000 pseudo-réplicas
de booststrap, sendo estas análises conduzidas no MEGA v. 6.05 (TAMURA et al.,
2013).
6.3 SELEÇÃO in vitro
Para os testes in vitro as cepas das bactérias com potencial probiótico isoladas
foram semeadas em tubos Falcon esterilizados contendo volume de 9ml de meio de
cultura caldo MRS, produzidos com distintas concentrações salinas de (0, 0,5, 1,0, 1,5,
2,0, 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 7, 8 e 9), sais biliares, 5% (p/v), semeados com um ml de
cultura crescida de cada cepa e conduzidas para estufa a 35 °C durante o período de 24
horas com quatro repetições. Em seguida, realizou-se leitura de 1 (um) ml de cada
cultura em cubetas para análises no espectrofotômetro a 630 nm de absorbância. Sendo
a resposta de cada cepa isolada sobre distintas concentrações de NaCl, pH e sais biliares

definidas pelo percentual de redução da absorbância em comparação ao meio de cultura
controle com 0% de NaCl, pH (7) e sem adição de sais biliares.
6.4 INIBIÇÃO DE PATÓGENOS
A inibição de patógenos foi aplicada a capacidade antibacteriana das cepas ácido
lácticas frente aos agentes patogênicos, analisado pelo halo de inibição, denominado
pelo diâmetro da zona inibitória das cepas probióticas (HJELM et al., 2004), realizado
pelo método de Ramirez et al. (2006). Com isto as cepas ácido lácteas crescidas em
tubos de ensaio com meio de cultura caldo MRS, mantidos por 24 horas incubadas em
estufa a 35°C, posteriormente semeadas em placas de petri contendo meio de cultura
agar MRS e incubadas a 35°C durante 48 horas.
Onde quatro discos com diâmetro de 0,8 cm foram retirados de placa Agar com
cepas de bactérias ácido lácticas e então sobrepostas em meio de cultura Agar Triptona
de Soja (TSA), recém semeadas com os patógenos: Aeromona hydrophyla,
Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus durans, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Micrococcus luteus incubados a 30 °C por 48 horas. A inibição do crescimento
dos patógenos foi determinada, pelo diâmetro do halo de inibição de crescimento
bacteriano produzido nas extremidades do disco Agar MRS.
As bactérias utilizadas como probióticos apresentam como característica a
competição por nutrientes e espaço com os microrganismos patogênicos do trato
gastrointestinal de seu hospedeiro, tornando de fundamental importância uma elevada
taxa de crescimento da cepa utilizada para tal fim (KESARCODI-WATSON et al.,
2008; VINE et al., 2006).
6.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO
As análises para determinarem a cinética de crescimento bacteriano foi realizada
a um intervalo de duas horas, retirando uma amostra de 1 ml do meio de cultura para
leitura em espectrofotômetro a 630 nm de absorbância. Para análise dos dados as
concentrações dos inóculos foram convertidas para unidades formadoras de colônia
UFC/ml. Após 24 horas de crescimento em meio de cultura líquido, uma alíquota de
100 µl de todos os frascos foram semeados em meio de cultura agar MRS, pela técnica
de diluição seriada e inoculadas a 35 °C durante 48 horas, para então serem estimadas
as unidades formadoras de colônia UFC/ml.

Para estes resultados, foram calculadas a velocidade máxima de crescimento
(µmax) e tempo de duplicação (tdup) das respectivas cepas, seguindo a equação de
JATOBÁ et al. (2008):
Velocidade máxima de crescimento;
Onde;
µmax = Velocidade máxima de crescimento
Z = Concentração (UFC/ml)
Z0 = Concentração inicial do inóculo (UFC/ml)
dt = Tempo de cultivo (horas)
Tempo de duplicação;
Onde;
tdup = Tempo de duplicação (horas)
µmax = Velocidade máxima de crescimento.
6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As contagens microbiológicas foram transformadas em log10(x+1), antes de
serem submetidas aos testes estatísticos. Sendo os dados obtidos em cada desafio
submetidos à Análise de Variância (ANOVA), com significância (p<0,05) e a diferença
das médias avaliadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, analisados com o
auxilio do programa estatístico ESTAT.

7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A importância na aquisição de um probiótico deve seguir o isolamento de
bactérias endógenas intestinais do próprio hospedeiro, garantindo uma maior segurança
como suplemento alimentar, não patogênica, habilidade em resistir ação dos sais
biliares, valores estremos de pH e proteases no aparelho digestivo do indivíduo. Assim
como testes antagônicos, para comprovar a produção de compostos inibitórios na
competição por nutrientes, dos probióticos frente à microbiota patogênica (VINE et al.,
2004).
Identificação da espécie
Como resultado das cepas ácido lácticas com potencial probiótico isoladas do
trato intestinal do acará bandeira Pterophyllum scalare, de 16 morfotipos selecionados,
cinco apontaram catalase negativa e prosseguiram aos demais ensaios in vitro,
identificados molecularmente como Enterococcus faecium. Das variedades analisadas
todas apontaram para uma vasta variabilidade fenotípica, para todos os caracteres
avaliados neste trabalho.
Os resultados da comparação do sequenciamento molecular obtidos da
ferramenta BLAST do banco de dados GenBank, apontaram para os iniciadores
específicos ao gene pheS eficaz na amplificação dos nucleotídeos das amostras, sendo
possível identificar a espécie trabalhada, com nítida leitura cromatográfica e
similaridade de identidade igual a 100%, das cinco cepas, com amostras identificadas
como Enterococcus faecium, sendo que estes resultados corroboram com o filograma
(Fig. 1), onde existe um elevado suporte estatístico para o arranjo contendo sequências
das cinco cepas, das analisadas e sequencias previamente identificadas com E. faecium.
No isolamento e seleção de cepas com potencial probiótico estudos que ao
identificarem esses isolados de animais em produção, deparam-se com cepas de mesmas
espécie, porém com variedades distintas. Vieira et al. (2008) ao isolarem bactérias
probióticas da carcinocultura marinha, identificadas bioquimicamente com galerias API
50 CHL, como resposta a melhor cepa que suprisse o perfil probiótico, a espécie
Lactobacillus plantarum com a variedade denominada L. plantarium 1, apresentou
melhor índices de avaliação a seriados testes in vitro.

Figura1. Fenograma das cepas probióticas isoladas do acará bandeira com as sequências
do gene pheS (aproximadamente 334 pares de base).
Assim como Roselet (2008) ao isolar e identificar molecularmente micro-
organismo com potencialidade probiótica, verificou que uma espécie pode apresentar
comportamentos distintos frete a desafios in vitro. Dosta et al. (2012) ao isolar
diferentes morfótipos com potencial probiótico de juvenis de Pterophyllum scalare,
identificou molecularmente três cepas que apontam melhores resultado de seleção in
vitro, utilizando o gene 16S, resultados que classificaram as cepas pertencentes ao
gênero Bacillus sp., com a variedade Bsp2 como melhor respostas as análises, não
sendo possível, averiguar agrupamento genético de similaridade à identificação
taxonômica de espécie.
Estudos comprovam a eficácia de Enterococcus faecium com uso probiótico
como promotor do desempenho zootécnico, imunológico e flora predominante no trato
gastrointestinal de animais (BENYACOUB , 2003; TARASOVA, 2010; SUN et al.,
2010). Desempenho probiótica do Enterococcus faecium foi relatado por Wang (2007),
ao suplementar na dieta de tilápias nilóticas, obtiveram melhores respostas de
desempenho no ganho de peso animal, quando comparadas com os indivíduos controle,
não suplementados com o probiótico. Ao utilizarem Enterococcus faecium na
ranicultura de Rana catesbeiana, Dias et al. (2007) obteve prósperos índices

zootécnicos, na menor conversão alimentar e efeito imunomodulador durante 28 dias
experimentais, evidenciando a eficácia do probiótico.
Entretanto Kim et al. (2012), apontaram maior concentração de lisozima e
resposta imunológica de linguado (Paralichthys olivaceus), durante duas semanas de
suplementação com o mesmo probiótico. Assim, para trutas alimentadas com ração
contendo o probiótico E. faecium, indicou para melhores respostas imunológicas, na
interação do probiótico com as células do sistema imune, a partir da observação celular
no epitélio intestinal do animal, induzindo a sua maior produção (MERRIFIELD et al,
2010).
Para a eventual potencialidade das cinco cepas ácido lácticas isoladas de P.
escalare, todas identificadas molecularmente pertencentes à espécie Enterococcus
faecium, a exigência dos testes in vitro à denominação da melhor variedade, torna-se
relevante na avaliação da resistência de cada cepa, aos fatores que possam intervir, no
sistema produtivo e fisiológico do animal. Classificando a melhor variedade para
eventuais viabilidades de produção e segurança a serem inseridas na cadeia produtiva do
ornamental.
Tolerância ao NaCl
Os sais expelidos pelo suco gástrico e das atividades enzimáticas do intestino
dos animais apresentam uma concentração que varia de 0,5-1% (p/v). Essa secreção
salina, compromete a passagem do procarioto probiótico, consequente da difusão
osmótica, até a suposta colonização no intestino do hospedeiro (HILL, 1990).
Para o desafio de resistência osmótica das bactérias com potencial probiótico
isolados de Pterophyllum scalare, todas demostraram viabilidade de resistência frente a
distintas concentrações de NaCl, com estatística significativa (p<0,05) para todas as
concentrações analisadas, expostas durante 24 horas ao desafio (Tab. 1).

Tabela 1. Redução em porcentagem de absorbância na avaliação in vitro das bactérias
ácidos lácticas isoladas do trato digestório do ornamental Pterophyllum scalare
submetidos aos desafios frente a concentrações de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3% de NaCl,
escalas de 4, 5, 6, 8 e 9 de pH e 5% de sais biliares.
Cepas
NaCl0,5
(%)
NaCl1,0
(%)
NaCl1,5
(%)
NaCl2,0
(%)
NaCl2,5
(%)
NaCl3,0
(%)
pH4
(%)
pH5
(%)
pH6
(%)
pH8
(%)
pH9
(%)
SB
(%)
Probc1
57,91 ±
3,58B
58,12 ±
7,83B
57,34 ±
6,99B
41,25 ±
6,05 C
56,56 ±
7,00B
68,53 ±
5,96A
0,0 ±
0,0B
0,0 ±
0,0B
17,57
±
1,89BC
16,47
±
1,66C
0,0 ±
0,0C
10,80
±
0,18C
Probc2
34,07 ±
6,91C
28,88 ±
2,69C
24,73 ±
3,73C
21,94 ±
3,00 D
15,99 ±
3,65D
14,51 ±
3,62C
0,0 ±
0,0B
0,0 ±
0,0B
19,10
±
2,89B
23, 80
±
2,73B
8,82
±
1,02B
11,17
±
0,78C
Probc3
80,26 ±
3,04A
72,79 ±
1,64A
74,29 ±
6,28A
68,69 ±
4,85 A
69,89 ±
1,57A
59,64 ±
4,67A
0,0 ±
0,0B
23,3
±
2,40A
13,22
±
0,59CD
1,07 ±
0,69D
7,1 ±
2,92B
17,05
±
0,42BC
Probc4
34,43 ±
4,56C
32,37 ±
1,54C
33,57 ±
3,11C
28,33 ±
2,45 CD
26,71 ±
1,99C
23,63 ±
1,53C
25,92
±
0,32A
15,83
±
2,24A
46,06
±
1,00A
36,55
±
3,75A
34,45
±
1,39A
62,96
±
6,88A
Probc5
66,69 ±
4,94B
70,64 ±
4,78A
67,09 ±
8,61AB
57,31 ±
8,05 B
51,02 ±
6,21B
44,84 ±
8,42B
0,0 ±
0,0B
22,80
±
9,50A
10,35
±
2,58D
26,25
±
2,20B
7,1 ±
1,37B
23,20
±
1,31B
F ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **
CV(%) 8,78 8,37 11,88 11,63 8,99 12,17 35,21 28,05 9,4 11,7 14,27 17,36
Letras distintas indicam diferença significativa entre os tratamentos na coluna pelo teste
de Tukey (p<0,05).
Os resultados explanaram crescimento bacteriano, em todas as concentrações
(Tab. 2), sendo o seu tempo de exposição bem mais elevado, comparado à fisiologia
animal, cuja ação do NaCl e sais biliares apontam para atividades que variam entre duas
e seis horas, indicando à aptidão de todas as cepas isoladas, em bombear cátions de H+
transportado para o interior celular, tanto em condições hipertônicas quanto ação ácida
do meio, através da ação enzimática das F0F1-ATPase, fornecendo as cepas condições
para resistirem em ambientes salobros e as barreiras fisiológicas química de 0,85% de
NaCl do suco gástrico animal, durante longos períodos de exposição (COCORAN et al.,
2005).
Na seleção de cepas com potencial probiótico Vieira et al. (2008) obtiveram
menor perda na densidade ótica bacteriana, submetidas a desafio com 3% de NaCl, a
espécie Weissella confusa. Assim como, demais autorias apontam a perda na
absorbância de crescimento de micro-organismos probióticos in vitro, as concentrações
elevadas de NaCl, utilizando Lactobacillus plantarum e Weissella cibaria
(PAPAMANOLI et al., 2003; RICCIARDI et al., 2009). Resultados estes que
corroboram aos obtidos neste trabalho, com cepas probióticas isoladas do ciclídeo acará

bandeira, sendo todos os isolados para este fim, apontaram para progressivos resultados
frente ao desafio salobro.
Resposta ao desafio às concentrações de NaCl das cepas isoladas de P. scalare,
apontaram para atividade microbiana de crescimento destas, podendo contribuir para
quando inseridas no sistema de produção animal, resistam à ação antrópica de criação,
como no policultivo da espécie ornamental estudada com o camarão marinho
Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) em baixas salinidades, se torna uma estratégia
de criação com relevância econômica para ambas as espécies de acordo com RIBEIRO
(2011). E resistir às medidas profiláticas da aquicultura ornamental, como Fabregat et
al., (2006) ao utilizarem concentrações de NaCl, avaliaram a resistência das larvas de
Pterophyllum scalare constataram boa resistência da espécie quando submetida ao
NaCl, proporcionando melhores valores de desempenho zootécnico e medida profilática
contra agentes patogênicos.
Resistência esta catalogada também à cepa probiótica, Lactobacillus plantarum
à salinidade no sistema de produção e atividade antagônica da bactéria ácido láctica,
alterando a microbiota intestinal de espécies em produção (RAMIREZ et al., 2006;
GATESOUPE, 2008; VIEIRA et al., 2008).
Na suplementação probiótica em policultivo de camarão marinho com tilápia do
Nilo, em sistema de produção com água salinizada, Bezerra (2008) obteve redução na
contagem de bactérias totais, principalmente para Vibrios sp e Pseudomonas sp, para os
camarões e peixes, respectivamente, ação probiótica que também pode intervir como
biocontrole quando inseridas na criação de organismos aquáticos.
O policultivo de espécies dulcícolas com organismos marinhos, com destaque à
produção de camarões, vem contribuindo para resultados otimistas na viabilidade
econômica de produção, taxas de desempenho e redução de agentes patogênicos no
meio produtivo. Hipótese comprovada no policultivo de tilápia com camarão marinho,
que apontou para resultados sanitários otimistas, na diminuição às contagens de Vibrio
harveyi na água, reduzindo a contaminação horizontal, comparado com monocultivo do
crustáceo, micro-organismo de elevada patogenicidade na cadeia produtiva do camarão
marinho Litopenaeus vannamei (TORRANS & LOWELL, 1987; GRIMON, 2003;
VIEIRIA et al., 2007; VIEIRIA et al., 2008).
A escala produtiva das espécies de água doce em ambientes salobros visa reduzir
surtos patológicos em fazendas de camarão, técnica esta exercida com êxito no Equador
e Brasil (GRIMÓN, 2003; MELLO & FARIAS, 2007). O policultivo de crustáceos

marinhos com peixes apontam para bons índices zootécnicos dos camarões, que estaria
associado aos peixes reduzirem o excesso de matéria orgânica em suspensão,
colaborando no manejo de um ambiente de produção equilibrado na carcinocultura
(GRIMON, 2003; CANDIDO et al., 2005; MUANGKEOW et al., 2008). Sendo de
grande relevância a via de administração do probiótico na produção animal, premissas
que apontam resistência das cepas isoladas de P. escalare, para eventuais criações
salobras, de policultivo ou media profilática.
Tolerância ao pH
No aparelho digestivo dos animais a atuação do suco gástrico intervém, como
barreira enzimática com escala crítica de acidez, letal aos micro-organismos (HILL,
1990; MARTINS et al., 2005). Os resultados obtidos para esta variável apontaram
diferença estatística significativa (p<0,05), pelo teste de Tukey, para todas as escalas de
pH. Apontando para maior resistência nas escalas extrema de acidez e alcalinidade a
cepa Probc4, com menor percentual de perda em absorbância após 24 horas (Tab. 1),
submetidas ao desafio. Ocorrendo separação das médias as escalas de pH 5, 6 e 8, com
crescimento microbiológico às cepas Probc2 e Probc5 (Tab. 1).
Para as culturas probióticas exercerem atividades benéficas no aparelho
gastrintestinal do hospedeiro, as cepas com esse potencial devem resistir às escalas de
acidez e alcalinidade que interferem tanto, no sistema de produção animal, quanto à sua
fisiologia. O suco gástrico expelido no aparelho digestivo das espécies, apontam para
uma escala de pH com carácter extremamente ácido. Sendo de suma importância a
resistência da cepa probiótica a tolerar escalas extremas de acidez (NITHYA &
HALAMI, 2013).
Já o potencial hidrogeniônico em sistemas de produção aquícolas, é uma
variável de intensa oscilação, atingindo valores ácidos e alcalinos, dependendo da
eutrofização e pluviosidade nos tanques em produções superintensivas (MOMOYAMA,
2004; VINATEA et al., 2010). Sendo de suma importância a resistência da cepa
probiótica a uma ampla faixa de pH.
A água do sistema de produção é apontada como uma das barreiras físico-
químicas que podem intervir no crescimento microbiano de bactérias com potencial
probiótico, dentre suas variáveis o pH é crítico para o desempenho das bactérias, tanto
no meio produtivo, cujo pode alcançar valores extremos de acidez e alcalinidade, como
também na fisiologia intestinal do animal (MARTINS et al., 2005).

Para a produção de compostos lácticos suplementados com probiótico, o pH
dentre as escalas de 4-5, são utilizados à garantia microbiológica do produto durante o
seu período útil estocado (HELLER, 2001). Sendo de fundamental importância das
cepas probióticas, resistirem a escalas ácidas de pH, para eventual suplementação na
ração animal durante o processo de industrialização.
Realizando testes in vitro na resistência de 70 cepas do gênero de Enterococcus
frente a diversas escalas de pH, MORANDI et al. (2005), constataram que a espécie
Enterococcus faecium, é uma cepa resistente às oscilações dessa variável, que quando
expostas em curtos períodos, se é mantido o seu ciclo logarítmico, resultados que
corroboram aos obtidos no trabalho supracitado, apontando para significativa resistência
das cepas de E. faecium isoladas do ornamental acará bandeira, expostas durante 24
horas em diferentes concentrações de pH.
Realizando teste in vitro sobre diferentes concentrações de pH, na classificação
de micro-organismos probióticos, Lactobacillus plantarum, apontou reduzida perda de
viabilidade em meios contendo pH ácidos (PAPAMANOLI et al., 2003). Vieira et al.
(2008), avaliando cepas probióticas em escalas de pH ácido, não obteve êxito no
crescimento bacteriano, porém em escalas alcalinas suas espécies apresentaram
tolerância a essa escala, com valores significativamente maiores para a espécie
Weissella confusa, apontando para maior cinética bacteriana e efeito probiótico da
espécie em escalas mais elevadas de pH. Resultados que corroboram aos alcançados na
seleção de cepas probióticas de Pterophyllum scalare, entre as cinco variedades isoladas
e identificadas, a cepa Probc 4 mostrou maior resistência às escalas extremas de acidez
e alcalinidade, podendo exercer atividade probiótica na água e no intestino do animal,
de acordo com a sua via de aplicação.
Assim, a resistência das bactérias probióticas a ação ácida do suco gástrico do
animal, são fundamentais para o êxito desta tecnologia e atenda as definições de
GATESOUPE (1999), para a colonização do micro-organismo na mucosa intestinal do
animal. CHAVES et al. (1999) obteve êxito em testes in vitro quando submetido o
probiótico Lactobacillus acidophilus a concentração ácida de pH, com crescimento
bacteriano de 55,61, 26,14 e 11,70%, da cepa exposta durante 1, 2 e 3 horas,
respectivamente. Para este trabalho os resultados apontam que a variedade Probc3,
Probc 4 e Probc 5 das cepas isoladas, crescem em meio ácido e alcalino durante os
períodos de exposição testados no desafio, 24 horas. Característica essa que colabora à
potencialidade do probiótico a resistir às condições ácidas, tanto na fisiologia animal

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