Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

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Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS ESTUDO DE HERANÇA DA RESISTÊNCIA À BRUSONE (Magnaporthe oryzae) EM CULTIVARES DE ARROZ E IDENTITICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES THIAGO MARTINS PINHEIRO Orientadora: Profª. Larissa Leandro Pires GOIÂNIA 2011
  2. 2. THIAGO MARTINS PINHEIRO ESTUDO DE HERANÇA DA RESISTÊNCIA À BRUSONE (Magnaporthe oryzae) EM CULTIVARES DE ARROZ E IDENTITICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Agronomia, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Agronomia, área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas. Orientadora: Profª. Drª. Larissa Leandro Pires Co-orientadora: Dra . Marta Cristina Filippi GOIÂNIA, GO – Brasil 2011
  3. 3. Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1 1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese 1 2. Identificação da Tese ou Dissertação: Autor(a): Thiago Martins Pinheiro CPF: 884.016.932-68 E-mail: thiago_mpinheiro@yahoo.com.br Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X] Sim [ ] Não Vínculo Empregatício do(a) Autor(a): Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior Sigla: CAPES País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Estudo de herança da resistência à brusone (Magnaporthe oryzae) em cultivares de arroz e identificação de marcadores moleculares Palavras-chave: Resistência vertical, Resistência específica, Seleção assistida, Proteínas relacionadas à patogênese (PRP) Título em outra língua: Inheritance study of resistance to rice blast (Magnaporthe oryzae) in rice cultivars and identification of molecular markers Palavras-chave em outra língua: Vertical resistance, Specific resistance, Assisted selection, Proteins related to pathogenesis (PRP) Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Data defesa: 28/02/2011 Programa de Pós-Graduação: Agronomia – Genética e Melhoramento de Plantas Orientador(a): Profª. Drª. Larissa Leandro Pires CPF: 862.728.961-15. E-mail: larissa@agro.ufg.br Co-orientador(a): Drª. Marta Cristina Corsi de Filippi CPF: 051.829.609.32 E-mail: cristina@cnpaf.embrapa.br Co-orientador(a): CPF: E-mail: 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [X] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [ ] Outras restrições: ______________________________________________________ Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF não-criptográfico da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ____________________________ Data: 23/02/2012 Assinatura do(a) autor(a) 1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
  4. 4. Aos meus pais, Roberto e Estela. À minha irmã, Michele. Aos meus irmãos em amizade, Higor e Otávio. DEDICO E OFEREÇO “Depois de algum tempo você aprende a diferença, a sutil diferença entre dar a mão e acorrentar uma alma. E você aprende que amar não significa apoiar-se. E que companhia nem sempre significa segurança. Começa a aprender que beijos não são contratos e que presentes não são promessas. Começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos adiante, com a graça de um adulto e não com a tristeza de uma criança. E aprende que, não importa o quanto você se importe, algumas pessoas simplesmente não se importam… E aceita que não importa quão boa seja uma pessoa, ela vai feri-lo de vez em quando e você precisa perdoá-la por isso. Descobre que se leva anos para construir confiança e apenas segundos para destruí-la… E que você pode fazer coisas em um instante das quais se arrependerá pelo resto da vida. Aprende que, ou você controla seus atos, ou eles o controlarão… e que ser flexível não significa ser fraco, ou não ter personalidade, pois não importa quão delicada e frágil seja uma situação, sempre existem, pelo menos, dois lados. Aprende que heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer, enfrentando as conseqüências. Aprende que quando está com raiva tem o direito de estar com raiva, mas isso não te dá o direito de ser cruel. Descobre que só porque alguém não o ama do jeito que você quer que ame não significa que esse alguém não o ama com tudo o que pode, pois existem pessoas que nos amam, mas simplesmente não sabem como demonstrar ou viver isso. Aprende que nem sempre é suficiente ser perdoado por alguém… Algumas vezes você tem de aprender a perdoar a si mesmo. Aprende que com a mesma severidade com que julga, você será em algum momento condenado. Aprende que não importa em quantos pedaços seu coração foi partido, o mundo não pára para que você o conserte. Portanto, plante seu jardim e decore sua alma, em vez de esperar que alguém lhe traga flores. E você aprende que realmente pode suportar… que realmente é forte, e que pode ir muito mais longe depois de pensar que não se pode mais. E que realmente a vida tem valor e que você tem valor diante da vida! Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o bem que poderíamos conquistar se não fosse o medo de tentar.” Adaptado de O Menestrel – W. Shakespeare
  5. 5. 1 AGRADECIMENTOS À Deus, pela saúde, serenidade e força para a realização deste trabalho; Aos meus pais e irmã, pelo amor e apoio; À Nara Rodrigues, pela amizade e ajuda na formatação deste trabalho; À Bruna Fernandes, por todo seu significado em minha vida; Ao M. Sc. Fábio Gonçalves, pelos ensinamentos e companheirismo; À Dr.ª Marta Cristina Corsi de Filippi, pela orientação, dedicação, paciência, confiança e valiosas lições profissionais e de vida; À Prof.ª Dr.ª Larissa Leandro Pires, pela orientação, confiança e apoio; À Prof.ª Dr.ª Leila Garcês de Araújo, pela orientação no estágio de docência, sugestões de melhoria e incentivo; À UFG, pela concessão da vaga de mestrado; À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo; À Embrapa Arroz e Feijão, pela oportunidade de realização dos experimentos; Ao Dr. Rafael Moysés Alves, pelos ensinamentos e amizade; Ao Dr. Anne Sitarama Prabhu, pelas sugestões e empréstimo de materiais de pesquisa; À Drª. Tereza Borba, pelo auxílio com os marcadores microssatélites; À Drª. Raquel de Mello, pelo incentivo; Aos professores da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Goiás, pelos ensinamentos; Ao M. Sc. Márcio Vinícius Cortês, pelo treinamento e auxílio com o experimento de atividade enzimática e por sua quase infindável paciência e compreensão; Às funcionárias da Embrapa Arroz e Feijão, Paula Arielle Valdisser, Gesimária Costa e Fernanda Magalhães, pelo auxílio no Laboratório de Biotecnologia; Aos funcionários da Embrapa Arroz e Feijão, Edmar (Nenê) Ribeiro e Wanderlei (Delei) Cardoso, pelo treinamento e auxílio com os cruzamentos e obtenção das populações de arroz utilizadas neste trabalho; Aos funcionários da Embrapa Arroz e Feijão, Celsinho e Vando, pelo apoio na condução dos experimentos em casa de vegetação; Ao secretário da pós-graduação, Wellinton Motta, pela eficiência e disposição em ajudar;
  6. 6. 2 Aos colegas e ex-colegas dos laboratórios da Embrapa Arroz e Feijão de Fitopatologia: Mariana, Bruna Rengel, Maythsulene, Rafael Abud, Lucas Curado, Lidiane, Eugênio, e de Biotecnologia: Nara, Bruna Sanchez, Cristóvão, Ricardo, Jorge, Ivan e Thássio, pelo convívio e bom-humor; Aos colegas de mestrado Bruna Carla Fagundes, Giselle Davi, Rodrigo Branquinho, Jarênio, Neucy, João Antônio, Jackeline e Carolina Fagundes, pela companhia, amizade e estímulo.
  7. 7. 3 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS...........................................................................................................5 LISTA DE FIGURAS............................................................................................................6 ABSTRACT.........................................................................................................................10 1INTRODUÇÃO..................................................................................................................11 2REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................14 2.1A DOMESTICAÇÃO DO GÊNERO ORYZA...............................................................14 2.2MELHORAMENTO GENÉTICO DO ARROZ.............................................................16 2.3BRUSONE DO ARROZ.................................................................................................17 2.4RESISTÊNCIA GENÉTICA A BRUSONE...................................................................21 2.5MARCADORES MOLECULARES...............................................................................24 2.6ESTRUTURA DAS POPULAÇÕES DE BRUSONE....................................................26 2.7EXPRESSÃO DA RESISTÊNCIA E MECANISMOS DE DEFESA DA PLANTA....27 3MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................29 3.1ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA À BRUSONE (Magnaporthe oryzae) NAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1...................................................................................................................29 3.1.1Obtenção das populações segregantes.........................................................................29 3.1.2Identificação do número de alelos de resistência ........................................................31 3.1.4Identificação dos indivíduos resistentes.......................................................................34 3.1.5Validação experimental................................................................................................35 3.2MÉTODOS MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO. 37 3.2.1Extração de DNA genômico........................................................................................37 3.2.2Marcadores microssatélites .........................................................................................38 3.2.3 Análise de ligação.......................................................................................................40 3.3CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO......................41 3.3.1Plantio da população de estudo....................................................................................41 3.3.2Inoculação....................................................................................................................41 3.3.3Coleta das amostras......................................................................................................41 3.3.4Identificação dos indivíduos resistentes.......................................................................42 3.3.5Construção dos bulks e extração protéica....................................................................42 3.3.6Quantificação de proteínas totais e determinação de curva de calibração...................42 3.3.7Ensaio de atividade de β-1,3-glucanase.......................................................................43 3.3.8Ensaio de atividade de peroxidase...............................................................................44 4RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................45 4.1ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA NAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1..............................................................45 4.1.1Cruzamento: Metica-1 (S) x Cica-8 (R).......................................................................45 4.1.2Cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R)........................................................................48 4.2MARCADORES MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO. 53 4.3CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO......................58 4.3.1Atividade de β-1,3-glucanase.......................................................................................62 4.3.2Atividade de Peroxidase...............................................................................................64 5CONCLUSÕES..................................................................................................................66
  8. 8. 4 6REFERÊNCIAS.................................................................................................................67 ANEXOS..............................................................................................................................79
  9. 9. 5 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Relação dos primers microssatélites selecionados. ............................. 24 Tabela 2. Reações de PCR para cada marcador microssatélite utilizado. .......... 25 Tabela 3. Programações dos termocicladores para cada primer microssatélite utilizado. .............................................................................................. 26 Tabela 4. Frequências esperadas e obtidas das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1:1 e RC1:2, inoculadas com isolado 1049. .............. 31 Tabela 5. Frequências esperadas e obtidas das populações inoculadas com isolado 435. ......................................................................................... 34 Tabela 6. Teste de χ2 e significância para as frequências esperadas para as populações inoculadas com isolado 1049 e 435. ................................ 37 Tabela 7. Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ............................................................. 43 Tabela 8. Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ............................................................... 43 Tabela 9. Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ............................................................. 44 Tabela 10. Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ............................................................... 44 Tabela 11. Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1 ) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ....................................................................................... 44 Tabela 12. Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1 ) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ......................................................................................... 45 Tabela 13. Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1 ) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ...................................................................................... 45 Tabela 14. Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1 ) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ......................................................................................... 46
  10. 10. 6 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Plantio das cultivares Metica-1 e Cica-8 para obtenção das populações F1, F2, RC1 e RC2. ..................................................... 18 Figura 2. Sementes de arroz da população F1 obtidas por meio do cruzamento entre as cultivares Metica-1 e Cica-8. ...................... 19 Figura 3. Semeio das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2. .............................................................................................. 20 Figura 4. Inoculação das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2 em casa de vegetação. A e B: Disposição das bandejas na casa de vegetação; C: Compressor e D: Atomizador DeVillbis. ..................................................................................... 22 Figura 5. Tipos de lesões de brusone em arroz. A: Lesão tipo 0; B: Lesão tipo 1; C: Lesão tipo 3; D: Lesão tipo 5; E: Lesão tipo 7 e F: Lesão tipo 9. ................................................................................. 23 Figura 6. Incubação em banho-maria a 100ºC para ensaio de atividade de β-1,3-glucanase. ........................................................................... 29 Figura 7. Frequência de plantas da população Metica-1 para o isolado 1049. ............................................................................................ 32 Figura 8. Frequência de plantas da população Cica-8 para o isolado 1049. 32 Figura 9. Frequência de plantas da população F1 para o isolado 1049. ...... 32 Figura 10. Frequência de plantas da população F2 para o isolado 1049. ...... 33 Figura 11. Frequência da população RC1:1 para o isolado 1049. .................. 33 Figura 12. Frequência da população RC1:2 para o isolado 1049. .................. 34 Figura 13. Frequência da população Cica-8 para o isolado 435. .................. 35 Figura 14. Frequência da população Metica-1 para o isolado 435. ............... 35 Figura 15. Frequência da população F1 para o isolado 435. ......................... 35 Figura 16. Frequência da população F2 para o isolado 435. ......................... 36 Figura 17. Frequência da população RC1:1 para o isolado 435. .................... 36 Figura 18. Frequência da população RC1:2 para o isolado 435. .................... 37
  11. 11. 7 Figura 19. Padrão de amplificação nos genitores Metica-1 e Cica-8, apresentado por onze marcadores em gel de poliacrilamida desnaturante (6%). Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8). Marcadores microssatélites: 9871.T7E2b, RM224, RM7102, OSR32, RM144, RM6836, RM1261, JJ817, yca72, pBA14 e RM28130. .................................................................................... 39 Figura 20. Padrão de amplificação observada em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) para os primers RM224, RM7102, RM1261 e yca72 nos bulks das populações F1 e F2 resistente e susceptível. Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível. .................................................... 40 Figura 21. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) nos indivíduos das populações F1, F2 resistente e F2 susceptível pelo marcador RM7102. M: Ladder 10 bp; números 1 a 7: indivíduos do bulk F1; números 8 a 14: indivíduos do bulk F2 resistente; números 15 a 21: indivíduos do bulk F2 susceptível. ................................................................ 41 Figura 22. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) nos genitores Metica-1, Cica-8 e bulks das populações F1 e F2 resistente e susceptível. M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 435 (Cica-8); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 435 (Metica-1); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível. .................................................... 42
  12. 12. 8 RESUMO PINHEIRO, T. M. Estudo de herança da resistência à brusone (Magnaporthe oryzae) em cultivares de arroz e identificação de marcadores moleculares. 2011. 80 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Genética e Melhoramento de Plantas)–Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.1 A brusone (Magnaporthe oryzae) é considerada a doença mais importante dos arrozais. Devido à alta variabilidade da população do patógeno, cultivares de arroz rapidamente tem sua resistência à brusone sucumbida. A identificação e incorporação de diferentes genes de resistência em cultivares melhoradas e adaptadas, com o auxílio de técnicas moleculares, constitui-se em uma das estratégias na busca de resistência estável a serem adotadas. Tendo em vista o desafio acima colocado, este trabalho teve como objetivo determinar o número de alelos envolvidos na expressão de resistência do arroz a brusone, identificar marcadores microssatélites ligados a estes alelos e caracterizar a ação de duas enzimas relacionadas à patogênese. Os experimentos foram conduzidos sob condições controladas de casa de vegetação e laboratório. As gerações F1, F2, RC1:1 e RC1:2 foram semeadas em bandejas plásticas. Cada bandeja continha oito linhas, sendo dez plantas por linha. Cada patótipo de M. oryzae foi inoculado em trinta plantas do genitor resistente, trinta plantas do genitor suscetível, duzentas plantas da população F2, cem plantas da população RC1:1 e cem plantas da população RC1:2. Os isolados 1049, patótipo IB-1 e 435, patótipo IB-9, foram cultivados em meio de cultura aveia-dextrose-ágar para produção de solução de inóculo, à concentração de 3.105 conídios.mL-1 . As plantas inoculadas foram mantidas sob alta condição de umidade e temperatura média de 28ºC, durante sete dias. As avaliações foram feitas identificando a proporção de plantas resistentes e suscetíveis. Para testar onze marcadores microssatélites selecionados, foram feitas extrações de DNA de cada genitor e das populações F1 e F2. As reações de PCR assim como os ciclos de amplificação foram montadas de acordo com a característica de cada microssatélite. As reações foram submetidas a gel poliacrilamida desnaturante (6%) para identificação de polimorfismo entre os genitores e as populações F1 e F2. A caracterização enzimática foi estudada através da extração de proteínas, antes e depois da inoculação, durante cinco dias consecutivos para a determinação da atividade enzimática de β-1,3-glucanase (PR1) e peroxidase. A segregação em ambas as populações F2 apresentou proporção de três plantas resistentes para uma planta suscetível. Foi identificado um marcador microssatélite, RM7102, ligado ao alelo de resistência da cultivar Cica-8 ao patótipo IB-1. Não foi possível detectar diferenças entre as populações F2 resistentes e F2 suscetível quanto atividade de peroxidase. A população F2 suscetível, para ambos os patótipos, apresentou alta atividade de β-1,3-glucanase, enquanto a atividade da mesma enzima nos genitores e população F2 resistente não mostrou aumento significativo. Palavras-chave: resistência vertical, resistência específica, seleção assistida, proteínas relacionadas à patogênese (PRP) ______________ 1 Orientadora: Profª. Drª. Larissa Leandro Pires. EA-UFG.
  13. 13. 9 Co-orientadora: Drª. Marta Cristina Corsi de Filippi. Embrapa Arroz e Feijão.
  14. 14. 10 ABSTRACT PINHEIRO, T. M. Inheritance study of resistance to rice blast (Magnaporthe oryzae) in rice cultivars and identification of molecular markers. 2011. 80 f. Dissertation (Master in Agronomy: Genetic and Plant Breeding)–Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.1 Blast (Magnaporthe oryzae) is considered the most important disease of rice fields. Due to the high variability of the pathogen's population, rice cultivars quickly have its race-specific resistance to blast broken. The identification for incorporating different resistance genes in improved and adapted cultivars, utilizing molecular tools, is one breeding strategy to find stable resistance in short period. The goal of this research was to identify the number of resistance genes and SRR molecular markers to the pathotypes IB-1 and IB-9 of M. oryzae, and characterize some enzymes related to the expression of resistance. The experiments were conducted under controlled conditions of green house and laboratories. After crossing cultivar Cica-8 and cultivar Metica-1, the populations F1, F2, BC1:1 and BC2:2 were sown in plastic trays containing five kg of soil fertilized. Each tray contained eight lines with ten plants per row. Each pathotype of M. oryzae inoculated thirty plants of resistant parents, thirty plants of susceptible parents, two hundred plants of F2 population, one hundred plants of BC1:1 population and one hundred plants of BC1:2 population. The isolates 1049 (IB-1) and 435 (IB-9) were cultivated on oat medium to produce the inoculum solution (3.105 conidia.mL-1 ). The inoculated plants were kept under high humidity condition at 28°C, during seven days. Evaluations were made identifying the number of resistant and susceptible plants. Eleven microsatellite markers were tested by PCR strategies, utilizing DNA of each parent (resistance and susceptible), F1 and F2 populations. PCR reactions were assembled according to the characteristic of each SSR prime. The fragments were separated by denature polyacrylamide (6%) gel to identify polymorphism. Linkage analysis of the RM7102 microssatelite marker was estimated using the MAP MAKER III software. The enzymatic characterization was studied through the extraction of proteins, before and after inoculation, during five consecutive days for the determination of the activity of β-1,3-glucanase (PR1) and peroxidase. Segregation in populations F2 resistant and susceptible presented ratio of 3 plants resistant to 1 plant susceptible. An SSR marker has been identified, RM7102, and linked to the resistance gene of cultivar Cica-8 to the pathotype IB-1. Peroxidase had little activity in all populations. The F2 populations, susceptible to both isolates, presented high β-1,3- glucanase activity. Key words: vertical resistance, specific resistance, assisted selection, proteins related to pathogenesis (PRP) _______________ 1 Adviser: Profª. Drª. Larissa Leandro Pires. EA-UFG. Co-adviser: Drª. Marta Cristina Corsi de Filippi. Embrapa Arroz e Feijão.
  15. 15. 11 1 INTRODUÇÃO Para a metade da população global, cerca de quatro bilhões de pessoas, o arroz possui importância social por constituir-se cultura de subsistência e alimentar, fornecendo 20% do suprimento energético da dieta mundial, enquanto o trigo fornece 19% e o milho 5%. Contém alta concentração de amido além de fornecer também proteínas, vitaminas e minerais, acompanhados de baixo teor de lipídios (Anexo A) (Walter et al. 2008). Nos países em desenvolvimento o arroz pode fornecer, em média, 715 kcal per capita por dia, 27% dos carboidratos, 20% das proteínas e 3% dos lipídios da alimentação. No Brasil, o consumo per capita é de 108 g por dia, fornecendo 14% dos carboidratos, 10% das proteínas e 0,8% dos lipídios da dieta (Kennedy et al., 2002). Portanto, a quantidade e qualidade nutricional da produção deste cereal afetam diretamente a saúde da população mundial (Walter et al. 2008). A produção de arroz está geograficamente concentrada na Ásia, com mais de 90% da produção mundial. China e Índia, que representam mais de um terço da população mundial (52,3% no período de 1999-2003), abastecem mais da metade do mercado mundial de arroz (UNIDO, 2008). Para 2010/2011 estava prevista uma produção de 452,5 milhões de toneladas, com estoque final global de 94,3 milhões de toneladas (WAOB, 2010). Em contrapartida, o consumo mundial, para a mesma safra, está estimado em 454,37 milhões de toneladas. Na Ásia também concentra-se a maior área em extensão produtora de arroz, acompanhada de uma demanda permanente e crescente do consumo deste cereal, atribuído ao ritmo de crescimento da população. Destacam-se ainda a Indonésia, Bangladesh, Vietnam, Tailândia, Mianmar, Filipinas e Japão. O Brasil é o produtor de arroz mais importante fora do continente asiático, e representou, em media, 1,8% da produção mundial durante o período de 1999 a 2003 (UNIDO, 2008). Mundialmente, grandes aumentos na produção de arroz ocorreram durante as últimas quatro décadas, refletindo a adoção de tecnologia da revolução verde. Entretanto, atualmente, a taxa de crescimento dessa produção diminuiu. Enquanto essa produção aumentou em uma taxa de 2,49% ao ano de 1970 a 1990, a taxa de crescimento anual durante 1900 a 2000 foi de 1,70% e apenas 1,21% no período de 2000 a 2006. No Brasil, de acordo com dados do IBGE em setembro de 2010 estimou-se um total de 2.755.187 ha de área plantada, sendo estimado 2.702.263 ha de área a ser colhida
  16. 16. 12 com a cultura do arroz (representando 5,8% da produção nacional de cereais, leguminosas e oleaginosas), sendo a região Sul a que apresenta maior área plantada, com 1.235.791 ha, seguida das regiões Nordeste, Norte, Centro-Oeste e Sudeste, com 659.295 ha, 381.138 ha, 354.841 ha e 71.198 ha, respectivamente. A produção nacional esperada para o mesmo período foi estimada em 11.280.501 t (7,6% da produção nacional de cereais, leguminosas e oleaginosas), com rendimento médio esperado de 4.174 kg.ha-1 . A região Sul apresentou produção de 8.130.796 t, a região Centro-Oeste produziu 1.061.058 t, a região Norte com produção de 1.026.185 toneladas, a região Nordeste: com 872.775 t e região Sudeste com 186.687 t. O Anexo B contém os dados de área plantada, produção e participação nacional de cada estado brasileiro. Os sistemas de produção de arroz podem ser implantados em dois grandes ecossistemas: ecossistema de várzeas, irrigado por inundação controlada, e de terras altas, podendo ser feito sem irrigação e com irrigação suplementar por aspersão (Guimarães et al., 2006). No ecossistema de várzeas, a cultura do arroz pode ser cultivada de forma sistematizada, havendo controle da lâmina de água quando é conveniente ao cultivo. Também pode ser cultivada em áreas com nivelamento inadequado, que impede o controle da lâmina de água e a má drenagem não permite o manejo eficiente do sistema (várzeas úmidas, não sistematizadas), sendo irrigadas pela água da chuva ou elevação do lençol freático (Guimarães et al., 2006). No ecossistema de terras altas, o arroz pode ser cultivado com irrigação suplementar por aspersão ou sem irrigação, ficando dependente da precipitação pluvial. O cultivo com uso de irrigação por aspersão é um sistema que requer alto investimento e caracteriza-se pelo uso intenso do solo, necessitando de rotação de culturas e elevada aplicação de tecnologia (Guimarães et al., 2006). Todos os três sistemas são submetidos a estresses bióticos e abióticos. Entre os estresses bióticos que afetam o arroz destacam-se as doenças, e entre elas a brusone (Pyricularia oryzae (Cooke) Saccardo teleomorfo Magnaporthe oryzae (T. T. Herbert) Yaegashi & Udagawa). O arroz apresenta potencial produtivo de dez toneladas por hectare, entretanto, pequenos e médios agricultores colhem cerca de cinco toneladas por hectare de arroz irrigado devido às perdas ocasionadas por insetos pragas e doenças (Khush & Jena, 2009). Além da perda na produtividade, a ocorrência de doenças implica em perda na qualidade do produto final.
  17. 17. 13 De acordo com diversas estimativas, para garantir segurança alimentar nos países consumidores de arroz do mundo, será necessário incremento de 30% na produção de arroz até 2030 (Khush & Jena, 2009). Para superar esse desafio, são necessárias cultivares com maior potencial produtivo e estabilidade, adaptadas a menores volumes de água, terra, mão de obra e produtos químicos, como fertilizantes e defensivos (Zeng et al., 2004). Tendo em vista o desafio acima colocado, este trabalho teve como objetivo determinar o número de alelos envolvidos na expressão de resistência do arroz à brusone, identificar marcadores microssatélites ligados a estes alelos e caracterizar a ação de duas enzimas relacionadas à patogênese.
  18. 18. 2 REVISÃO DE LITERATURA O arroz é uma Liliopsida (Monocotiledônea) da família Poacea (Graminea), subfamília Pooideae, tribo Oryzae e gênero Oryza. O gênero Oryza apresenta 22 espécies, entre as quais se destacam O. sativa L. (arroz asiático) e O. glaberrima Steud (arroz africano), pertencentes a um grupo de espécies chamado complexo Oryza sativa, junto com cinco outras silvestres, O. rufipogon, O. longistaminata, O. barthii, O. glumaepatula e O. meridionalis. Este complexo foi primeiramente definido como espécies diplóides, tendo o genoma A em comum. Destas, somente O. rufipogon produz híbridos F1 férteis com O. sativa e, portanto, são consideradas como pertencentes a uma única espécie biológica. Evidências sugerem que O. rufipogon é o ancestral de O. sativa, e O. barthii é o ancestral de O. glaberrima (Morishima, 2001). O. sativa, O. glaberrima e seus aparentados são diplóides (2n = 24), constituídos pelo genoma AA, enquanto sete espécies silvestres são tetraplóides (2n = 48) (Chang, 1996). Goff et al. (2002) relatam que os genomas das espécies pertencentes à família Poaceae variam consideravelmente em tamanho, mas apresentam alta sintenia e similaridade nas sequências dos genes. Os genomas de sorgo, milho, centeio e trigo, por exemplo, possuem tamanho estimado em 1000 Mb, 3000 Mb, 5000 Mb e 16000 Mb, respectivamente. Em razão da sintenia com os demais cereais e por possuir um genoma comparativamente pequeno (430 Mb; 12 cromossomos), o arroz é considerado como modelo genético para todos os cereais (Lannes et al., 2004) e um alvo atrativo para descoberta de genes em cereais e análise genômica. 2.1 A DOMESTICAÇÃO DO GÊNERO ORYZA Fuller et al. (2009) indicam que a domesticação do arroz culminou após, aproximadamente, 6500 anos antes da era paleolítica. Estes dados são consistentes com os resultados de uma reanálise recente de mudanças no tamanho de grãos e fitólitos (Fuller et
  19. 19. al., 2008). Ross-Ibarra et al. (2007) explicam que determinados eventos, denominados de fundadores podem reduzir a diversidade genética, modificar frequências alélicas, aumentar o desequilíbrio de ligação e eliminar alelos raros na população resultante. Zhu et al. (2000) relatam que apenas 10% a 20% da diversidade genética dos parentes selvagens estão presente no arroz cultivado, o que denota um severo gargalo genético durante a domesticação. Um desses eventos mais importantes é a própria domesticação da espécie. Vitte et al. (2004) e Tang et al. (2006) explicam que duas hipóteses controversas entre si permeiam a origem do arroz. A hipótese de origem monofilética sugere que o arroz selvagem comum (O. rufipogon) evoluiu para as subespécies indica e japonica em diferentes locais e diferentes momentos. Por outro lado, a hipótese de origem polifilética sugere que a diversificação das subespécies indica e japonica ocorreu antes de serem domesticadas separadamente e, posteriormente, desenvolvidas em duas grandes subespécies. O arroz asiático (Oryza sativa) teve sua origem no Sul e Sudeste da Ásia e hoje é cultivado em todo o mundo. Já, o arroz africano (O. glaberrima) foi domesticado em partes da África Ocidental, e continua a ser localmente importante em alguns sistemas agrícolas nessas áreas. Segundo Morishima (2001), o arroz tem dois pools gênicos primários correspondentes a O. sativa e O. glaberrima, que contém as linhagens cultivadas e seus aparentados silvestres e daninhos. Existem, ainda, três hipóteses relativas à origem da diferenciação indica e japonica. Na primeira e mais aceita, o arroz da subespécie índica foi desenvolvido do ancestral selvagem no sudoeste da China, e o da subespécie japônica se diferenciou mais tarde a partir da subespécie indica (Ting, 1961, citado por Oka & Morishima, 1997). A segunda hipótese assume que o arroz selvagem domesticado em terras baixas tornou-se a subespécie indica, e aquele domesticado em terras altas tornou-se a subespécie japonica (Wang et al., 1984, citados por Oka & Morishima, 1997). A terceira hipótese e mais polêmica presume que as cultivares japonica se originaram na China a partir de um arroz selvagem da subespécie japonica e as cultivares indica se originaram em algum lugar fora da China, provavelmente na Índia (Chou, 1981, citado por Oka & Morishima, 1997).
  20. 20. 2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO DO ARROZ A diversidade genética das culturas é a base para o nosso suprimento alimentício e, portanto, a base para sobrevivência humana. Ela permite que agricultores e fitomelhoristas adotem uma cultura em um meio heterogêneo e em constante mudança e provê-la com resistência a insetos pragas e doenças. Grandes áreas plantadas com uma única cultivar ou poucas cultivares com alta proximidade genética podem ser especialmente vulneráveis a insetos pragas, doenças e intempéries (NRC, 1993). O desenvolvimento de cultivares modernas de arroz depende da disponibilidade contínua de variabilidade genética. A principal fonte dessa diversidade são as cultivares tradicionais que vem sendo cultivadas e selecionadas a gerações por rizicultores do mundo todo, em que todas as cultivares modernas podem ser rastreadas de volta até as cultivares locais (landraces). Espécies selvagens também representam um pool rico em diversidade, particularmente por sua habilidade em suportar insetos pragas e doenças, tendo dado importante contribuição para o melhoramento de arroz (Soon et al., 2008). Além da diversidade de espécies que o homem cultiva, há também variabilidade dentro de cada uma, seja de natureza genética ou ambiental. Durante o processo de domesticação e cultivo, as espécies e os patógenos desenvolveram mecanismos de sobrevivência mútua. A seleção natural, que favorece indivíduos com genes de resistência e patógenos com genes de virulência, estabeleceu um processo de co- evolução ocorrida em regiões geograficamente isoladas para o desenvolvimento de cultivares resistentes, fornecendo material genético de importância para o melhoramento de plantas (Borém & Miranda, 2005). O aumento da produtividade do arroz foi possível graças ao melhoramento genético de cultivares e práticas culturais intensivas, sendo que as metas básicas definidas pelos melhoristas de arroz têm sido o potencial produtivo, alta qualidade de grãos e tolerância a estresses bióticos e abióticos. No entanto, as prioridades de pesquisa têm mudado e novos desafios surgiram para atender às necessidades dos agricultores e dos
  21. 21. consumidores e para responder às mudanças socioeconômicas e culturais (Soon et al., 2008). Novas ferramentas biotecnológicas prometem aumentar a utilização de genes de parentes selvagens para o melhoramento de arroz (Khush et al., 1994). A ampla adoção de cultivares modernas de arroz, juntamente com insumos modernos, como fertilizantes, pesticidas e desenvolvimento da irrigação contribuíram para um aumento do suprimento alimentício (Hossain, 1995). Todavia, essas mudanças também contribuíram para a perda de diversidade genética, conhecida como erosão genética. Esta perda é reconhecida como um problema desde a década de 60 e tem sido formalmente definida como a perda de genes de um pool gênico, atribuída a perda de populações, causada por fatores como a adoção de cultivares altamente produtivas, a maior integração do agricultor com o mercado e limpeza de terras, urbanização e mudanças culturais. A redução da diversidade genética pode aumentar a vulnerabilidade do arroz para surtos dos principais insetos pragas e doenças (Soon et al., 2008). Cada vez mais, busca-se no melhoramento genético de plantas, a manipulação assistida por marcadores moleculares, a fim de se obter maior eficiência na transferência de fatores genéticos. Para tanto, diversos marcadores moleculares ligados a características agronômicas de interesse econômico têm sido desenvolvidos, permitindo uma seleção indireta de características desejáveis em gerações segregantes precoces. Tal estratégia reduz tempo e fontes de energia necessárias não só para desenvolver grandes populações segregantes por várias gerações, mas também para estimar parâmetros usados na seleção indireta (Caixeta et al., 2009). 2.3 BRUSONE DO ARROZ O gênero Pyricularia foi estabelecido por Saccardo, baseado em Trichothecium griseum Cooke e Digitaria sanguinalis L. Pyricularia grisea (Cooke) Saccardo constituia uma espécie-tipo do gênero Pyricularia.
  22. 22. O anamorfo do gênero Pyricularia pertence à classe dos Deuteromicetos e à ordem Monoliales. O teleomorfo pertence à classe Ascomycetos, ordem Diaporthales, e família Physoporellaceas. Os ascósporos são hialinos, fusiformes, com três septos e os ascos unitunicados (Filippi & Prabhu, 2006). Couch & Kohn (2002) reportam que Magnaporthe grisea contém duas linhagens distintas, uma associada a Digitaria e outra a Oryza sativa e outras Poacea. Apesar de não existirem diferenças morfológicas entre os isolados provenientes de Digitaria e de O. sativa, puderam identificar esta diferenciação por meio do uso de métodos moleculares. Assim, devido o nome M. grisea estar ligado a isolados de Digitaria, o nome cientificamente correto para isolados de Oryza e outras Poáceas é M. oryzae. O conceito de doenças de plantas é controverso, não havendo consenso quanto à sua melhor definição, sendo, então, mais fácil partir do conceito de planta sadia (Mizubuti & Maffia, 2009). Agrios (2005) caracteriza uma planta como saudável quando esta pode exercer as suas funções fisiológicas com o melhor de seu potencial genético. A planta se torna doente quando as células de toda a planta, ou de parte dela, apresentam alguma interferência na capacidade de desenvolver suas funções, por ação de organismo patogênico ou fator ambiental adverso. A brusone pode ocorrer em todas as partes aéreas da planta, desde os estádios iniciais de desenvolvimento até a fase final de produção de grãos. A disseminação do inóculo inicial pode ocorrer através do vento, semente e restos culturais. Os sintomas típicos iniciam-se por pequenos pontos de coloração castanha, que evoluem para manchas elípticas, com extremidades agudas. Estas manchas crescem no sentido das nervuras, apresentando centro cinza e bordos marrom-avermelhados, às vezes circundados por halo amarelo. O centro é constituído por tecido necrosado sobre o qual são encontradas as estruturas reprodutivas do patógeno. A dimensão do bordo está diretamente relacionada com a resistência da cultivar e com as condições climáticas, sendo estreita ou inexistente em cultivares muito susceptíveis. As manchas individualizadas podem coalescer e tomar áreas significativas do limbo foliar; neste caso, aparecem grandes lesões necróticas, que se estendem no sentido das nervuras. A redução na área foliar fotossintetizante tem reflexo direto na produção de grãos (Bedendo & Prabhu, 2005).
  23. 23. Nas panículas, a doença pode atingir a raque, as ramificações e o nó basal. As manchas encontradas na raque e nas ramificações são marrons e normalmente não apresentam forma definida; os grãos originados destas ramificações são chochos. A infecção do nó da base da panícula é conhecida como brusone do pescoço e tem papel relevante na produção (Bedendo & Prabhu, 2005). O ciclo infectivo da brusone inicia-se com a adesão do conídio em plantas de arroz. O tubo germinativo, produzido pelos conídios, diferencia-se em uma estrutura especializada de infecção, denominada apressório. O fungo utiliza a pressão gerada dentro do apressório para penetrar a cutícula da planta e a parede celular. Após a penetração, o peg de penetração diferencia-se em hifas infectivas primárias, não ramificadas que, por sua vez, desenvolvem hifas invasivas lobadas e bulbosas, nas células da planta. Como um patógeno hemibiotrófico, M. oryzae cresce inicialmente de forma biotrófica em tecidos infectados (Kankanala et al., 2007). Eventualmente, desenvolvem-se lesões nas plantas de arroz e o fungo produz mais conídios para reiniciar o ciclo de infecção (Ding et al., 2009). As lesões nas folhas de arroz, visíveis 72 horas após a inoculação, crescem em tamanho e número até coalescerem. Em 144 horas e sob condições de alta umidade, começa a produzir conídios em abundância, os quais são liberados e dispersos pelo vento, fornecendo o inóculo para um ciclo de infecção subseqüente (Filippi & Prabhu, 2006) Todas as regiões em que se produz arroz são afetadas pela brusone (Khush & Jena, 2009). Os prejuízos causados pela brusone são variáveis, dependendo do grau de resistência da cultivar, da época de incidência, das práticas culturais e das condições climáticas (Prabhu et al., 2003). As perdas causadas por brusone nas folhas são indiretas e afetam a fotossíntese e a respiração. Nas panículas, os danos são diretos, em virtude de seu efeito em diferentes componentes de produção (Bastiaans et al., 1994). Durante os últimos 30 anos, ocorreram três surtos de brusone na China, nos anos de 1982-1985, 1992-1994 e 2001-2005. A área média infestada por brusone foi superior a 3,8 milhões de hectares em 1982-1985, com perdas de diversos milhões de toneladas (Sun et al., 1999). Em 1993, as perdas de produção foram de 1,1 milhão de tonelada apenas na parte sul da China. Nos anos recentes, 5,7 milhões de hectares de arroz foram afetados pela doença (Khush & Jena, 2009).
  24. 24. A brusone é uma grande restrição para o cultivo do arroz em certas regiões agroecológicas da Índia. A região Oriental da Índia apresenta a maior ocorrência de brusone, seguida pelas regiões norte e sul. As perdas podem chegar à 50% em condições de sequeiro (Widawsky & O’Toole, 1990). Equipes multidisciplinares de cientistas supervisionam a cultura nos 125 distritos do País. Cerca de 15% dos distritos supervisionados durante 2001-2005 tiveram severa incidência da doença (Khush & Jena, 2009). A temperatura amena do Japão, Coréia do Sul e Indonésia é altamente favorável à multiplicação e disseminação da brusone durante a época de crescimento do arroz. Apesar de um enfático melhoramento para resistência à doença no Japão, desde o início do último século, e diversos genes de resistência terem sido introduzidos em cultivares japonesas, frequentes suplantações da resistência resultam em perdas significantes, variando de 20% a 100% (Khush & Jena, 2009). Na Coréia do Sul, a brusone causa perdas significativas todo ano. Durante a epidemia de 1984-1985, quase 20% da área de arroz foi seriamente danificada (Khush & Jena, 2009). Na Indonésia, 1,1 milhão de hectare de arroz são plantados anualmente e ameaçados pela ocorrência de brusone. Cultivares de arroz resistentes de terras altas tornam-se susceptíveis dentro de um ou dois anos de cultivo, podendo atingir perdas de 100% em certos anos (Sobrizal et al., 2007). O controle de doenças deve ser feito adotando-se medidas de manejo combinando diversos métodos, como controle químico e práticas culturais e resistência genética, sendo, porém, geralmente adotados de maneira isolada para o controle da brusone. A resistência genética das cultivares é o principal componente do manejo integrado da brusone. A adoção de práticas isoladas de controle de doenças tem se mostrado ineficiente, como o uso indiscriminado de fungicidas, que pode reduzir a atividade de antagonistas na filosfera, enquanto outros a aumentam (Prabhu & Filipi, 2006a). O controle da brusone através de produtos químicos ou fungicidas é uma alternativa que deve ser evitada sob risco de inviabilizar a produção devido a altos custos. A obtenção da resistência genética que possa associar-se às técnicas de manejo integrado
  25. 25. da cultura é um dos principais objetivos de programas de melhoramento do arroz, pois visam à redução das perdas de produção provocadas pela doença. Estas técnicas de manejo, por sua vez, são dependentes umas das outras e de grande importância no controle de doenças, pois são medidas economicamente mais viáveis e ambientalmente mais seguras, principalmente quando comparadas com o uso apenas do controle químico (Silva, 1993). 2.4 RESISTÊNCIA GENÉTICA A BRUSONE De acordo com Bueno et al. (2006), a resistência aos agentes fitopatogênicos assume papel muito importante ao se considerar que, geralmente, o número de cultivares aprovadas e disponíveis aos agricultores é relativamente pequeno. Algumas doenças de graves conseqüências somente podem ser controladas pelo uso de cultivares resistentes, como por exemplo, as viroses da cana-de-açúcar, do feijão e de outras culturas, várias doenças fúngicas e bacterioses. É de grande importância o conhecimento das bases genéticas da reação de resistência à brusone das cultivares de arroz, como herdabilidade, número de genes e do tipo de ação gênica; para a seleção de genótipos resistentes, pois a identificação do número e da combinação desses alelos está intimamente relacionada com a patogenicidade da população de P. grisea obtida pela adaptação do fungo às novas cultivares. Além disso, o conhecimento da ação gênica da reação de resistência à brusone possibilita um planejamento rigoroso para a escolha do germoplasma e nos critérios para seleção, estabelecendo rotatividade dos genes de resistência (Nunes et al., 2007). Um dos métodos utilizados para a transferência dos genes de resistência para cultivares comerciais através de etapas de retrocruzamentos e seleção, tendo como pai recorrente a cultivar comercial (Bueno et al., 2006). De forma geral, define-se resistência como sendo uma resposta do hospedeiro ao patógeno, durante o processo de colonização intracelular, ocorrendo mecanismos de defesa pré-penetração (preexistentes) e pós-penetração (induzidos). Russell (1978) define resistência como sendo qualquer característica herdada do hospedeiro que reduz o efeito do
  26. 26. patógeno. Esta é uma boa definição, pois não restringe o termo a um efeito inibitório direto do hospedeiro no desenvolvimento ou na atividade do patógeno, indicando apenas a redução da severidade da doença. Portanto, todas as alternativas capazes de diminuir a probabilidade de determinada doença se manifestar na planta estão incluídas nesta definição. Prabhu & Filipi, 2006b explicam que a distinção entre resistência e imunidade é teoricamente válida, porém tem pouca significância no campo. De acordo com a literatura existem diferentes tipos de resistência, classificados de acordo com a sua natureza genética. Van der Plank (1963) distinguiu dois tipos de resistência em termos epidemiológicos: vertical e horizontal. A resistência vertical é, geralmente, monogênica, atuando no controle do inóculo inicial, na taxa de aumento da doença ou em ambos. Também conhecida por resistência específica, qualitativa, monogênica, resistência completa, entre outros, caracteriza-se por apresentar efetividade contra alguns patótipos (raças fisiológicas) do patógeno, mas não contra todos. Seu efeito epidemiológico consiste no atraso no início da epidemia, devido à quantidade de inóculo inicial capaz de colonizar a planta ter sido reduzido. Todavia, a taxa de infecção de plantas que apresentam essa resistência é rápida, logo após o início da doença na planta (Borém & Miranda, 2005; Prabhu & Filippi, 2006b). A resistência horizontal, por outro lado, é poligênica, na maioria dos casos, reduzindo o aumento da doença. Existem outros tipos de resistência à brusone, como resistência relacionada com órgãos e tecidos, resistências não-hospedeira, induzida e fisiológica (Prabhu & Filippi, 2006b). No binômio M. oryzae e O. sativa, a interação especializada entre o patótipo (raça) e a cultivar de arroz é explicada pela teoria de Flor (1942), também conhecida como teoria gene-a-gene. Esta teoria pressupõe uma relação um-a-um entre genes de ataque (patógeno) e defesa (hospedeiro). Ou seja, para cada gene que condiciona uma reação de resistência no hospedeiro existe um gene complementar no patógeno que condiciona a avirulência. Portanto, o maior interesse é a busca por genótipos de arroz que apresentem estes genes de resistências que sejam complementares ao maior número possível de genes de avirulência, presentes no patógeno, resultando numa relação de resistência da planta ao patógeno.
  27. 27. Quando o gene de resistência vertical está presente na população do hospedeiro, impedindo que determinado patótipo colonize e cause doença em seu hospedeiro, este determinado patótipo pode evoluir para um novo patótipo capaz de superar o gene de resistência, mantendo sua sobrevivência através de seleção direcional. Porém, quando o gene de resistência vertical está ausente no hospedeiro, uma pressão de seleção negativa será exercida contra a porção não patogênica de população do patógeno, e o gene de virulência correspondente no patógeno torna-se desnecessário (Van der Plank, 1963). Estudos sobre herança da resistência a doenças foram primeiramente reportados por Sasaki (1922). Até 1960, a herança foi estudada sem conhecimento suficiente sobre a especialização patogênica do microorgansimo, dificultando o avanço no conhecimento sobre o tema. Esta lacuna começou a ser preenchida quando estudos sistemáticos foram conduzidos por Goto, que estabeleceu o sistema diferencial para raças de brusone, no Japão (Kush & Jena, 2009). McCouch et al. (1994) reportam que a herança da resistência à brusone pode ser conferida por um a três pares de genes independentes, sendo que a resistência é dominante na maioria dos casos. Kiyosawa e colaboradores utilizaram sete estirpes japonesas de brusone para investigar a herança da resistência e identificaram 13 genes de resistência (Kiyosawa, 1981), designados inicialmente como Pi-a, Pi-i, Pi-ks , Pi-k, Pi-z, Pi-ta, Pi-ta2 , Pi-zt , Pi-kp , Pi-km , Pi-kn , Pi-b e Pi-t. (Kush & Jena, 2009). Durante os últimos 25 anos grandes avanços têm sido feitos no estudo da genética da resistência a brusone. Seguindo análises genéticas convencionais de doadores de resistência identificados, disponibilidade de isolados puros do patógeno causador da brusone e uso de avançadas técnicas de análise molecular, cerca de sessenta genes para resistência foram identificados (Kush & Jena, 2009). Avanços em genética molecular e conclusão da sequência do genoma do arroz pavimentaram o caminho para clonagem e caracterização de sete grandes genes para resistência a brusone, entre eles: Pib (Wang et al., 1999), Pita (Bryan et al., 2000), Pi9 (Qu et al., 2006). As características de importância agronômica em interação com o ambiente se constituem em alguns dos maiores desafios no melhoramento de plantas, limitando o progresso genético no desenvolvimento de novas
  28. 28. cultivares. Estes desafios vêm sendo superados com as novas tecnologias desenvolvidas com a biotecnologia, como por exemplo, a identificação e seleção baseada diretamente no genótipo do indivíduo, resultando em maior progresso genético. Os marcadores moleculares permitem a análise dos indivíduos com base em seu DNA. A biologia molecular, em particular os marcadores moleculares, associados às informações de seqüenciamento e de mapeamento de genomas geram informações importantes sobre o genótipo dos indivíduos (Borém, 2009), reduzindo o tempo entre a geração de informação e sua utilização em escala comercial. 2.5 MARCADORES MOLECULARES Vários marcadores moleculares de DNA estão hoje disponíveis, diferenciando entre si quanto à habilidade em detectar polimorfismo, ao custo de aplicação, à facilidade de uso e à consistência de resultados. Eles podem ser aplicados nas fases de pré- melhoramento, melhoramento e pós-melhoramento de plantas, sendo utilizados em estudos de diversidade genética, fingerprinting, análises de pureza genética de sementes, melhoramento assistido, mapeamento genético, isolamento de genes, etc. (Borém, 2009). Os genomas eucariotos são densamente povoados por sequências simples repetidas, as quais consistem de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem, sendo denominadas de regiões microssatélites, ou SSR (Simple Sequence Repeats), ou ainda STR (Short Tandem Repeats). Existem quatro possíveis repetições de microssatélites, sendo: (a) repetições perfeitas, quando não apresentam nenhuma interrupção; (b) repetições imperfeitas, quando são interrompidas por bases não repetidas; (c) repetições compostas, quando duas ou mais repetições de microssatélites estão dispostas adjacentes; e (d) repetições simples, quando é formado por apenas uma repetição, sendo que, as repetições simples e compostas podem ser perfeitas ou imperfeitas (Caixeta et al., 2009). Os marcadores microssatélites apresentam alta reprodutibilidade, simplicidade técnica e apresentam co-dominância, permitindo diferenciar indivíduos heterozigotos de homozigotos. Além disso, aparentam ter distribuição freqüente e aleatória, permitindo ampla cobertura do genoma. Outro fator positivo é a possibilidade de alguns marcadores
  29. 29. microssatélites desenvolvidos para uma espécie serem utilizados em outra espécie, como diversos trabalhos na literatura demonstram, devido às regiões conservadas. Todavia, estes marcadores necessitam serem isolados e desenvolvidos especificamente para cada espécie, não sendo possível o desenho de primers universais. Além disso, o desenvolvimento destes marcadores envolve um processo demorado, trabalhos e oneroso (Borém, 2009). Com o advento dos marcadores moleculares vários genes de resistência a brusone foram localizados em cromossomos específicos. Por exemplo, os genes Pi2 e Pi4 foram localizados no cromossomo 6 e 12, respectivamente, via ligação com marcadores RFLP (Yu et al., 1991). Linhas quase isogênicas (NILs) foram utilizadas para mapeamento genético pela dissecção de genótipos complexos e avaliação dos efeitos de genes individuais em um background genético comum (Kush & Jena, 2009). Uma população para mapeamento desenvolvida no IRRI, proveniente do cruzamento entre IR64 e Azucena, tem sido utilizada ao redor do mundo para mapeamento de genes para resistência a brusone. Linhagens recombinantes (RILs) têm sido utilizadas para mapeamento de quatro grandes QTLs para a resistência a brusone, via ligação a marcadores RFLP (Tabien et al., 2000). Marcadores microssatélites (SSR) têm sido utilizados para mapeamento mais fino do gene Pikh , que confere resistência as raças de brusone da região do Himalaia no Noroeste da Índia (Sharma et al., 2005). Marcadores de polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP) têm sido empregados para mapeamento fino do locus Piz (Hayashi et al., 2004). Desde 1922, avanços consideráveis foram obtidos ao longo dos anos, principalmente devido à ação conjunta entre fitopatologistas e melhoristas e com o crescente aumento na utilização das ferramentas moleculares. Porém, o maior empecilho existente para a obtenção de uma cultivar resistente e produtiva é a alta variabilidade do patógeno. Nem mesmo com a utilização de técnicas como piramidação de genes, introgressão de genes via retrocruzamento ou marcadores moleculares será possível a obtenção de uma única cultivar que apresente resistência a todas as raças de M. oryzae. A solução, talvez, seja determinar a população do patógeno existente em cada macro e/ou região para assim obter e recomendar cultivar(es) que apresente(m) alta produtividade e
  30. 30. resistência a todas, ou quase todas, as raças do patógeno existentes em cada região de recomendação. 2.6 ESTRUTURA DAS POPULAÇÕES DE BRUSONE Stackman et al. (1962) definiram raça fisiológica como um biótipo ou grupo de bióticos dentro de uma espécie ou táxon, que podem ser diferenciados com razoável facilidade de outros biótipos ou grupos de biótipos, por características fisiológicas, inclusive patogenicidade. O termo patótipo é definido como uma população na qual todos os indivíduos têm uma determinada característica comum em patossistema ou parasitismo. Apesar do termo também ser correto e utilizado como sinônimo de raça, de acordo com Van der Plank (1975), raça é o termo mais utilizado, e a mudança de termos cria confusão, não sendo desejável. Todavia, é oportuna a utilização do termo raça patogênica em vez de raça fisiológica, ao diferenciar raças geográficas ou climáticas (Prabhu & Filippi, 2006a). A estrutura e diversidade das populações de Magnaporthe oryzae em arroz, que por muito anos foi estudada baseando-se na frequência de patótipos, durante os últimos vinte anos, vem sendo complementada com estudos baseados na utilização de marcadores RFLP (Roumen et al., 1997), rep-PCR (George et al., 1998), RAPD (Ross et al., 1996) ou AFLP. A estrutura genética de populações de M. oryzae patogênicas a arroz claramente mostraram que reprodução clonal é a regra na maioria das áreas plantas com arroz (Viji et al., 2000). Diversas cultivares melhoradas e resistentes à doença são lançadas, porém, dentro de poucos anos de utilização sua resistência é “quebrada”, devido à alta adaptabilidade do patógeno. A suplantação da resistência é um dos aspectos mais marcantes desta doença e tem sido bem documentada (Koizumi, 2007). Um dos objetivos da análise genética é conhecer profundamente uma determinada propriedade biológica (seja esta cor da flor, resistência a doença, etc.), descobrindo o conjunto de genes isolados que a afetam. Um método importante para identificar o número de genes envolvidos na característica é por meio das proporções
  31. 31. fenotípicas de segregação, as quais são baseadas na segregação definida por Gregor Mendel (Griffiths et al., 2008). O estudo da herança genética é fundamental, também, para determinar se o caráter é qualitativo ou quantitativo e o modo de ação predominante dos genes envolvidos com a resistência. A determinação dos parâmetros genéticos que governam a resistência permite direcionar os trabalhos de introdução de resistência, em germoplasmas suscetíveis, e possibilita maiores ganhos com a seleção, nos métodos a serem utilizados. O estudo do modo de herança de um caráter permite melhor direcionar e maximizar a exploração da variabilidade genética (Silva et al., 2001). 2.7 EXPRESSÃO DA RESISTÊNCIA E MECANISMOS DE DEFESA DA PLANTA Agrios (2005) explica que os vários genes de resistência (R) de plantas apresentam similaridades estruturais, independente do tipo de patógeno (bactéria, fungo ou vírus) a que ele confere resistência. Aparentemente, a maioria, se não todos, os genes R existem como aglomerados de famílias de genes e são subdivididos em cinco classes, dependendo da sua estrutura e função. Superar o mecanismo de defesa da planta é o atributo crucial para todos os patógenos. Para tal, os microrganismos patogênicos produzem e secretam para o meio extracelular polissacarídeos, toxinas e enzimas. Estas substâncias poderão atuar de forma direta ou indireta, impedindo a função da membrana plasmática ou outras atividades celulares. Por outro lado, as plantas resistentes produzem compostos tóxicos como fenóis, glicosídeos e fitoalexinas e proteínas relacionadas a patogênese como mecanismos químicos de defesa. A produção dos compostos citados acima envolve a percepção da presença do microrganismo, a transmissão dessa informação para as células infectadas e para os tecidos adjacentes e a indução de um grande número de alterações bioquímicas intracelulares, que agem cooperativa e coordenadamente e que culminam com o acúmulo desses metabólitos de defesa e com restrição da invasão do patógeno (Braga, 2008).
  32. 32. (Prabhu & Filippi, 2006c). Esta é uma aplicação da teoria gene a gene de Flor (Leite & Pascholati, 1995; Pascholati & Leite, 1995; Prabhu & Filippi, 2006c). Proteínas relacionadas a patogênese, como β-1-3-glucanases e quitinases, capazes de hidrolisar paredes celulares de fungos são expressas constitutivamente, mas podem ter sua atividade aumentada durante o processo de infecção por patógenos e sua ação, isoladamente ou em conjunto, têm sido associada a decréscimos da invasão por fungos, devido à destruição das hifas invasoras (Braga, 2008). Braga (2008) explica que a taxa de produção β-1-3-glucanases e quitinases difere significativamente em plantas resistentes e susceptíveis a patógenos. Em soja, a ação destas enzimas, além de deter o crescimento de patógenos, determina a liberação simultânea de eliciadores de fitoalexinas. Em tecidos de arroz, existem evidências de que quitinases têm papel similar ao das β-1-3-glucanases na liberação de fragmentos de quitosano.
  33. 33. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA À BRUSONE (Magnaporthe oryzae) NAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1 O experimento foi conduzido sob condições controladas de casa de vegetação e laboratório, no Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão – CNPAF/Embrapa, em Santo Antônio de Goiás, GO, no período de janeiro/2010 a dezembro/2010. Foram utilizadas duas cultivares de arroz irrigado como genitores: Metica-1 e Cica-8. Rangel et al. (1996) descrevem a genealogia destas cultivares. A seleção baseou-se nos estudos anteriores realizados com indução de resistência (Filippi et al., 2007), no histórico destas cultivares e na produtividade de arroz irrigado em condições tropicais. Ambas as cultivares foram utilizadas ora como genitor masculino, ora como feminino, das populações F1, F2 e retrocruzamentos com ambos os genitores. 3.1.1 Obtenção das populações segregantes As cultivares Cica-8 e Metica-1 foram plantadas semanalmente, durante dois meses, em vasos plásticos (Figura 1) contendo 8 kg de solo adubado com 5 g de NPK 5- 30-15, 2 g de sulfato de amônia, 1 g de sulfato de zinco e 3 g de sulfato de amônia, no 15º dia pós-plantio. Os vasos foram mantidos em condições controladas de casa de vegetação até o final do ciclo. No mesmo local foi conduzida a hibridização entre os genitores, a qual se iniciou com emasculação seguido de polinização e amadurecimento.
  34. 34. Figura 1. Plantio das cultivares Metica-1 e Cica-8 para obtenção das populações F1, F2, RC1 e RC2. Para a obtenção das sementes de população F1 (Figura 2), oitenta dias após o plantio, retirou-se as anteras das espiguetas das panículas do genitor feminino, com o auxílio de um emasculador a vácuo. Em seguida, as panículas emasculadas foram protegidas com sacos de papel, para evitar contaminação por pólen indesejado. As panículas do genitor masculino, e que já estivessem liberando pólen abundantemente, foram destacadas e imersas em tubo suspenso ao lado dos vasos contendo as plantas genitoras femininas para posterior polinização. As panículas recém polinizadas foram, então, novamente cobertas por saco de papel, de acordo com metodologia descrita por Coffman & Herrera (1980) e, posteriormente adaptada e descrita por Neves & Taillebois (1990). Para obtenção da população F2 foram plantadas sementes da população F1, cujos
  35. 35. indivíduos foram conduzidos até o final do ciclo, permitindo que ocorresse naturalmente a autofecundação. Figura 2. Sementes de arroz da população F1 obtidas por meio do cruzamento entre as cultivares Metica-1 e Cica-8. Para a obtenção das populações de RC1 e RC2, sementes de F1 foram hibridizados ora com o genitor susceptível ao isolado utilizado (RC1:1), ora com o genitor doador de resistência (RC1:2). Foram obtidas as populações: F1 – 600 sementes; F2 – 1400 sementes; RC1 – 400 sementes e RC2 – 400 sementes. 3.1.2 Identificação do número de alelos de resistência As sementes foram expostas a uma temperatura de 45ºC por 72 horas em estufa sem circulação forçada para superação de dormência. Posteriormente foram esterilizadas utilizando-se álcool 70% (um minuto), solução de hipoclorito de sódio 2% (um minuto) e
  36. 36. água destilada (um minuto) para eliminar qualquer contaminação que pudesse servir de inóculo inicial. O plantio foi realizado em 12 bandejas plásticas contendo 5 kg de solo adubado com 5 g de NPK 5-30-15, 2 g de sulfato de amônia e 1 g de sulfato de zinco. A densidade de semeadura foi de quinze sementes/linha, com posterior desbaste para dez plantas/linha, totalizando trinta plantas do genitor Metica-1, trinta plantas do genitor Cica-8, vinte plantas da geração F1, duzentas plantas da geração F2, cem plantas de cada retrocruzamento, para cada isolado utilizado. Aos 21 dias após o plantio, as plantas foram pulverizadas com solução de inóculo de P. oryzae (Figura 3). Figura 3. Semeio das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2. 3.1.3 Inoculação Foram utilizados os isolados 1049, obtido de cultura monospórica isolada de lesões esporulativas da cultivar Metica-1, pertencente ao patótipo IB-1. De estudos
  37. 37. anteriores, sabe-se que este isolado é compatível com a cultivar Metica-1 e incompatível com a cultivar Cica-8; e 435, obtido de cultura monospórica isolada de lesões esporulativas da cultivar Cica-8, pertencente ao patótipo IB-9. De estudos anteriores, sabe-se que este isolado é compatível com a cultivar Cica-8 e incompatível com a cultivar Metica-1. Ambos isolados são componentes da micoteca do Centro Nacional de Pesquisa Arroz e Feijão – CNPAF/Embrapa. Discos de micélio das colônias, previamente multiplicadas em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar), foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura Aveia (aveia-dextrose-ágar) e incubados em câmara de crescimento por dez dias, à 27ºC, sob regime de luz contínuo. No décimo dia, com o objetivo de estimular a conidiogênese, o micélio aéreo de cada colônia foi removido utilizando-se bastão de vidro estéril, em condições assépticas. As placas, contendo as colônias formando conídio, permaneceram durante 48 horas sob altas condições de umidade e luz contínua. Apenas foram selecionadas as placas que não apresentaram variação morfológica para o preparo da solução de inóculo. A solução de inóculo foi obtida adicionando-se água destilada esterilizada nas placas previamente selecionadas, procedendo-se a remoção dos conídios, com auxílio de pincel estéril, e posterior filtragem da solução. A suspensão obtida foi, então, ajustada para a concentração de 3.105 conídios.mL-1 , com auxílio de câmara de Neubauer e microscópio óptico NIKON Eclipse 55i. Em delineamento experimental inteiramente casualizado, as bandejas, contendo plantas com 21 dias de idade (estádio de 3ª folha completamente formada), foram dispostas em casa de vegetação, agrupadas três a três, aleatoriamente, em gaiolas. Com o auxílio de um atomizador DeVillbis, conectado a um compressor com pressão ajustada para 1,0 Lb.pol-2 , cada gaiola foi pulverizada com 45 mL da suspensão conidial (15 mL por bandeja) até o ponto de escorrimento. Posteriormente, foram incubadas em câmara de orvalho por 24 horas, com temperatura entre 19ºC e 21ºC, seguidos de sete dias com temperatura média de 28ºC e alta umidade (>80%) (Figura 4).
  38. 38. 3.1.4 Identificação dos indivíduos resistentes Decorridos sete dias após a inoculação foi realizada a avaliação fenotípica quanto a resistência à brusone nas folhas, utilizando-se escala visual de notas que varia de zero a nove, em que, notas variando de zero a três indicam reações incompatíveis (resistência específica ou vertical – R), e de cinco a nove reações compatíveis (suscetibilidade – S) (IRRI, 1989). As plantas foram coletadas individualmente e armazenadas em freezer (-20ºC) para posterior aplicação de métodos moleculares. Os tipos de lesões são definidos baseados em uma escala de medição de brusone nas folhas, em casa de vegetação, em que a nota 0 indica ausência de lesão; a nota 1 caracteriza-se por pequenas pontuações marrons, características da reação de hipersensibilidade. As lesões tipo 3 são pequenas, redondas a ovais, necróticas, de cor marrom. Lesões tipo 5 são elípticas, esporulativas, com margem marrom. As lesões do tipo 7 apresentam forma irregular, sem margens distintas. Lesões tipo 9 apresentam coloração branca a azulada, sem margem distinta, coalescendo rapidamente (Figura 5). A B C D
  39. 39. Figura 4. Inoculação das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2 em casa de vegetação. A e B: Disposição das bandejas na casa de vegetação; C: Compressor e D: Atomizador DeVillbis. 3.1.5 Validação experimental A frequência de cada sintoma (R ou S) foi calculada e aplicado o teste de qui- quadrado, como indicado por Snedecor (1970), feita a correção de Yates, como indicado por Strickberger (1971). Os dados foram comparados com as segregações propostas por Mendel e confrontadas com a hipótese do trabalho, sugerindo o número de alelos envolvidos na expressão da resistência qualitativa de cada genótipo.
  40. 40. A B C D E F
  41. 41. Figura 5. Tipos de lesões de brusone em arroz. A: Lesão tipo 0; B: Lesão tipo 1; C: Lesão tipo 3; D: Lesão tipo 5; E: Lesão tipo 7 e F: Lesão tipo 9. 3.2 MÉTODOS MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO Para identificação de marcadores microssatélites ligados ao gene de resistência, foram utilizados os genitores Metica-1 e Cica-8 e as populações F1, F2 resistente e susceptível. Foi utilizado o método CTAB, descrito por Doyle & Doyle, (1987) para extração do DNA (Deoxyribonucleic Acid) os produtos da PCR (Polymerase Chain Reaction) foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante (6%). 3.2.1 Extração de DNA genômico Foram maceradas, em nitrogênio líquido, 200 mg de folhas de cada planta no estádio de 3ª folha, previamente armazenadas em freezer a -20ºC, com auxílio de amofariz e pistilo previamente esterilizados. O macerado foi acondicionado em microtubos de 1,5 mL e posterior adição de 700 µL de tampão de extração (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA; 1,4 M NaCl; 2% CTAB; 1% polivinil e 2% de β-mercaptoetanol), seguido por A B
  42. 42. incubação em banho-maria a 65ºC por uma hora. As proteínas foram removidas utilizando- se como solvente uma solução de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Os ácidos nucléicos foram então precipitados com isopropanol gelado e lavados duas vezes com etanol 70%, uma vez com etanol P.A. (98%), secados em temperatura ambiente e então ressuspendidos em tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) contendo 10 mg/mL de RNAase e incubados em banho-maria a 37ºC por 30 minutos. A concentração de DNA foi ajustada para 10 ng.µL-1 , tendo sido estimada visualmente utilizando-se como padrão DNA lambda, nas concentrações de 50 ng.µL-1 , 100 ng.µL-1 e 200 ng.µL-1 . 3.2.2 Marcadores microssatélites Foram selecionados marcadores microssatélites descritos na literatura relacionados à expressão da resistência de arroz a brusone, descritos na Tabela 1. Tabela 1. Relação dos primers microssatélites selecionados. Marcador Tamanho esperado (bp) Gene Referência 9871.T7E2b 642 Pi5 Suh et al. (2009) yca72 635 Pia Suh et al. (2009) RM224 122 Pi1 Jia & Moldenhauer (2010) OSR32 247 Pita Li et al. (2008) RM7102 170 Pi41 Yang et al. (2009) RM6836 178 Piz Fjellstrom et al. (2006) pBA14 480 Pi9 Liu et al. (2002) RM144 254 Piks Jia & Moldenhauer (2010) RM28130 176 Pi40 Yang et al. (2009) RM1261 167 Pi41 Yang et al. (2009) JJ817 1450 Pi5 Suh et al. (2009) Cada reação continha DNA genômico, tampão de reação 10 X (100 mM Tris- HCl, pH 8,8 e 500 mM KCl), MgCl2 (25 mM), dNTP (2 mM de cada dATP, dGTP, dCTP e dTTP), primer, Taq DNA polimerase, água destilada autoclavada para completar o volume
  43. 43. final de 40 µL da reação e sobreposição de uma gota de óleo mineral para prevenir evaporação, como descrito na Tabela 2. Tabela 2. Reações de PCR para cada marcador microssatélite utilizado. Marcador DNA (ng) Tampão (µl) MgCl2 (µl) dNTP (µl) Primer Forward (µM) Primer Reverse (µM) Taq DNA Pol. (U) 9871.T7E2b 80 4 3 4 0,5 0,5 2 yca72 80 4 3 4 0,5 0,5 2 RM224 100 4 6 4 0,5 0,5 2 OSR32 80 4 3 4 0,5 0,5 4 RM7102 40 4 4 4 0,5 0,5 2 RM6836 75 4 3 4 0,5 0,5 1 pBA14 80 4 3 5 0,5 0,5 1 RM144 100 4 3 4 0,5 0,5 2 RM28130 80 4 3 4 0,5 0,5 2 RM1261 80 4 3 4 0,5 0,5 2 JJ817 80 4 3 4 0,5 0,5 2 A amplificação enzimática foi realizada em termociclador ESCO Swift MaxPro, com programa de amplificação específico para cada marcador. Os programas utilizados estão descritos na Tabela 3. Os produtos de amplificação foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante 6% As imagens foram obtidas utilizando-se aparelho de escâner HP Scanjet 3770. Para a identificação de marcadores ligados aos alelos de resistência ao isolado 1049, nas populações de estudo, procedeu-se três etapas de seleção/avaliação. Na primeira etapa, 11 primers microssatélites, (Tabela 1) foram testados e apenas os que foram capazes de detectar polimorfismo entre os genitores foram selecionados para a etapa seguinte. Tabela 3. Programações dos termocicladores para cada primer microssatélite utilizado. Marcador Programação 9871.T7E2b 4 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC yca72 4 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC
  44. 44. RM224 1 minuto a 94 ºC, 40 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 30 segundos a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC OSR32 5 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 50 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 5 minutos a 72 ºC RM7102 3 minutos a 95 ºC, 29 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 30 segundos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC RM6836 3 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC pBA14 4 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 5 minutos a 72 ºC RM144 5 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC e 2 minutos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC RM28130 3 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC RM1261 5 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC e 2 minutos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC JJ817 4 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC Na segunda etapa, testaram-se os bulks das populações F1, F2 resistente e F2 susceptível, os quais foram compostos de 10 ng de DNA de sete indivíduos de cada população. Portanto, foram preparados bulks resistente e suscetível (Araújo, 2001). Apenas os primers capazes de amplificar o mesmo padrão de polimorfismo nos genitores e nos bulks foram selecionados para a terceira e última etapa. Nesta última etapa de seleção, os primers selecionados acima foram utilizados para amplificação em reações que continham o DNA com cada indivíduo componente dos bulks descritos acima. Portanto, cada primer selecionado participou das seguintes reações de amplificação: a) genitor resistente (1 reação); b) genitor suscetível (1 reação); c) sete indivíduos da população F1 (sete reações); d) sete indivíduos da população F2 resistente e e) sete indivíduos da população F2 suscetível (sete reações). 3.2.3 Análise de ligação Para estimar a distância do marcador microssatélite foram avaliados 204 indivíduos da população F2. A distância foi estimada utilizando o software MAP-MAKER
  45. 45. III, com um lod score mínimo de 3.0 e a função Kosambi de mapeamento (Lander et al., 1987). 3.3 CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO 3.3.1 Plantio da população de estudo Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.2. Foram utilizados nesse estudo os genitores Metica-1 e Cica-8 e populações F2. A densidade de semeadura foi de oito sementes/linha, sendo feito posterior desbaste para cinco plantas/linha, totalizando duzentas plantas para cada isolado utilizado. 3.3.2 Inoculação Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.3. 3.3.3 Coleta das amostras Foram realizadas seis coletas durante uma semana, no mesmo horário, sendo uma coleta/dia, composta de 24 plantas escolhidas ao acaso e identificadas. Uma folha de cada planta selecionada, envolta em papel alumínio previamente identificado (mesmo número de sua planta de origem) e mantida a 4ºC até posteriormente armazenagem em freezer a -20ºC. As plantas foram identificadas, pois no momento em que se iniciou a coleta não se conhecia a reação das mesmas. A coleta 1 foi realizada antes da inoculação; as coletas 2, 3, 4, 5 e 6 foram realizadas com 24h, 48h, 72h, 96h e 120h após a inoculação, respectivamente, tendo sido realizadas no final do período vespertino.
  46. 46. 3.3.4 Identificação dos indivíduos resistentes Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.4. 3.3.5 Construção dos bulks e extração protéica Com os dados da avaliação fenotípica, puderam-se agrupar, por dia de coleta, as amostras que apresentaram reação semelhante (resistência ou susceptibilidade) para construção dos bulks resistentes e susceptíveis, obtendo-se, assim, para cada dia de coleta e para cada isolado, quatro bulks, totalizando 24 bulks por isolado. Para a extração de proteínas totais as amostras de cada bulk foram acondicionadas em almofariz e maceradas em nitrogênico líquido com auxílio de pistilo, previamente esterilizados, até formar um pó finamente dividido. A amostra foi recolhida e processada em microtubo de 1,5 mL, no qual foi adicionado 1000 µL de solução tampão de extração (Tris-HCl 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 2 mM; DTT 2 mM; PMSF 1 mM; Leptina 10 mg.mL-1 e Apotinina 10 mg.mL-1 ) na relação 1:4 (v/v). A suspensão formada foi agitada em agitador tipo vórtex por um minuto e posteriormente centrifugada a 4ºC com uma força de 16000 XG por 30 minutos; o sobrenadante foi transferido para novo microtubo, sendo então repetidas a centrifugação e transferência do sobrenadante por mais duas vezes. O sobrenadante final foi retirado para dosagem de proteínas e ensaios enzimáticos. 3.3.6 Quantificação de proteínas totais e determinação de curva de calibração Para quantificação de proteínas totais, foi adicionado em um microtubo 1,5 ml de reagente de Bradford a 30 µl do extrato protéico de cada amostra e em outro microtubo foi adicionado 1,5 ml de reagente de Bradford a 30 µl de água destilada autoclavada para calibração do aparelho. Os microtubos foram incubados em banho-maria a 40ºC por 15 minutos. As amostras foram então lidas em espectofotômetro SPECTRUM SP-2000 UV
  47. 47. para determinação da absorbância de cada amostra, utilizando comprimento de onda de 595 nm. Para determinar a curva de calibração foram preparados cinco microtubos, cada um contendo reagente de Bradford, água e BSA, uma proteína bovina comercializada de concentração conhecida (1 mg.mL-1 ), em diferentes quantidades. Foram então incubados em temperatura ambiente por 15 minutos e lidos em espectofotômetro SPECTRUM SP- 2000 UV, com comprimento de onda de 595 nm, obtendo-se cinco pontos. Estes pontos foram plotados em planilha do software Microsoft Excel® do pacote Office® para geração de um gráfico de dispersão. A partir da construção do gráfico é possível se obter uma equação da reta, necessária para determinação da quantidade de proteínas totais em cada amostra. De posse da equação da reta, y = 0,154x + 0,089, tem-se que: y = concentração total de proteína na amostra, 0,154 e 0,089 são constantes para essa reta e x = valor de absorbância obtido de cada amostra. A curva de calibração foi construída utilizando os dados descritos no Anexo C. O gráfico gerado pode ser visualizado no Anexo D e os valores de absorbância e concentração de proteínas totais estão plotados no Anexo E. 3.3.7 Ensaio de atividade de β-1,3-glucanase A determinação da atividade de β-1,3-glucanase foi realizada em meio reacional (laminarina 1%, tampão acetato de sódio 1,0 M), com volume final de 500 ml e pH 5,5, em que foram adicionados 100 µl do extrato bruto obtido das folhas dos bulks a 350 µl do reagente. A reação foi incubada em banho-maria a 40ºC por duas horas, sendo então adicionados 1000 µl de DNS e incubada novamente em banho-maria a 100ºC por 20 minutos (Figura 6). As leituras foram feitas em espectofotômetro SPECTRUM SP-2000 UV, utilizando comprimento de onda de 500 nm.
  48. 48. Figura 6. Incubação em banho-maria a 100ºC para ensaio de atividade de β-1,3-glucanase. 3.3.8 Ensaio de atividade de peroxidase A determinação da atividade de peroxidase foi realizada em meio reacional (2,2’-Anzino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, ~ 98% (ABTS) 40%, tampão acetato de sódio 1,0 M). Para cada leitura, foram adicionados na cubeta 2 mL do reagente, 200 µL de peróxido de hidrogênio (H2O2) e 50 µL do extrato bruto obtido das folhas dos bulks. As leituras foram feitas em espectofotômetro SPECTRUM SP-2000 UV, utilizando comprimento de onda de 405 nm. Os dados obtidos foram submetidos à anàlise de variância e teste Tukey, utilizando o procedimento GLM no software SPSS® , versão 16.0.
  49. 49. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA NAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1 4.1.1 Cruzamento: Metica-1 (S) x Cica-8 (R) Observou-se que a cultivar Metica-1, ao ser inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de susceptibilidade em todas as trinta plantas inoculadas. A cultivar Cica-8 apresentou reação de resistência em todas trinta plantas inoculadas (Tabela 4, Figuras 7 e 8). A população F1 do cruzamento entre Metica-1 e Cica-8, inoculada com o mesmo isolado (1049), apresentou reação de resistência em todas as plantas inoculadas (Tabela 4), representada pelas notas 1 e 3 (Figura 9), indicando dominância do caráter resistência. Tabela 4. Frequências esperadas e obtidas das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1:1 e RC1:2, inoculadas com isolado 1049. Geração Número de plantas Freq. Esp. (N)1 Freq. Obs. (N)2 Freq. esp. (%)3 Freq. obs. (%)4 R S R S R S R S Metica-1 30 0 30 0 30 0 100 0 100 Cica-8 30 30 0 30 0 100 0 100 0 F1 20 20 0 20 0 100 0 100 0 F2 200 15 0 50 137 63 75 25 68,5 31,5 RC1:1 82 41 41 31 51 50 50 37,8 62,2 RC1:2 100 10 0 0 79 21 100 0 79 21 Total 462 . . . . . . . . 1 Frequência esperada, valor nominal; 2 Frequência observada, valor nominal; 3 Frequência esperada, valor em porcentagem; 4 Frequência observada, valor em porcentagem;
  50. 50. Figura 7. Frequência de plantas da população Metica-1 para o isolado 1049. Figura 8. Frequência de plantas da população Cica-8 para o isolado 1049. Figura 9. Frequência de plantas da população F1 para o isolado 1049.
  51. 51. A população F2, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de resistência em 137 das duzentas plantas inoculadas (Tabela 4). Observou-se que houve segregação entre os indivíduos da população, com 68,5% das plantas apresentando reações que variam entre as notas 0, 1 e 3, prevalecendo a nota 1 e 31,5% das plantas com reação susceptível variaram entre as notas 5, 7 e 9, com prevalência da nota 7 (Figura 10). Figura 10. Frequência de plantas da população F2 para o isolado 1049. A população RC1:1, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de resistência em 31 das 82 plantas inoculadas (Tabela 4). Em 37,8% (plantas resistentes), observou-se uma variação entre as notas 1 e 3 (Figura 5). Entre 62,2% das plantas susceptíveis, as reações variaram entre as notas 5, 7 e 9, com predominância da nota 7 (Figura 11). A população RC1:2, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de resistência em 79 das cem plantas inoculadas (Tabela 4). Entre 79% de plantas resistentes, houve predominância da nota 1 (Figura 12). Entre as susceptíveis, predominou a nota 7 (figura 6).
  52. 52. Figura 11. Frequência da população RC1:1 para o isolado 1049. Figura 12. Frequência da população RC1:2 para o isolado 1049. 4.1.2 Cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R) A cultivar Cica-8, ao ser inoculada com o isolado 435, apresentou reação de susceptibilidade em 100% das trinta plantas testadas (Tabela 5), observando-se a mesma frequência entre as notas 5, 7 e 9 (Figura 13). A cultivar Metica-1 apresentou 100% de resistência ao isolado 435, das trinta plantas testadas (Tabela 5). Entre as reações observadas, houve predominância da nota 1 (Figura 14). Tabela 5. Frequências esperadas e obtidas das populações inoculadas com isolado 435.
  53. 53. Geração Número de plantas Freq. Esp. (N)1 Freq. Obs. (N)2 Freq. Esp. (%)3 Freq. Obs. (%)4 R S R S R S R S Cica-8 30 0 30 0 30 0 100 0 100 Metica-1 30 30 0 30 0 100 0 100 0 F1 20 20 0 20 0 100 0 100 0 F2 200 150 50 136 64 75 25 68 32 RC1:1 100 50 50 39 61 50 50 39 61 RC1:2 75 75 0 57 18 100 0 76 24 Total 455 . . . . . . . . 1 Frequência esperada, valor nominal; 2 Frequência observada, valor nominal; 3 Frequência esperada, valor em porcentagem; 4 Frequência observada, valor em porcentagem. Figura 13. Frequência da população Cica-8 para o isolado 435. Figura 14. Frequência da população Metica-1 para o isolado 435.
  54. 54. A população F1 do cruzamento Cica-8 x Metica-1, inoculada com isolado 435, apresentou reação de resistência em 100% das vinte plantas testadas (Tabela 5). Entre as plantas resistentes houve predominância absoluta da nota 1 (Figura 15). Figura 15. Frequência da população F1 para o isolado 435. A população F2, inoculada com o isolado 435, apresentou reação de resistência em 68% das duzentas plantas testadas (Tabela 5), com predominância da nota 1 em relação a nota 3 e 0 (Figura 16). Entre as planta susceptíveis observou-se frequência similar entre as notas 5, 7 e 9 (Figura 16). Figura 16. Frequência da população F2 para o isolado 435.
  55. 55. A população RC1:1, inoculada com o isolado 435, apresentou reação de resistência em 39% das cem plantas testadas (Tabela 5), com predominância da nota 1 em relação às notas 3 e 0 (Figura 17). Entre as 61 plantas susceptíveis observadas nesta população, houve predominância da nota 9 (Figura 17). A população RC1:2, inoculada com o mesmo isolado, apresentou reação de resistência em 76% das 75 plantas testadas (Tabela 5). Entre as plantas resistentes houve predominância da frequência da nota 1, enquanto entre as plantas susceptíveis houve frequência similar entre as notas 5, 7 e 9 (Figura 18). Figura 17. Frequência da população RC1:1 para o isolado 435. Figura 18. Frequência da população RC1:2 para o isolado 435.
  56. 56. Os dados foram submetidos ao fator de correção de Yates e procedida a análise de χ2 (∑[(|o - e|-0,5)2 /e]) e teste F descritos na Tabela 6, devido o teste ser aplicado com apenas um grau de liberdade, como recomendado por Strickberger (1971). Tabela 6. Teste de χ2 e significância para as frequências esperadas para as populações inoculadas com isolado 1049 e 435. Isolado População Frequência esperada (R:S) χ² F 1049 F2 3:1 4,167 0,041227 * 1049 RC1:1+ 1:1 4,402 0,035888 * 1049 RC1:2++ 1:0 4,203 0,040364 * 435 F2 3:1 4,860 0,027486 * 435 RC1:1+ 1:1 4,41 0,035729 * 435 RC1:2++ 1:0 4,083 0,043308 * + Retrocruzado com genitor susceptível; ++ Retrocruzado com genitor resistente; * Significância a 5% de probabilidade. Para a população F2, do cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R), tendo, portanto, Metica-1 como doador de resistência, inoculada com o isolado 1049, observou-se que a segregação 3:1 apresentou significância, indicando que as frequências obtidas não diferem significativamente das frequências esperadas. Assim, o caráter resistência na cultivar Metica-1 é controlado por um par de alelos dominantes. Este resultado foi confirmado na população RC1:1 ao apresentar uma segregação de 1:1 e na população RC1:2, apresentando segregação de 1:0 (Tabela 6). As segregações entre as plantas resistentes e susceptíveis na população F2, do cruzamento Metica-1 (S) x Cica-8 (R), em que Cica-8 foi o genitor doador de resistência, inoculada com o isolado 435, foi melhor explicada pela hipótese de um par de alelos. A razão esperada de 3:1 não diferiu estatisticamente da razão obtida. Este resultado foi confirmado nas segregações obtidas em RC1:1 e RC1:2 (1:1 e 1:0, respectivamente) (Tabela 6).
  57. 57. Na caracterização fenotípica foi possível identificar que a resistência das cultivares Metica-1 e Cica-8 são controladas por um gene, diferentes entre si, com um par de alelos dominantes cada, e segregam de forma independente. Estudos da herança da resistência à brusone em arroz vêm sendo conduzidos desde a década de 60 por Kiyosawa. Esta metodologia de cruzamento de genitor resistente com suscetível também é utilizada para identificar genes de resistência, como por exemplo: Pi-a, Pi-k, Pi-km , Pi-m, Pi-ta, Pi-z, Pi-i, Pi-zt , Pi-kh , Pi-b, Pi-t, localizados em sete loci: Pi-k, Pi-ta, Pi-a, Pi-i, Pi-z, Pi-b, Pi-t. Em 1961, Hsieh et al., citado por Silva, 1993, estudando vários cruzamentos e várias raças de brusone, concluíram que a maioria das cultivares possui um par de alelos dominantes de resistência, reforçando a proporção obtida de 3:1, em que dois alelos dominantes atuam na expressão da resistência. Yu et al. (1986), avaliando a resistência genética em cinco cultivares melhoradas e quatro tradicionais a três isolados de brusone, encontraram proporções fenotípicas de 15:1 (R:S) e 3:1 (R:S), com predominância desta última, concluindo que a resistência à brusone pode ser controlada por um ou dois genes dominantes. Este resultado demonstra que a herança da resistência à brusone ocorre de forma simples, sendo então, a variabilidade natural encontrada na população de M. oryzae o complicador para o estabelecimento de cultivares com resistência durável. 4.2 MARCADORES MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO Onze marcadores microssatélites foram inicialmente testados nos genitores Metica-1 e Cica-8. Entre eles, quatro marcadores (RM224, RM7102, RM1261 e yca72) amplificaram o polimorfismo, diferenciando o genitor resistente do susceptível (Figura 19).
  58. 58. Figura 19. Padrão de amplificação nos genitores Metica-1 e Cica-8, apresentado por onze marcadores em gel de poliacrilamida desnaturante (6%). Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8). Marcadores microssatélites: 9871.T7E2b, RM224, RM7102, OSR32, RM144, RM6836, RM1261, JJ817, yca72, pBA14 e RM28130. Os quatro marcadores polimórficos foram, então, testados nos bulks das populações segregantes F2 resistente e F2 susceptível e F1 (Figura 20). Foi possível
  59. 59. detectar uma mesma amplificação nos bulks, verificada nos genitores, em três marcadores (RM224, RM1261 e RM7102). Apenas o marcador RM7102 apresentou padrão de amplificação e polimorfismo esperados, ou seja, a amplificação observada no genitor resistência repetiu-se nos bulks F1 e F2 resistente, apresentando bandas polimórficas com 170 e 190 pares de base, sendo, então, testado nos sete indivíduos componentes de cada bulk. Figura 20. Padrão de amplificação observada em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) para os primers RM224, RM7102, RM1261 e yca72 nos bulks das populações F1 e F2 resistente e susceptível. Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de MM M M
  60. 60. resistência ao isolado 1049 (Cica-8); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível. Foi possível observar nos indivíduos F1-1 a F1-7, testado com o marcador RM7102, a presença de duas bandas, uma superior, semelhante à observada no genitor Cica-8, resistente ao isolado 435, com 190 pares de base (pb), e uma inferior, com 170 pb, semelhante à observada no genitor Metica-1, susceptível a este isolado. Este padrão de amplificação é condizente com sua condição de heterozigoto (Figura 21). Os indivíduos da população F2 resistente (F2R1 a F2R7) obtiveram o mesmo padrão de amplificação para o marcador microssatélite RM7102, em que todos apresentaram ambas as bandas, indicando que estes sete indivíduos também são heterozigotos. Os indivíduos F2 susceptíveis apresentaram apenas a banda inferior (170 pb), semelhante ao genitor Metica-1 (susceptível). Este padrão de amplificação sugere que a banda superior (190 pb) está associada à resistência ao isolado 1049, observado nesta população, e que a banda inferior, possivelmente um alelo recessivo, está associada à susceptibilidade herdada do genitor Metica-1 (Figura 21). Através da análise de ligação, verificou-se que este marcador está ligado ao gene de resistência a uma distância de 2,2 cM. Figura 21. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) nos indivíduos das populações F1, F2 resistente e F2 susceptível pelo marcador RM7102. M: Ladder 10 bp; números 1 a 7: indivíduos do bulk F1; números 8 a 14: indivíduos do bulk F2 resistente; números 15 a 21: indivíduos do bulk F2 susceptível. M M

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