Determinação de proteína bruta em vitro.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO NORTE DO TOCANTINS – UFNT
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS - CCA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO INTEGRADO EM ZOOTECNIA NOS TRÓPICOS
- PPGIZT
Determinação de Proteina Bruta
Dra. Luiza de Nazaré Carneiro da Silva
Araguaína, 2024

Compostos nitrogenados presentes nos alimentos
Proteina
Aminoácidos
Aminas
Amidas
Amônia
Ureia
Nitrato
Nitrito
Bases
nitrogenadas
Lecitinas
Peptídeos

Teor de N nas proteínas
16g de N para cada 100g de
proteina

Determinação de Proteína
Se o método de Kjedahl
determina N
Se o teor de N nas proteínas é
razoavelmente constante
O teor de proteína pode
ser estimado com base no
teor de N

Fator de conversão
PB contém em média 16% de N
100 g de Proteína --------------------- 16 g de N
X g de Proteína ------------------------ 1 g de N
100 x 1
16
= 6,25
X = Fator de conversão

Proteína Bruta
O termo Proteína Bruta (PB) envolve um
grupo de substâncias com estruturas
semelhantes, porém com funções
fisiológicas muito diferentes
PB: NNP + PV

Método de Kjedahl
1. Digestão da amostra em ácido sulfúrico, que resulta em
transformação do N em amônia (NH3);
2. Destilação da amônia em uma solução receptora;
3. Quantificação da amônia por Titulação com uma solução
padrão.

1. Digestão
Digestão: Aquecimento com ácido sulfúrico e catalizador
Sulfato de sódio ou potássio + Sulfato de cobre
Aumentar o ponto de
ebulição
Aumentar o poder de oxidação do
meio
H2SO4
Matéria orgânica
(NH4)2SO4 + CO2 + H2O

(NH4)2SO4 + CO2 + H2O
Matéria
orgânica
H2SO4
N de
diversas
formas
+
Aquecimento
+ Mistura catalítica
1. Digestão
Bastante estável mas
não quantificável
Digestão: Aquecimento com ácido sulfúrico e catalizador

2. Destilação
(NH4)3B3
Destilação: Transformação (NH4)2SO4 em NH3 gasoso e recebido
em meio ácido
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
NH4 + H3BO3
Volátil mais
facilmente
quantificável
Sal borato de
amônio
Ácido bórico
Aquecimento e
condensação
Cor verde, pH
alto.
Cor rosa
violeta

3. Titulação
(NH4)3B3
Titulação: Reversão do pH causada pelo entrada de NH3 na solução
de ácido bórico
Titulação com Ácido
clorídrico (HCl)
Sal borato de
amônio
Adição de HCl até
retorno da cor rosa
inicial
Cor verde, pH
alto.
Mensuração do
N da amostra
pH revestido
ao inicial
OBS: sempre fazer o teste branco

Reagentes para determinação de N
Mistura
Catalítica
Ácido bórico com
indicador de pH
Solução de
padronização do HCl

Mistura catalítica
 Relação 10: 1
 Sulfato de sódio / potássio (10) : Sulfato de cobre (1)
100 g de Na2SO4 ---------------------- 10 g CuSO4

Hidróxido de sódio
- 1 kg de NaOH : 2 L de solução;
- Tomar cuidado: Realizar procedimento em capela de exaustão;
- Adição de água e agitação aos poucos;
- Armazenar em recipiente de plástico, pois corrói o vidro.
50% do volume

Indicadores do pH
Vermelho de metila
Verde de bromocresol
- 60 ml de álcool etílico + 0,1 g de vermelho de metila
- Agitar até diluir
- Completar 100 ml
- 60 ml de álcool etílico + 0,1 g de verde de bromocresol
- Agitar até diluir
- Completar 100 ml

Ácido bórico
- 20 g de ácido bórico
- 12,5 de solução alcoólica de vermelho de metila
- 6 ml de solução alcoólica de verde de bromocresol
- Adicionar e diluir um por vez em balão com 500 ml
de água destilada
- Depois completar 1 litro
Para 1 L

Solução de HCl a 0,05N
- Adicionar 4,14 ml de HCl P.A. no balão com 500 ml de água
destilada;
- Misturar/diluir e completar para 1 litro.
Solução de padronização do HCl a 0,05N
- Adicionar 2,65 ml de carbonato de sódio Na2CO3 em 1 litro de
água destilada;
- Reservar 25 ml desta solução de padronização e adicionar 5 gotas
de solução alcoólica de verde de bromocresol;

Padronização do HCl a 0,05N
- Reservar 25 ml desta solução de padronização + 5 gotas de solução alcoólica de
verde de bromocresol;
- Titular esta solução de padronização com a solução de HCl a 0,05 até a viragem
de cor para verde;
- Anotar o valor titulado em ml (ex: 25,9 ml);
- Calcular a Normalidade verdadeira e o Fator de correção

Fator de correção
f =
Nv
Ne
• F: Fator de correção da normalidade
do HCl;
• Nv: Normalidade verdadeira da
solução de HCl;
• Ne: Normalidade esperada da
solução de HCl: 0,05.
f =
0,0483
0,05
f = 0,966

Determinação de N
Tubos de ensaio
limpos secos e
identificados
Pesar 0,3 g da
amostra e colocar
no tubo de ensaio
Adicionar 2 g de
mistura digestora
catalítica
Adicionar 5 ml de
ácido sulfúrico
P.A. concentrado

Determinação de N
Levar ao bloco
digestor dentro da
capela de exaustão
Temperaturas – Tempo
100 °C – 30 min
150 °C – 30 min
200 °C – 30 min
250 °C – 30 min
300 °C – 30 min
350 °C – 30 min
Até esverdeamento da
amostra
Aumentar
temperatura
gradativamente até
400 °C

Determinação de N
Retirar da capela
quando os tubos
esfriarem
Para evitar ou
minimizar o
processo de
cristalização
Adicionar aprox. 10
ml de água destilada
e misturar no vórtex

Determinação de N
Adicionar 10 ml
de ácido bórico no
Erlenmeyer
Adicionar 25 ml de
hidróxido de sódio
Acoplar o tubo
Retirar o
Erlenmeyer até
completar de 100 ml
de volume destilado

Determinação de N
Cuidados:
- Ligar a drenagem de água do
destilador;
- Ligar o aparelho e ajustar a
temperatura;
- Verificar o nível de água da
caldeira (aquecimento);
- Fazer limpeza (tubo com água)
entre amostras diferentes;
- Ao finalizar, realizar limpeza do
equipamento.

Determinação de N
Titular com HCl até a
viragem de cor para o
rosa violeta
Anotar o volume de
HCl, a normalidade e
o fator de correção

Amostra %ASE
Peso
amostra
Volume
total
Volume
branco
Volume
real
Nv f
%N
ASA
%N
ASE
%PB
MS
Média
Concen. 93,39 0,3016 20,4 0,3 20,1 0,048 0,966 4,32 4,62 28,91
29,61
Concen. 93,39 0,3023 21,4 0,3 21,1 0,048 0,966 4,53 4,85 30,31
Volume real (titulação): Volume total – Volume branco
%N ASA: (Volume real x Nv x f x 0,014)
%NMS :
Peso da amostra
X 100
%NMS
% ASE
%PBMS :
%N ASA
x 6,25
Determinação de N
X 100

IMPORTANTE
DEIXAR TODAS AS VIDRARIAS
E EQUIPAMENTOS LIMPOS
APÓS O USO

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