Este documento descreve um estudo sobre o cultivo da microalga Phaeodactylum tricornutum em condições mixotróficas, com a adição de glicerol como fonte de carbono orgânico. Foram realizados três tratamentos: controle sem glicerol, glicerol adicionado no início do cultivo, e glicerol adicionado diariamente. A adição de glicerol ocasionou um aumento de 31,6% na concentração de biomassa seca em relação ao tratamento controle. Isso sugere que cultivos

1. CULTIVO DE MICROALGA COM ADIÇÃO DE GLICEROL EM
CULTIVOS MIXOTRÓFICOS EM FOTOBIORREATORES PARA
PRODUÇÃO DE BIOMASSA COM FOCO EM BIOCOMBUSTÍVEIS
Keli Cristiane Correia Morais1, Kassiana Ribeiro2, Robert Luis Lara Ribeiro3, David Alexander Mitchell4, José
Viriato Coelho Vargas5, André Bellin Mariano6
1
Bióloga, Mestranda do PIPE., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – biokeli2000@gmail.com
2
Graduanda de Biologia, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – kassi.ribeiro@hotmail.com
3
Matemático, M.Sc., Doutorando do PIPE., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – robertlarabr@yahoo.com.br
4
Microbiologista, PhD., Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – davidmitchell@ufpr.br
5
Engenheiro Mecânico, PhD., Departamento de Engenharia Mecânica, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – jvargas@demec.ufpr.br
6
Farmacêutico Bioquímico–Industrial, D.Sc., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – andrebmariano@gmail.com
RESUMO
A produção de biomassa de microalgas precisa de muitos aprimoramentos na tecnologia para permitir a
produção viável de biocombustíveis. O Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Energia Auto-Sustentável da
UFPR desenvolveu um Fotobiorreator Tubular Compacto de 10 m3 com características para maximizar o
aproveitamento de luz e CO2. Entretanto, muitos estudos ainda são necessários para desenvolver o meio de
cultivo adequado. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de biomassa da microalga
Phaeodactylum tricornutum em cultivos mixotróficos, nos quais existe a adição de uma fonte de carbono
orgânico complementando o CO2 fixado pela fotossíntese. O nutriente escolhido foi o glicerol, atualmente um
subproduto do processo de produção de biodiesel. Foram realizados três tratamentos: a) controle (sem adição de
glicerol), b) glicerol 0,15 M adicionado no início do cultivo, e c) glicerol em adições sucessivas durante todo o
cultivo equivalente a 0,15 M. O experimento foi realizado em sala de cultivo de microalgas sob condições pré-
determinadas e constantes. A adição de carbono orgânico ocasionou aumento da concentração de biomassa de
31,6%. Este resultado sugere que cultivos mixotróficos apresentam-se como uma viável alternativa do uso do
glicerol, permitindo o aumento da produtividade de biomassa e óleo para produção de biocombustíveis.
Palavras-chave: microalga, mixotrófico, glicerol, biomassa, biocombustíveis, Phaeodactylum tricornutum
ABSTRACT
Cultivation of microalgae with the addition of glycerol in mixotrophic conditions in photobioreactors for
production of biomass with emphasis on biofuels. Biomass production of microalgae needs many technological
improvements in technology to enable viable production of biofuels. The Center for Research and Development
of Sustainable Energy (NPDEAS) at UFPR developed a compact tubular photobioreactors of 10 m 3 with features
to maximize the utilization of light and CO2. However, many studies are still needed to develop the appropriate
culture medium. The objective of this study was to evaluate the biomass production of microalga Phaeodactylum
tricornutum in mixotrophic cultures, with the addition of an organic carbon source. Glycerol was chosen as the
additive nutrient to complement the CO2 fixed by photosynthesis. Glycerol was chosen because it is a byproduct
of the current biodiesel production process. Three different treatments were evaluated: a) control (without
glycerol), b) glycerol (0.15 M) added at the beginning of cultivation, and c) successive additions of glycerol
throughout the growing season equivalent to 0.15 M. The experiment was conducted in a microalgae cultivation
room under constant and predetermined conditions. The addition of organic carbon caused a 31.6% increase in
the concentration of biomass. This result suggests that mixotrophic cultivation is a viable alternative to the use of
glycerol, enabling increased productivity of biomass and oil for biofuel production.
Keywords: microalga, mixotrophic, glycerol, biomass, biofuels, Phaeodactylum tricornutum
INTRODUÇÃO
A diversificação da matéria-prima para a produção de biodiesel vem sendo incentivada pelo Programa
Nacional de Produção de Biodiesel (PNPB). Desta forma, as microalgas cultivadas em fotobioreatores são foco
de estudo do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento em Energia Auto-Sustentável (NPDEAS) por apresentarem
elevada produtividade e vantagens em relação às oleaginosas como: biomassa homogênea, maior eficiência

2. fotossintética, baixo custo com transporte e ainda por não concorrer por terras agriculturáveis. O
desenvolvimento dos fotobioreatores pelo NPDEAS envolve numerosas etapas, como a preparação da estrutura
do fotobiorreator (FBR), composição do meio de cultivo, escolha de microalgas e sua composição, operações
unitárias de separação, secagem e extração de óleo, produção de biodiesel, análise da qualidade de biodiesel por
método computacional, biodigestor, unidade trigeradora, resíduos e a implementação de softwares (MARIANO
et al. 2009).
As microalgas são microrganismos fotossintéticos que requerem nutrientes relativamente simples e cuja
biomassa pode ser empregada para obtenção de biocompostos, como suplemento alimentar humano e animal ou
fonte de biocombustíveis (ANDRADE & COSTA, 2008). A microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin,
1897 é uma das microalgas que tem sido estudada pelo nosso grupo de pesquisa por apresentar teor lipídico em
sua estrutura, podendo ser empregada na produção de biocombustíveis. Em cultivo de microalgas, a fonte de
nutrientes é o componente de importância considerável devido ao elevado custo de produção. A fonte de carbono
adicional a estes cultivos possibilita maior rendimento em biomassa, já que haverá maior disponibilidade de
carbono além do produzido via metabolismo fotossintético. A estimulação do crescimento de P. tricornutum
com adição de glicerol foi verificada e a biomassa seca foi quantificada. (CERÓN GARCIA et al, 2006;
CAMACHO et al, 2000). O glicerol é uma fonte de carbono interessante em cultivos mixotróficos onde o foco é
a produção de biodiesel devido a sua disponibilidade resultante do processo de transesterificação. Nesta
pesquisa, foi utilizada para o cultivo mixotrófico a microalga Phaeodactylum tricornutum que confere alta
densidade lipídica em sua estrutura, possibilitando assim produzir grandes quantidades de biodiesel
(LOURENÇO, 2006). Cultivos em condições mixotróficas para variadas espécies de microalgas têm sido
estudados (CERÓN GARCIA et al, 2006; ANDRADE & COSTA, 2008; RADMANN, 2009), no entanto, este
trabalho discute a influência das diferentes maneiras de adicionar o glicerol durante o cultivo para que se obtenha
máxima concentração de biomassa. São encontrados poucos trabalhos que estudaram a microalga
Phaeodactylum tricornutum, em condições mixotróficas, no entanto, estes demonstram melhor rendimento de
biomassa do que em cultivos autotróficos, podendo duplicar a biomassa em relação ao experimento controle
(GARCIA et al, 2005).
MATERIAIS E MÉTODOS
A microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin 1897, gentilmente cedida pelo Grupo Integrado de
Aquicultura da UFPR para o NPDEAS, foi cultivada em sala de cultivo climatizada. O NPDEAS tem o objetivo
de produzir biodiesel a partir de microalgas cultivadas em fotobiorreatores compactos, para tanto se faz
necessário realizar cultivos experimentais com as espécies. O cultivo em batelada nos traz resultados
promissores de modo a otimizar o meio e aumentar a produtividade em biomassa. A Figura 1 exemplifica de
forma ilustrativa o significado do metabolismo mixotrófico como sendo a interação dos metabolismos
heterotróficos e autotróficos. Além da luz necessária para que a célula produza energia através do CO 2 e de H2O
através do processo de fotossíntese é fornecido carbono na forma orgânica (glicerol, glucose, acetato) resultando
assim no metabolismo mixotrófico.
O cultivo mixotrófico foi testado neste trabalho utilizando o glicerol como fonte de carbono. Os
experimentos foram realizados em duplicata e o planejamento pode ser visto na Tabela 1.
No experimento 1 foi adicionado glicerol diariamente, sendo o volume correspondente a concentração
de 0,15M dividida pelo número de dias de cultivo, no experimento 2 a adição de todo o volume de glicerol foi
feita no início do cultivo e no experimento 3 não houve adição de glicerol, resultando no experimento controle.
A cultura foi realizada em erlenmeyers com capacidade de 2 litros num volume de 1,8 litros, mantidos em
ambiente de temperatura de 18 a 20 ºC sob aeração constante com fluxo de ar atmosférico de 2,7 L/min em cada
erlenmeyer. A intensidade luminosa de 5500 lux foi mantida por lâmpadas fluorescentes de 40W em fotoperíodo
integral. O meio de cultura F/2 Guillard modificado foi preparado em água do mar padronizada em 15‰ e
posteriormente autoclavados. A composição do meio Guillard F/2 modificado encontra-se na Tabela 2. Somente
após atingirem temperatura ambiente o glicerol na concentração 0,15M foi adicionado. Foi escolhida esta
concentração de glicerol em decorrência de experimento prévio realizado em diferentes concentrações de
glicerol.
O inóculo inicial dos experimentos foi padronizado a 30.10 4 cel/mL de acordo com Soares (2010) com o
objetivo de atingir a densidade celular máxima, minimizando efeitos do autosombreamento, sendo assim, o
inóculo inicial em todos os experimentos foi de aproximadamente 100mg/L. Em trabalhos com cultivos
mixotrófico de Cerón García (2000) a concentração de biomassa para inoculação foi entre 70-100mg/L.

3. Figura 1 – Metabolismo das microalgas: (A) Representação da fotossíntese e destinos metabólicos da glucose no
metabolismo celular; (B) Diferenças entre os metabolismos autotróficos, heterotróficos e mixotróficos.
Figure 1 – Microalgae metabolism: (A) Photosynthesis and metabolic destinations of glucose in cellular
metabolism; (B) Differences between autotrophic, heterotrophic and mixotrophic metabolisms.
Tabela 1 – Condições experimentais dos cultivos de microalga
Table 1 – Experimental conditions of microalgae cultivation
Experimentos Concentração de Glicerol Maneiras de adição de glicerol
1 0,15 M Adicionado diariamente
2 0,15 M Adição no início do cultivo
3 0M Sem adição de glicerol
A determinação de biomassa seca foi realizada de dois em dois dias, durante 16 dias. Foi coletado 150
mL do meio para que a biomassa seca pudesse ser quantificada em triplicata. Para isso, foi filtrado 50mL do
meio de cultivo em papel filtro quantitativo com auxílio de bomba à vácuo, como pode ser vista na Figura 2a. Os
papéis filtros foram mantidos em estufa a 60ºC até que o peso se mantivesse constante. A biomassa seca foi
estimada através da diferença da massa do papel antes e depois da filtragem, os papéis quantitativos com a
biomassa são apresentados na Figura 2b.

4. Tabela 2 – Composição do meio Guillard F/2 modificado.
Table 2 – Composition of Guillard F / 2 modified medium.
Solução Para cada 1litro de água foi adicionado:
1,0 ml de solução de N e P  75,0g de Nitrato (NaNO2);
(Nitrato e Fosfato)  5,0g de Fosfato (Na2HPO4.7H2O);
 5,50g de EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O);
 4,00g de Cloreto de Ferro (FeCl3.6H2O);

1,0 ml de solução de Trabalho de 0,18g de Cloreto de Manganês (MnCl2.4H2O);
Metais  10,0mL de solução Estoque de Metais.
 50,0g de Tiamina (Vitamina B1)
 0,5g de Biotina (Vitamina H);
1,0 ml de solução de Vitaminas  0,5g de Cianocobalamina (Vitamina B12);
0,75 ml de Solução de Silicato 30,0g de Silicato de Sódio Alcalino;
5,0 ml de Solução de TRIS  90,0g de TRIS (Tris Hidróximetil Amino Metano);
 60,0mL de Ácido Clorídrico;
 850,0mL de água destilada.
Figura 2 – Determinação da biomassa seca de microalgas: (a) aparato experimental; (b) aspecto das amostras.
Figure 2 – Determination of dry biomass of microalgae: (a) experimental apparatus, (b) samples aspects.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Produção de biomassa seca de P. tricornutum
A concentração de biomassa seca da diatomácea P. tricornutum determinada de dois em dois dias
durante os cultivos com glicerol adicionado diariamente (Exp. 1), no início do cultivo (Exp.2) e o experimento
controle, sem adição de glicerol (Exp. 3), são apresentados no Figura 3. Os valores médios de concentração
máxima a cada dois dias são apresentados na Tabela 3, expressos no decorrer de horas de cultivo. A
concentração máxima de biomassa obtida no cultivo mixotrófico foi de 1,294g/L no experimento onde o glicerol
foi adicionado no início do cultivo. Enquanto isso, no cultivo autotrófico a biomassa seca máxima obtida foi de
0,88 g/L. O cultivo mixotrófico com adição diária de glicerol foi 23,11% maior que o cultivo autotrófico, já o
cultivo com adição de glicerol no início apresentou biomassa 31,6% maior que o controle.
A evolução da biomassa seca no decorrer de 192 h de cultivo apresentada na Figura 3, mostra que
houve melhor assimilação do carbono orgânico nos cultivos onde esta fonte foi adicionada no início,
apresentando diferença de 12% em acréscimo ao cultivo onde o glicerol foi adicionado diariamente. As curvas
apresentaram bastante semelhança, mas ficou perceptível a diferença de concentração entre os cultivos
mixotróficos e autotróficos.

5. Tabela 3: Biomassa seca média obtida nos cultivos mixotróficos e autotrófico (g/L)
Table 3: Average dry biomass obtained in cultures mixotrophic and autotrophic (g/L)
Tempo (h) Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3
0 0,100 0,100 0,100
24 0,178 0,201 0,114
48 0,227 0,272 0,204
72 0,377 0,386 0,274
96 0,477 0,5111 0,387
120 0,656 0,804 0,593
144 0,731 0,848 0,636
168 0,893 1,013 0,746
192 1,151 1,294 0,885
Figure 3 – Efeito da adição de glicerol na produção de biomassa seca de P. tricornutum em cultivo de 16 dias.
Figure 3 – Effects of glycerol on dry biomass production of P. tricornutum in cultivation for 16 days.
Produção de biomassa em fotobiorreator tubular compacto
O NPDEAS desenvolveu um fotobiorreator tubular compacto de 10 m3 de capacidade para cultivo de
microalgas com foco na produção de biocombustíveis. FBR apresenta dimensões de 8 m de altura x 2 m de
largura x 5 m de comprimento. A Figura 4 apresenta a fotografia do primeiro módulo construído. Os resultados
apresentados com aumento de biomassa seca em decorrência do uso de glicerol nos cultivos realizados nos
erlenmeyers de 2 litros mostram-se muitos significativos para que futuramente o cultivo mixotrófico seja
empregado nos fotobiorreatores construídos no NPDEAS. Sendo assim, teremos possibilidade de aumentar a
produtividade ao substituir o cultivo autotrófico pelo cultivo mixotrófico.
O interesse em saber qual a influência do uso do glicerol no início e durante o cultivo se deve ao fato de
que nos fotobiorreatores os cultivos podem ser realizados em regime contínuo, semicontínuo, ou em batelada.
No primeiro teste que será realizado no fotobioreator, será adotado o regime em batelada, sem diluição com a
introdução de novo meio que se dá após alguns dias quando as microalgas atingem a taxa máxima de
crescimento. De acordo com os resultados obtidos neste experimento pode-se concluir que o regime de em
batelada com adição de glicerol no início do cultivo nos fotobioreatores pode atingir uma produtividade de
aproximadamente 30% a mais, que num cultivo autotrófico. Novos experimentos são necessários para avaliação
dos efeitos do glicerol em regimes de cultivo contínuos e semicontínuos.

6. Figure 4 – Fotobioreator construído no NPDEAS
Figure 4 – Photobioreactor built in NPDEAS
CONCLUSÃO
A concentração de biomassa da microalga Phaeodactylum tricornutum pode ser aumentada pela adição
de glicerol como fonte de carbono orgânico. Esse fato comprova a capacidade metabólica dessa microalga de
converter fontes orgânicas de carbono em biomassa. A maior concentração de biomassa (1,29g/L) foi obtida com
adição de glicerol na concentração de 0,15M ao meio de cultivo, em modo batelada, com iluminação de 5500lux
em meio Guillard modificado. Assim, os resultados indicam que a produção de glicerina proveniente do processo
de biodiesel pode ser aproveitada para obtenção de biomassa da microalga P. tricornutum com melhores
resultados que o cultivo autotrófico. Sugere-se que o mesmo experimento seja realizado em regime de
fotoperíodo de 12 horas e que adição de fonte de carbono seja realizada no início do ciclo noturno, deixando
carbono disponível para a microalga não sendo necessário que ela consuma sua reserva. Estudos com glicerina
bruta proveniente do processo de produção de biodiesel também são indicados.
AGRADECIMENTOS
O NPDEAS agradece ao CNPq, CAPES e Nilko Metalurgia Ltda. pelo financiamento das pesquisas, a
UFPR pela infraestrutura e ao Grupo Integrado de Aquicultura (GIA – UFPR) pelo espaço de trabalho e preparo
do inóculo.
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