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temperaturas letais inferiores ou superiores para uma determinada espécie. Logo, aprimeira etapa para se otimizar a produç...
4) Esterilidade, crescimento e sobrevivência - 0 interesse que os triplóides têmdespertado na piscicultura devese a dois t...
se evitar a reprodução da carpa capim surgiu quando, em 1978, se verificou que aprogênie híbrida F1 entre fêmeas de carpa ...
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produzem espermatozóides diplóides e, assim,os zigotos resultantes seriam diplóides.Desse modo, em 1990 foram produzidas n...
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Tabela 5 - Esquema geral do protocolo para a produção de linhagens monossexuais de             fêmeas em espécies de peixe...
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terceira etapa, realizar um teste de progênie para identificar os supermachos, guardaressas linhagens, e descartar as linh...
Para identificar os machos revertidos ZW, é necessário, numa segunda etapa,realizar o teste de progênie. Os machos que pro...
3) DNA repetitivo interdisperso - é uma categoria de DNA nuclear constituída porelementos repetitivos longos (LINE) e curt...
5) RAPD("random amplífied polymorphic DNA")- consiste de regiões arbitrárias doDNA, mas de seqüências conhecidas, constitu...
complexos plasmídios-genes a serem transplantados. Os plasmídios são então isolados epurificados e o gene que interessa é ...
desligam em situações determinadas e, também, estes tipos de genes precisam sertransplantados junto com os genes estrutura...
pesquisa em engenharia genética deve ficar mais restrita a instituições de pesquisa e acompanhias agroindustriais. Além di...
ocorrem cruzamentos entre fêmeas diplóides e machos triplóides, haverá uma perda totalda descendência, o que poderia reduz...
perturba a coadaptação biológica historicamente estabelecida nas populações selvagense leva ao decréscimo do tamanho popul...
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  1. 1. ÍNDICE1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................22. MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES...............................................2 2.1 Triplóides Puros e Híbridos ...........................................................................3 2.2 Haplóides e Tetraplóides ...............................................................................8 2.3 Ginogenéticos................................................................................................9 2.4 Androgenéticos............................................................................................123. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES...................................................................13 3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais ..........................................................13 3.2 Produção de Supermachos .........................................................................16 3.3 Produção de Superfêmeas ..........................................................................174. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENÉTICA, ......185. ENGENHARIA GENÉTICA EM PEIXES ...........................................................20 5.1 Produção de Transgênicos..........................................................................20 5.2 Contribuição dos Transgênicos em Projetos de Piscicultura .......................226. RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS DE LINHAGENS DE PEIXESGENETICAMENTE MANIPULADOS ....................................................................23 6.1 Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas..........23 6.2 Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas ..........................25 6.3 Riscos Potenciais dos Transgênicos ...........................................................267. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................27
  2. 2. 1. INTRODUÇÃO No decorrer da última década, a contribuição da genética para a pisciculturamoderna tem abrangido o emprego das técnicas mais recentes usadas em biotecnologiae engenharia genética. Algumas dessas biotecnologias genéticas, como as quepossibilitam a manipulação cromossômica, podem ser usadas também em plantas, porémnão ainda em aves e mamíferos. Outras, como as que permitem a transferência de genes,vêm sendo aplicadas tanto em peixes e outros organismos, como em plantas. No presente trabalho são apresentadas e comentadas as principaisbiotecnologias genéticas atualmente aplicadas à piscicultura. Inicialmente é discutida aprodução de peixes triplóides, tetraplóides, haplóides, ginogenéticos e androgenéticos. Aseguir, são resenhados vários procedimentos para a obtenção de linhagens deneomachos, neofêmeas, supermachos e superfêmeas. Os principais objetivos teóricosdos tópicos 2 e 3 deste trabalho são a produção de linhagens de peixes estéreis,monossexuais e com altos níveis de consangüinidade. Sob o aspecto prático, aslinhagens manipuladas cromossômica e hormonalmente podem ser usadas para evitarmaturação precoce, para possibilitar a produção de peixes maiores, para a obtenção deexemplares que apresentem somente o sexo de maior valor comercial e para permitir ouso de peixes exóticos artificialmente estéreis no cultivo ou para introdução na natureza.As biotecnologias de manipulação cromossômica e reversão sexual precisam ser bemconhecidas e compreendidas por todos os que trabalham atualmente em pisciculturaporque vêm sendo gradativamente incorporadas às rotinas dos programas desenvolvidosem nível mundial e, há alguns anos, começaram a ser experimentadas também em nossopaís, A seguir, no item 4, são apresentados os principais tipos de marcadoresmoleculares, em nível de DNA, que vêm sendo usados em projetos de ictiogenéticaaplicada à piscicultura. 0 tópico 5 diz respeito à aplicação da engenharia genética àpiscicultura e trata da transferência de genes entre diferentes organismos e peixes. Comoa engenharia genética apresenta alto grau de sofisticação técnica, dificilmente deverá serusada rotineiramente a curto prazo na área ictiológica, devendo, por mais uma década, serestringir apenas a algumas instituições de pesquisa e a grandes empresas agrícolas. 0último item do trabalho analisa os riscos bioecológicos potenciais de linhagens de peixesgeneticamente manipuladas sobre populações selvagens e cultivadas. 0 presente trabalho é baseado em grande parte na experiência adquirida com osprojetos que vêm sendo, ou que foram, desenvolvidos em conjunto pelo Laboratório deGenética de Peixes do IB/USP (São Paulo), Laboratório de Biologia e Genética de Peixesdo IB/UNESP (Botucatu) e pelo Centro de Pesquisas e Treinamento em Aqüicultura,CEPTA/IBAMA (Pirassununga), Centrais Elétricas de Minas Gerais, CEMIG (VoltaGrande), Companhia Energética de São Paulo, CESP (Paraibuna), Instituto de Pesca deSão Paulo (Campos do Jordão) e Projeto Pacu (Terenos), e pretende ser de utilidade noplanejamento de projetos de biotecnologia genética aplicados à piscicultura, que venhama ser desenvolvidos em nosso país. A maioria dos resultados obtidos, até o momento, jáfoi resenhada e publicada. 1,2,3,5,9,10,12,24,25,26,27,28,29,302. MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES As técnicas de manipulação ou engenharia cromossômica podem ser aplicadas comrelativa facilidade aos peixes, porque esse grupo de animais geralmente apresentafecundação externa, o que favorece em muito o manuseio de seus gametas. Numerosastécnicas têm sido descritas na literatura para a produção de peixes haplóides, triplóides,tetraplóides, ou mesmo os que tenham só cromossomos maternos (ginogenéticos) ou sópaternos (androgenéticos) (Tabela 1)7,20,22,23
  3. 3. As tecnologias usadas para alterar o número cromossômico dos peixes pertencem aduas categorias principais: choques de temperatura ou térmicos e choques de pressão ouhiperbáricos. Os choques de temperatura geralmente são aplicados aos ovos logo após afertilização (cerca de 5 - 10 minutos) e, por isso, são chamados de precoces. Os choquesde pressão são aplicados aos ovos decorridos tempos maiores após a fertilização (cercade 60 - 90 minutos) e, por isso, são chamados de tardios. A finalidade do choque precoceé a de atuar na meiose, bloqueando a eliminação do segundo corpúsculo polar do ovócitoe o choque tardio, de interferir no início da mitose, impedindo a primeira clivagem dozigoto quando este vai se tornar um embrião com duas células. Na maioria das estações de piscicultura do mundo utilizase o choque térmico em vezdo hiperbárico, porque a aparelhagem para manutenção de temperaturas constantesoferece maior segurança para os operadores e possibilita trabalhar com maiores volumesde ovos. Para os choques de pressão usam-se cilindros hidráulicos de aço inoxidável quesão bastante caros, comportam volumes reduzidos de ovos, operam por vários minutoscom altas pressões entre 7 e 10 mil psi (psi = libra por polegada quadrada), correndo,muitas vezes, riscos de rompimento, principalmente quando o ar dos cilindros não édevidamente removido, ou seja, quando não é feito um "sangramento" adequado. Emborase possa utilizar tanto choques térmicos quentes quanto frios, parece que os quentesproduzem melhores resultados em espécies de peixes de águas frias e, ao contrário, oschoques frios em espécies de águas quentes. Em geral, a temperatura que produz osmelhores resultados é espécie-específica e se situa na proximidade de seu limiar letal. Ébastante importante que no decorrer do tratamento térmico os ovos sejam mantidos numatemperatura uniforme sem flutuações; isso pode ser conseguido dispondo-se os ovos empoucas camadas em um recipiente de vidro que, por sua vez, é mergulhado num banhotérmico com volume suficiente de água, de modo que a temperatura desejada sejamantida constante. Portanto, o tipo, a intensidade e a duração do tratamento térmico sãopeculiares para cada espécie. Há várias técnicas que podem ser usadas para verificar o sucesso das manipulaçõescromossômicas, sendo que um dos métodos mais laboriosos é contar o número decromossomos. Um segundo método é medir o tamanho dos núcleos dos eritrócitos; isto éfeito corando-se esfregaços de sangue com Giemsa e medindo-se ao microscópio o eixomaior do núcleo dos eritrócitos. Um terceiro, é a medida do volume nuclear do eritrócito,rotineiramente realizado nas pisciculturas norteamericanas produtoras de carpas capimtriplóides, com o auxílio do aparelho Coulter Counter Channelyzer, que é caro, porémbastante eficiente e rápido. Um quarto método consiste na determinação do conteúdo deDNA do núcleo dos eritrócitos por citofotometria de fluxo. Um quinto método utiliza acoloração pelo nitrato de prata de um esfregaço de sangue e contagem do númeromáximo de nucléolos existentes nos núcleos dos eritrócitos. Uma sexta técnica é usar aeletroforese. 2.1 Triplóides Puros e Híbridos A produção de triplóides é o tipo de manipulação cromossômica mais familiar na áreade piscicultura. 0 interesse que os triplóides despertam se deve a duas características quepotencialmente eles podem apresentar: maior crescimento que os diplóides e esterilidade(Tabela 1). Os dois tipos de triplóides mais usados em piscicultura são os puros e os híbridos. Ostriplóides puros, também chamados de autotriplóides e triplóides intraespecíficos, sãoformados por três conjuntos haplóides de cromossomos provenientes de uma mesmaespécie. Os triplóides híbridos, também designados como autotriplóides ou triplóidesinterespecíficos, são formados por dois lotes haplóides de cromossomos de umadeterminada espécie e por um outro lote de outra espécie.
  4. 4. Tabela 1 - Tipos de biotecnologias genéticas aplicadas à piscicultura 7.20,22,23 Tipo de Biotecnologia Produtos Obtidos Aplicações em Piscicultura 1. TRIPLOIDIA PURA Linhagens estéreis Controle da reprodução Linhagens com maior sobrevivência e crescimento 2. TRIPLOIDIA HÍBRIDA Linhagens híbridas Controle da reprodução estéreis Linhagens com maior sobrevivência e crescimento e resistência a doenças. 3. TETRAPLOIDIA Gametas diplóides Obtenção de linhagens triplóides interplóides 4. HAPLOIDIA Linhagens haplóides Produção de ginogenéticas e/ou androgenéticas haplóides 5. GINOGÊNESE Linhagens Produção de linhagens monossexuais de ginogenéticas fêmeas para casos de determinação do sexo tipo XX/XY Produção de linhagens altamente endocruzadas Identificação de sistemas de determinação do sexo 6. ANDROGÊNESE Linhagens Produção de supermachos androgenéticas Produção de linhagens altamente endocruzadas Criopreservação do germoplasma 7.REVERSÃO Linhagens de Produção de linhagens revertidas neomachos e Produção de supermachos e neofêmeas superfêmeas; Identificação de sistemas de determinação do sexo 8.DNA RECOMBINANTE Linhagens Linhagens com características vantajosas transgênicas codificadas pelo DNA transplantado 1) Produção de triplóides - Os triplóides são obtidos da seguinte maneira: logoapós a fertilização comum, os ovos são submetidos a choque térmico ou hiperbárico(Tabela 2). Lembremos que, por ocasião da desova, os peixes do sexo feminino eliminamo que comumente se costuma chamar de "ovas" ou "óvulos", mas que na realidade sãoovócitos de segunda ordem. Doravante, por motivo de simplificação, designaremos de"óvulos" aos ovócitos de segunda ordem, Estes "óvulos" eliminam o segundo corpúsculopolar somente após terem sido fertilizados. Porém, se um "óvulo" recém-fertilizado forsubmetido a um choque térmico ou hiperbárico, o segundo corpúsculo polar não seráeliminado. Como conseqüência, o ovo resultante irá conter três núcleos haplóides: umque é o núcleo feminino do "óvulo", outro que é o núcleo masculino proveniente doespermatozóide, e um outro que é o núcleo do segundo corpúsculo polar. Os três núcleoshaplóides se fundem para formar um zigoto triplóide que, por sua vez, produzirá um peixetriplóide. 2) Como otimizara produção de triplóides- A maioria dos pesquisadores episcicultores usa choques de temperatura ou de pressão. Os choques químicos sãopouco usados, porque produzem um grande número de "mosaicos" (peixes que contêmcélulas com vários graus de ploidia). Os choques térmicos são os mais usados empisciculturas comerciais porque são os operacional mente mais fáceis de aplicação, maisbaratos em termos de aparelhagem e produtos químicos usados e mais seguros. Atemperatura exata e a duração do choque térmico que são necessários para a produçãode triplóides devem ser estabelecidas inicialmente por tentativa e erro. As temperaturasquentes ou frias ótimas são aquelas situadas alguns graus acima ou abaixo das
  5. 5. temperaturas letais inferiores ou superiores para uma determinada espécie. Logo, aprimeira etapa para se otimizar a produção de triplóides seria a determinação dos limiaresletais para as temperaturas quentes e frias. 0 tempo exato em que o choque devecomeçar e terminar depende do tempo após a fertilização, no decorrer do qual o segundocorpúsculo polar é eliminado. 0 choque deve começar antes do evento da eliminação econtinuar por tempo suficiente ate que seja improvável a extrusão do segundo corpúsculopolar. Por exemplo, em ensaios realizados no Brasil para a produção de triplóides purosde carpa comum, cerca de 10 minutos após a fertilização, os ovos foram tratados a O°C ±0,2 durante 30 minutos, resultando na produção de 94,7% de triplóides 12 . Estes valoresusados para a produção de triplóides já foram otimizados para algumas espécies usadasna piscicultura brasileira (Tabela 2)3,12,23. Tabela 2 -Valores otimizados para indução de triploidia por choques térmicos em algumas espécies usadas na piscicultura brasileira Espécie Início do Temperatura Duração do Freqüência Taxa de choque do choque choque de triplóides eclosão (minutos) (ºC) (minutos) (%) (%) Bagre africano 4 5 40 8-100 9-40 Bagre do canal 5 5 60 100 79 Carpa capim 4 42 1 67 72 Carpa comum 10 0-0,2 30 95 52 Tambaqui 2 39 3 12 82 Tilápia do Nilo 7 9 30 100 86 Truta arco-iris 25 26 20 100 87 Certos especialistas acreditam que as espécies de peixes que historicamentevivem em águas frias (por exemplo, truta arco-íris e outros salmonídeos) respondemmelhor a choques térmicos quentes moderados (entre 26ºC e 29ºC), e, ao contrário, emespécies provenientes de águas quentes (tais como as carpas comum e chinesas, bagresdo canal e africano e a maioria das espécies neotropicais), os choques frios fortes (abaixode 4ºC) ou moderados (entre 5ºC e 15ºC) parecem ser mais efetivos na indução detriploidia. Este tipo de generalização não é aceito por outros especialistas, tendo em vistaos excelentes desempenhos obtidos com choques quentes fortes (pouco acima de 40ºC)em espécies de águas quentes (tais como tilápias e carpas) e também o sucesso dechoques frios bastante fortes (pouco abaixo de OºC) na indução de triploidia emsalmonídeos. 3) Reconhecimento dos triplóides - Em relação à morfologia externa, os triplóidespuros e os diplóides geralmente não apresentam diferenças significativas. Em nívelcelular é que se encontram as diferenças mais marcantes, pois o tamanho dos núcleos edas células dos triplóides é cerca de um terço maior do que os dos diplóides. A maneiramais fácil para identificar triplóides de peixes é através das medidas dos eixos maioresdos eritrócitos em esfregaços de sangue corados por Giemsa. Outro procedimento é acontagem do número máximo de nucléolos nos eritrócitos, evidenciados após coloraçãocom nitrato de prata. 0 método mais direto para identificar os triplóides puros é o examedo número cromossômico. Por exemplo, em trabalho realizado no Brasil12 foi possíveldistinguir claramente carpas comuns triplóides (eixo maior dos eritrócitos = 8,23 ± 0,50µm; número máximo de nucléolos = 3; número de cromossomos 3n = 150) das diplóides(4,76 ± 0,25 µm; número máximo de nucléolos = 2; número de cromossomos 2n = 100).Existem métodos mais sofisticados para a identificação de triplóides, tais comoestimativas do conteúdo de DNA nuclear por citofotometria e volume celular doseritrócitos por sistemas automatizados como o "Coulter Counter Channelyzer", que ébastante eficiente porém de custo elevado, como já mencionado.
  6. 6. 4) Esterilidade, crescimento e sobrevivência - 0 interesse que os triplóides têmdespertado na piscicultura devese a dois tipos de expectativa: a de que apresentem maiorcrescimento em peso e comprimento e a de que sejam estéreis. Sob o aspecto teórico,espera-se que os triplóides sejam maiores do que os diplóides porque suas célulascontêm 33% mais informação genética para o crescimento; além disso, por seremestéreis, os triplóides não gastariam energia para a produção de gônadas e gametas,para a corte, reprodução e cuidados à prole. Quanto ao crescimento, tem-se verificado, de u ma maneira geral, que diplóides etriplóides crescem igualmente até o início da idade da primeira maturação. Durante operíodo de maturação sexual os diplóides de ambos os sexos sofrem uma parada nocrescimento, concentrando suas energias no desenvolvimento das gônadas; entretanto,as fêmeas triplóides, não formando gônadas normais, continuam crescendo em peso ecomprimento e acabam por superar as fêmeas diplóides em 5% a 20% ao final do períodode maturação. De fato, as fêmeas triplóides apresentam somente gônadas residuais eníveis de hormônios sexuais semelhantes aos das diplóides jovens. Os machos triplóides,entretanto, apresentam um considerável desenvolvimento gonadal, níveis de hormôniossexuais semelhantes ao dos diplóides adultos, mostram características sexuaissecundárias e apresentam comportamentos de corte. Chegam também a produzirquantidade limitada de sêmen bastante fluido, com poucos espermatozóides móveis que,quando usados experimentalmente em fecundações artificiais, produzem abortosprecoces, mostrando ser pouco provável que machos triplóides venham a produzirdescendência normal e fértil. Logo, as fêmeas triplóides não são maiores que as diplóides devido a seu grau deploidia, mas porque apresentam esterilidade gonádica. Conseqüentemente, a produçãode linhagens monossexuais de fêmeas triplóides parece ser a mais interessante emprogramas de piscicultura que tenham por objetivo a obtenção de peixes maiores, cujostamanhos comerciais ultrapassem a fase de maturação sexual. Os triplóides puros usualmente apresentam uma taxa de sobrevivência menor(entre 40% e 95%) do que a dos diplóides nas etapas iniciais do desenvolvimento7 . Asinformações até o momento disponíveis não permitem afirmar qual seria a principal causado aumento da mortalidade dos triplóides. Admite-se que poderiam ser três as possíveiscausas: a) efeito deletério dos choques térmicos sobre as proteínas fibrilares constituintesdo fuso meiótico e eventualmente também sobre o citoesqueleto celular; b) aconsangüinidade parcial, devida ao fato de os triplóides apresentarem em geral doisgenomas femininos; c) o efeito da própria triploidia, em especial sobre o tamanho dascélulas. Duas maneiras têm sido usadas com sucesso para atenuar o problema damortalidade precoce dos triplóides puros. Um caminho, desenvolvido apenasexperimentalmente, mas ainda não inserido na rotina das pisciculturas, consiste em seobter linhagens tetraplóides e cruzá-las com diplóides para se obter triplóides, que sãochamados de triplóides interplóides22 ; estes interplóides apresentam taxas desobrevivência e crescimento semelhantes às dos diplóides 7. Outra maneira que vemsendo usada em piscicultura e a produção de triplóides híbridos, cujas taxas desobrevivência e resistência a doenças geralmente superam as dos diplóides híbridos. 5) Uso de triplóides em programas de piscicultura - A produção de triplóidesconstitui um excelente caminho para se utilizar peixes exóticos em programas depiscicultura, minimizando assim possíveis problemas adversos de impacto ambiental. A carpa capim é uma espécie exótica na qual as possibilidades dos triplóides vêmsendo testadas há alguns anos. Esse peixe herbívoro, originário da China, foi introduzidonos EUA em 1963 e, desde então, vem sendo usado no controle biológico da vegetaçãoaquática. Em muitos estados norte-americanos, foi banida a entrada da carpa capim,porque havia o receio de esta espécie escapar dos tanques de cultivo, reproduzir-se nanatureza e prejudicar de algum modo as espécies nativas. A primeira possibilidade para
  7. 7. se evitar a reprodução da carpa capim surgiu quando, em 1978, se verificou que aprogênie híbrida F1 entre fêmeas de carpa capim e machos de carpa cabeça grande eraformada por triplóides. Ensaios realizados em 1995 no CEPTA/IBAMA, Pirassununga-SP,com estoques brasileiros dessas duas espécies de carpa, possibilitaram também aobtenção de cerca de 100% de triplóides híbridos. Como os híbridos recebem dois lotescromossômicos do genoma materno, essas linhagens apresentam a maioria dascaracterísticas de carpa capim e são mais vigorosas do que os diplóides híbridos. Em1983 conseguiu-se a produção de triplóides puros de carpa capim, com eficiência de 98%.A vantagem apresentada por essas novas linhagens de triplóides puros é a de queconsomem biomassa de vegetação aquática igual à dos diplóides normais e de 3 a 4vezes maior do que os triplóides híbridos. Os triplóides puros, devido à sua maiorcapacidade de se alimentar de vegetação aquática e pelo fato de apresentarem tipo deesterilidade equivalente à dos triplóides híbridos, têm sido os preferidos ultimamente emprojetos de piscicultura voltados para a área de controle da vegetação aquática em lagose reservatórios. Tabela 3 -Esquemas gerais dos protocolos para a produção de linhagens de peixe poliplóides, ginogenéticos e androgenéticos 1. Produção de Linhagens Poliplóides CTP TRIPLÓIDES  ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS OVOS  CHT TETRAPLÓIDES 2. Produção de Linhagens Ginogenéticas e Androgenéticas CTP GINOGENÉTICOS MEIÓTICOS  - Espermatozóides + Óvulos OVOS inativados por UV  CHT GINOGENÉTICOS MITÓTICOS - ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS OVOS inativados por Co  CHT ANDROGENÉTICOS CTP = choque térmico precoce; CHT = choque hiperbárico tardio; UV = fonte de ultravioleta; Co = fonte de cobalto Os triplóides de carpa capim tratados hormonalmente para a indução das fasesfinais da gametogênese mostraram que praticamente todo o esperma produzido éanormal; a probabilidade de que um macho triplóide possa produzir descendência fértil étão remota que os triplóides de carpa capim podem ser considerados estéreis parapropósitos operacionais de manejo em piscicultura. A maioria dos estados norte-americanos somente permite a entrada de linhagens100% triplóides em seus territórios. Devido a essa exigência, é necessário verificar o nívelde ploidia de cada lote de carpa capim a ser usado. Portanto, o controle de qualidade éabsolutamente necessário neste tipo de agroindústria, o que aumenta os custos deprodução, mas diminui sensivelmente os riscos ecológicos. Por exemplo, para se tercerteza de que todos os exemplares de carpa capim são triplóides, o nível de ploidia decada exemplar deve ser determinado antes de os mesmos serem legalmente estocados
  8. 8. na natureza. Isso aumenta o custo da carpa capim triplóide em cerca de 400% em relaçãoàs linhagens diplóides. Muitos pesquisadores gostariam de produzir triplóides de algumas espéciesimportantes para o cultivo, tal como as tilápias, para eliminar a reprodução precoce queocorre ainda durante a fase de crescimento destas espécies de peixes. Um pré-requisitoimportante para que esse tipo de biotecnologia seja efetivo e prático numa escalacomercial é que a desova possa ser facilmente induzida e que uma grande quantidade de"óvulos" possa ser facilmente obtida. Algumas espécies, tais como as tilápias, são poucofecundas e se reproduzem de maneira continuada porém assincrônica. A combinaçãodestes fatores resulta em que dezenas de milhares de animais reprodutores teriam queser manuseados anualmente para a produção de "óvulos" suficientes para um sistema delarga escala. Portanto, seria impraticável basear a piscicultura comercial da tilápia, ou deespécies de peixes com características reprodutivas semelhantes, na produçãocontinuada de triplóides. A possibilidade de se utilizar triplóides no controle populacional de espécies depeixes "não desejáveis" em determinados ecossistemas abre perspectivas que precisamser cuidadosamente pré-testadas em condições experimentais. Por exemplo, emprincípio, existiria a possibilidade de serem usados machos triplóides do tucunaré noPantanal Mato-grossense para se tentar o controle populacional desta espécie que éproveniente da Bacia Amazônica, caso ficasse documentado que esses machos triplóidesse cruzam com fêmeas.diplóides normais e produzem descendência inviável. Estaproposta aqui apresentada, e por nós anteriormente Já mencionada e discutida em doisencontros técnico-científicos realizados em Pirassununga-SP e em Campo Grande-MSem 1995, deveria ser obrigatoriamente pré-testada em sistemas fechados de estações depiscicultura apropriadas. Em primeiro lugar, seria necessário produzir os triplóides detucunaré, e a seguir testar o comportamento reprodutivo dos triplóides adultos. Destemodo seria possível responder a uma série de perguntas, tais como: os machos triplóidesde tucunaré desenvolvem ou não gônadas maduras? Será que esses machos triplóidesirão apresentar comportamento de corte e “espermiar" naturalmente? Caso os machostriplóides fertilizem os "óvulos" das fêmeas diplóides normais, serão ou não formadosembriões? Estes embriões morrem ou não logo nos primeiros estádios dedesenvolvimento? 0 tamanho populacional dos estoques de tucunarés diplóides normaisdiminui ou não nos tanques-teste, quando neles são introduzidos machos de tucunaréstriplóides? 2.2 Haplóides e Tetraplóides 1) Haplóides - São organismos que apresentam somente um lote decromossomos. Como possuem um único conjunto cromossômico, qualquer gene comefeito detrimental irá se manifestar e, como tal, é pouco provável que a maioria doshaplóides sobreviva durante muito tempo. De fato, dados da literatura têm mostrado quehaplóides, produzidos em cerca de sete espécies de peixes para propósitosexperimentais, têm mostrado baixa sobrevivência 7. Há dois caminhos para se produzirem haplóides e ambos envolvem a destruiçãodo material genético de um dos parentais. Um dos modos consiste em fertilizar os"óvulos" com espermatozóides que tenham tido seu material genético destruído por raiosX, raios gama, produtos químicos ou radiação UV. A radiação UV é provavelmente omelhor método para destruir o DNA dos espermatozóides, porque outras técnicas podemdeixar fragmentos cromossômicos viáveis, que podem contribuir para a produção deindivíduos diplóides parciais ou que apresentem redução na taxa de sobrevivência. Alémdisso, a radiação UV é mais barata e mais segura que os demais tipos. Osespermatozóides tratados com UV ainda permanecem móveis e aptos para fertilizarem e
  9. 9. ativarem os "óvulos". Uma vez ativados, os "óvulos" iniciam o desenvolvimentoembrionário, mesmo que o espermatozóide fecundante não mais transporte genesfuncionais. Como o espermatozóide inativado com UV não contribui com materialgenético, os alelos contidos no núcleo haplóide do "óvulo" serão os únicos a fazeremparte do núcleo do "zigoto". Os embriões assim produzidos são ginogenéticos haplóides,porque todo o material genético é de proveniência materna. Um segundo modo de produzir haplóides é destruir o material genético dos"óvulos" com raios X ou raios gama e fertilizar esses "óvulos" com espermatozóidesnormais. Como o núcleo haplóide do espermatozóide será a única contribuição para ogenoma do "zigoto", o embrião será haplóide. Nesse caso, o embrião será androgenéticohaplóide, porque o material genético será proveniente exclusivamente do parentalpaterno. As linhagens de peixes haplóides são interessantes porque possibilitam aospesquisadores estudar certos processos genéticos durante a embriogênese. Sob o pontode vista prático, é bastante importante conhecer como produzir haplóides, porqueconstituem o primeiro passo para a produção de peixes ginogenéticos e androgenéticosdiplóides. 2) Tetraplóides - Os tetraplóides apresentam quatro conjuntos haplóides decromossomos em lugar dos dois lotes normais. Os tetraplóides podem ser produzidosgeralmente por um choque hiperbárico tardio, que bloqueia a primeira divisão mitótica deum zigoto diplóide (Tabela 2). Desse modo, foram produzidos em 1984 salmonídeostetraplóides de primeira geração, que mostraram taxas de eclosão variando entre 5% e80%, e taxas de sobrevivência e crescimento bastante baixas7,23. 0 interesse potencial dos tetraplóides em projetos de piscicultura e que podem serusados para a produção de triplóides interplóides estéreis; desse modo ficaria eliminada anecessidade de produzir triplóides pelos métodos convencionais de choques térmicosprecoces. Assim, cruzando-se linhagens tetraplóides com diplóides, produz-sedescendência chamada de triplóide interplóide. 0 tipo de cruzamento mais convenienteseria usar como parentais fêmeas tetraplóides e não machos tetraplóides, porque asmicrópilas dos "óvulos" de fêmeas diplóides não apresentam diâmetro suficiente parareceber os espermatozóides produzidos pelos machos tetraplóides, uma vez que essesespermatozóides serão diplóides. Uma vez produzidas, as linhagens tetraplóides podemser autoperpetuadas via intercruzamentos, evitando-se assim terem de ser continuamenteproduzidas. Em 1986, uma primeira geração de tetraplóides foi intercruzada e obteve-se asegunda geração de tetraplóides, que apresentou taxas de sobrevivência e crescimentoapenas satisfatórias7,23. Os machos tetraplóides também têm mostrado capacidade defertilização reduzida, em relação aos machos diplóides, aparentemente porque seusespermatozóides maiores apresentam dificuldade de penetração nas micrópilas dos"óvulos" normais. Atualmente, a tecnologia de tetraploidia se encontra restrita apenas aonível experimental, não tendo sido ainda incluída na rotina de projetos de piscicultura.Somente trabalhos futuros dirão sobre as reais possibilidades dos tetraplóides na áreaaplicada. 2.3 Ginogenéticos As linhagens ginogenéticas apresentam os dois lotes haplóides de cromossomosprovenientes do parental materno. Em espécies de peixes nas quais a determinação dosexo é do tipo XX/XY e as fêmeas são homogaméticas (XX), todos os ginogenéticosserão fêmeas. Os ginogenéticos têm duas grandes aplicações potenciais em piscicultura: aprimeira é o controle da proporção sexual pela produção de linhagens monossexuais defêmeas e a segunda, a rápida produção de linhagens altamente consangüíneas7,16,23
  10. 10. 1) Produção de ginogenéticos - Há três maneiras principais de produzir linhagensginogenéticas. A primeira é ativando os "óvulos" com espermatozóides que tenham tidoseu material genético destruído por raios X, raios gama (em geral usando fonte de 60CO)ou radiação UV. A radiação gama tem a vantagem de possuir excelente poder depenetração, o que facilita o tratamento de grandesquantidades de esperma. No entanto,fragmentos cromossômicos residuais são freqüentemente encontrados na descendênciade ginogenéticos após a fertilização com espermatozóides irradiados com radiação gama;como tais fragmentos podem reduzir a sobrevivência dos ginogenéticos, dá-se preferênciaà inativação dos espermatozóides por UV. 0 procedimento para o tratamento dos espermatozóides por UV é relativamentesimples: inicialmente, o esperma é diluído de modo a que possa ser espalhado numacamada bem fina em uma placa de vidro e exposto a uma fonte de UV de uma lâmpadagermicida. Grande número de "óvulos" pode ser fertilizado quando colocados diretamentena placa de vidro na qual foi feita a inativação dos espermatozóides. Normalmente, comexposições apropriadas à radiação UV, nenhum fragmento cromossômico paternopermanece nos espermatozóides. É possível que alguns dos peixes produzidos durante oprocesso acima descrito sejam diplóides normais, visto que também espermatozóidesnão-inativados podem fertilizar os "óvulos". Para evitar esse tipo de ocorrência, algunspesquisadores usam espermatozóides de outras espécies que sabe-se, produzemembriões híbridos não-viáveis. Um segundo modo para se confirmar a não-transmissãodo genoma do parental paterno é usar esperma de doadores que sejam homozigotos paragenes marcadores dominantes. Por exemplo, espermatozóides de truta arco-írispigmentada homozigota podem ser usados para ativar "óvulos" de fêmeas albinas; nessecaso, toda a descendência Albina será ginogenética, enquanto a descendêncianormalmente pigmentada será diplóide normal. Logo após a ativação, os "óvulos" sãosubmetidos a choques precoces para impedir a eliminação do segundo corpúsculo polar(Tabela 3). Os ovos assim produzidos conterão dois núcleos haplóides: o núcleo do"óvulo" e o núcleo do segundo corpúsculo polar; os dois núcleos se fundem para formarum núcleo diplóide contendo os dois conjuntos de cromossomos originários do parentalmaterno. Uma segunda técnica para produzir ginogenéticos começa do mesmo modo que aanterior: numa primeira etapa, os "óvulos" são ativados por espermatozóides que tiveramseu material genético destruído por radiação. Assim, serão produzidos ginogenéticoshaplóides. Quando o zigoto haplóide inicia a primeira clivagem, é dado um choque tardioque bloqueia a primeira divisão mitótica. Desse modo, os dois núcleos haplóides sefundem e formam um zigoto diplóide, com dois lotes cromossômicos provenientes doparental materno. Os ginogenéticos produzidos pela supressão da primeira clivagem (chamados deginogenéticos mitóticos) são homozigotos para todos os seus locos e apresentam 100%de consangüinidade. A maioria desses tipos de ginogenéticos apresenta baixas taxas desobrevivência (ao redor de 1,5%), devido à expressão dos genes detrimentais recessivosque podem existir em maior ou menor quantidade nessas linhagens. Os ginogenéticosproduzidos pelo bloqueio da eliminação do segundo corpúsculo polar (chamados deginogenéticos meióticos) são, por definição, altamente consangüíneos, porém apresentamcerto nível de heterozigose devido à ocorrência de permuta durante a meiose. Naliteratura não há uma concordância geral a respeito dos níveis exatos de consangüinidadeapresentados pelos ginogenéticos meióticos; segundo certos autores os níveis deconsangüinidade seriam ao redor de 45% e 65%, e segundo outros entre 33% e 100%. Uma terceira biotecnologia que pode ser usada para produzir ginogenéticosconsiste em fertilizar "óvulos" de fêmeas tetraplóides com espermatozóides cujo DNAtenha sido inativado por radiação. Como as fêmeas tetraplóides produzem "óvulos"
  11. 11. diplóides, não há necessidade de os "óvulos" serem submetidos a choques precoces paraa produção de complemento cromossômico diplóide. Em 1988, linhagens ginogenéticasde truta arco-íris foram produzidas por meio dessa técnica. Embora esses tipos deginogenéticos sejam consangüíneos por definição, devem apresentar níveisconsideravelmente maiores de heterozigose do que os ginogenéticos produzidos a partirde parentais maternos diplóides. De fato, tem-se verificado na literatura que esse tipo deginogenético apresenta pouca redução nos níveis de heterozigose. 2) Controle da proporção sexual- Um dos interesses da ginogênese empiscicultura é a possibilidade de produção de linhagens monossexuais de fêmeas. Aprodução de linhagens ginogenéticas poderia constituir potencialmente um caminho parao controle da reprodução. Entretanto, a ginogênese apresenta várias desvantagensquando proposta em projetos de piscicultura visando ao controle da reprodução. Um dosproblemas é que os ginogenéticos são altamente consangüíneos. Se, por um lado, é umagrande vantagem dispor de diferentes linhagens consangüíneas para seremintercruzadas, seguindo-se o mesmo padrão de procedimento genético usado para aobtenção do milho híbrido, por outro lado é desvantajoso no caso em que os peixesginogenéticos tenham que ser soltos na natureza, pois apresentam taxas desobrevivência substancialmente menores do que as dos peixes normais. Um segundoproblema relativo ao uso da ginogênese para finalidades de controle populacional é que,embora a descendência dos ginogenéticos possa ser unissexual, ainda permanece fértil.Portanto, a introdução acidental ou produção ocasional de machos em um projeto deginogênese para controle populacional pode levar ao estabelecimento de uma populaçãonão desejável. Logo, em projetos para o controle da reprodução, parece ser preferível autilização da esterilidade por triploidia induzida ou por tratamentos hormonais do que amonossexagem por ginogênese. No entanto, a ginogênese pode ser bastante útil naprodução indireta de linhagens monossexuais de fêmeas. Nesses tipos de programas,uma linhagem ginogenética constituída somente por fêmeas pode ser tratadahormonalmente e revertida sexualmente em machos funcionais. Como os peixesresultantes serão geneticamente fêmeas e funcionalmente machos, quando cruzados comfêmeas normais irão produzir descendência constituída somente por fêmeas. Este tópicoserá retomado em detalhe no item 3- Reversão Sexual em Peixes do presente trabalho. 3) Linhagens consangüíneas - Na área de pesquisa ictiogenética, verifica-se quea aplicação da ginogênese para a produção de linhagens consangüíneas torna-se cadavez mais importante; porém, as possibilidades de aplicação prática da ginogênese nomanejo genético em projetos de piscicultura são ainda muito incertas, embora bastantepromissoras. Em certas espécies de peixes, tais como a truta arco-íris, os estoques cultivadosapresentam uma grande similaridade genética, como sugerem os estudos efetuados comauxílio dos marcadores genético-bioquímicos. Nessas condições é pouco provável quecruzamentos entre estoques muito pouco diferentes sob o aspecto genético dêem lugar afenômenos de heterose ou vigor híbrido, em que o desempenho das progênies sejasuperior ao melhor estoque parental. Para casos como estes, uma das idéias dosgeneticistas tem sido criar linhagens biologicamente bastante distintas. Um dos caminhosclássicos é o da consangüinidade, que possibilitaria, teoricamente, obterem-se aschamadas linhagens "puras", nas quais os indivíduos seriam, em princípio, geneticamentemuito semelhantes entre si. Sob esse aspecto, o ponto mais interessante a se consideraré o de que duas linhagens consangüíneas seriam, em média, bastante mais diversificadasgeneticamente do que duas outras não-consangüíneas. Portanto, cruzando-se duaslinhagens consangüíneas diferentes, poder-se-ia esperar o aparecimento do fenômeno daheterose. Por este método, obteve-se o milho híbrido, que mais do que triplicou aprodução deste cereal nos EUA após 1960.
  12. 12. Para se obterem linhagens altamente consangüíneas nos animais, oprocedimento clássico consiste em cruzamentos entre irmãs e irmãos inteiros, que sãorepetidos ao longo de gerações sucessivas. Esta forma de consangüinidade programadatem se mostrado muito eficiente na produção de linhagens "puras" de camundongosusados em laboratório. Ocorre, porém, que o intervalo entre duas gerações sucessivas,sendo bastante maior nos peixes cultivados do que nos camundongos, demandaria ummínimo de vinte anos de trabalho. A saída para tornar este método mais promissor temsido a obtenção mais rápida de peixes altamente consangüíneos via ginogênese. Naprática, há vários obstáculos para se usar rotineiramente a ginogênese em programas depiscicultura. Um dos principais problemas é que as tecnologias de ginogênese são maiscomplicadas que os esquemas clássicos de cruzamentos entre irmãos; outro problemasério é que a ginogênese mitótica maximiza tanto os níveis de consangüinidade em 100%em uma única geração, como também maximiza as taxas de mortalidade e de anomalias.Um caminho alternativo que vem sendo adotado é um aumento gradual daconsangüinidade das linhagens: para isso usa-se a ginogênese por retenção do segundocorpúsculo polar, que resulta em aproximadamente 45% a 65% de consangüinidade porgeração, alternada com cruzamentos entre irmãos, que produz 25% de consangüinidadepor geração7,6,20. Usando-se este esquema alternativo, a produção de linhagensginogenéticas já começa a fazer parte da rotina de algumas pisciculturas européias,sendo o caso mais conhecido dos brasileiros o das chamadas carpas húngaras 17 . 4) Identificação de sistemas de determinação do sexo -A produção de linhagensginogenéticas auxilia na caracterização e distinção de sistemas de determinação do sexoem espécies de peixes em que a fêmea seja homogamética ou heterogamética. Quando afêmea for homogamética, a ginogênese irá produzir somente fêmeas; quando a fêmea forheterogamética a ginogênese irá produzir números iguais de machos e fêmeas. Estestipos de resultados não provam em definitivo qual seria o sistema de determinação dosexo na espécie testada; mas, devido ao fato de os sistemas XX/XY (igual ao demamíferos) e ZZ/ZW (igual ao de aves) serem os mais comuns dentre os novemecanismos de determinação do sexo existentes em peixes, a ocorrência deginogenéticos constituídos somente por fêmeas sugere que a espécie em questãoapresente o sistema XX/XY, enquanto que a ocorrência de 50% de machos e 50% defêmeas sugere que a espécie em teste apresente o sistema ZZ/ZW. 2.4 Androgenéticos Os androgenéticos são linhagens de peixes que apresentam unicamente ogenoma paterno. 1) Produção de androgenéticos - As linhagens androgenéticas podem serproduzidas por dois métodos; o mais comumente usado consiste em fecundar um "óvulo",cujo material genético tenha sido destruído por raios X ou raios gama, com umespermatozóide normal. Deste processo resulta um androgenético haplóide. Quando ozigoto androgenético haplóide vai sofrer a primeira clivagem mitótica, é dado um choquehiperbárico tardio para impedir a divisão celular, e os dois núcleos haplóides se fundempara formar um núcleo diplóide (Tabela 3). Todos os cromossomos do peixeandrogenético provêm do parental paterno, e os animais assim produzidos são altamenteconsangüíneos. Como o complemento cromossômico diplóide provém de um único loteque se autoduplicou, os níveis de homozigose e de consangüinidade são ambos daordem de 100%. Essas linhagens androgenéticas apresentam taxas de sobrevivência aoredor de 5%, devido à expressão dos alelos recessivos detrimentais7. Uma segunda técnica, que pode ser usada para a produção de androgenéticos,consta em fertilizar os "óvulos", cujo material genético tenha sido destruído por radiação,com espermatozóides de machos tetraplóides. Como se sabe, os machos tetraplóides
  13. 13. produzem espermatozóides diplóides e, assim,os zigotos resultantes seriam diplóides.Desse modo, em 1990 foram produzidas nos EUA trutas arco-íris androgenéticas23. 2) Androgenéticos e supermachos - Nos casos em que os androgenéticossobrevivem até o período de primeira maturação sexual, é possível usá-los para aprodução de supermachos (YY), nas espécies cujos sistemas de determinação do sexosejam do tipo XX/XY. Nestes casos os machos são heterogaméticos, de modo quemetade dos androgenéticos produzidos será de supermachos. 3) Androgênese e conservação genética - Os androgenéticos apresentam umaaplicação potencial bastante interessante na área de manutenção do germoplasma econservação de espécies de peixes em perigo de extinção. Através da androgênese,pode-se recuperar o material genético de espécies cujas amostras de esperma tenhamsido criopreservadas em bancos de germoplasma. Como atualmente a tecnologia parapreservação de "óvulos" de peixes ainda não é satisfatória, a única via prática para aestocagem e recuperação genética na área ictiológica é fertilizar "óvulos" recém-obtidoscom esperma criopreservado. Usando-se a androgênese, o genoma de espermatozóidescriopreservados pode ser recuperado, mesmo que a espécie venha a se extinguir. Estetipo de abordagem não é geneticamente completo, porque o DNA mitocondrial, que éherdado por via materna, não poderá ser recuperado por androgênese 3,6.3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES A manipulação de gametas, ovos e embriões podem ser realizados com maiorfacilidade em peixes do que em outros animais, porque esse grupo geralmente apresentafecundação e desenvolvimento externos. Valendo-se do desenvolvimento externo dospeixes, os geneticistas e piscicultores conseguem controlar o sexo fisiológico desse grupode animais através da adição de hormônios esteróides anabolizantes no seu alimento ouna água em que vivem. A razão pela qual é possível controlar o sexo fisiológico dospeixes é que, enquanto o sexo genético é determinado por ocasião da fecundação, o sexofisiológico não é. Durante o início da embriogênese, um embrião de peixe não é nemmacho nem fêmea, porque não possui ovários, testículos ou outras característicasassociadas aos sistemas reprodutores. Ao contrário, um embrião de peixe possuiprecursores embriológicos de ovários e testículos (células germinativas primordiais) e,nesse estádio, um embrião é "totipotente" porque pode se desenvolver em um macho ouem uma fêmea. Em um determinado momento específico durante o desenvolvimentoembriológico (momento que é diferente para cada espécie), um sinal químico originado deum gene ou de um conjunto de genes “informa" ao tecido totipotente em que direção sedesenvolver. Uma vez que isso ocorra e o tecido pré-gonadal complete seudesenvolvimento, o peixe se torna fisiologicamente macho ou fêmea. Após essa etapa,não é mais possível alterar o sexo fisiológico, exceto por técnicas radicais, tais como acirurgia gonadal, que têm mostrado pouco sucesso. Há um pequeno espaço de tempo, que varia de espécie para espécie, durante oqual o sexo fisiológico pode ser alterado. Se um peixe ingere ou absorve esteróidesanabolizantes durante esse período, o esteróide pode interferir diretamente nodesenvolvimento das células totipotentes. Esta tecnologia tem sido bastante pesquisadanos últimos vinte anos e vem sendo rotineiramente aplicada em programas de pisciculturaenvolvendo, por exemplo, tilápias, salmonídeos e ciprinídeos. 3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais 1) Produção de linhagens monossexuais em uma etapa - Para se alterar em umaúnica etapa o sexo fisiológico de peixes, as larvas e alevinos devem ser, ou alimentadoscom ração contendo andrógenos (hormônios masculinos) ou estrógenos (hormônios
  14. 14. femininos), ou mantidos por certo tempo em água contendo concentrações diluídasdesses mesmos hormônios. As dosagens exatas de hormônios e os tempos durante osquais devem ser administrados são fatores importantes no sucesso dos programas dereversão sexual em peixes 20,31. 0 procedimento de reversão sexual em uma única etapa tem sido bastante usadona piscicultura das tilápias (Tabela 4). Uma das principais metas no cultivo de tilápias temsido produzir linhagens monossexuais de machos com a finalidade de impedir areprodução precoce e descartar as fêmeas que crescem mais devagar que do os machos.Para essa finalidade, as larvas de tilápia do Nilo por exemplo, são alimentadas com raçãocontendo 40 mg de 117-alfa-metiltestosterona/ kg de dieta durante um período de 60 dias.Essa dosagem usualmente reverte 100% das fêmeas em machos. Tabela 4 -Esquema geral do protocolo para a produção direta de linhagens revertidas de machos ou fêmeas em peixes com determinação do sexo tipo XX/XY ETAPA ÚNICA: Produção direta de linhagens revertidas FASE DE VIDA Larvas Indiferenciadas  ⊥ TIPO DE ESTERÓIDE ANDRÓGENOS ESTRÓGENOS ↓ ↓ SEXO FISIOLÓGICO MACHOS FÊMEAS SEXO GENÉTICO MACHOS REVERTIDOS FÊMEAS REVERTIDAS ou NEOMACHOS (XX) ou NEOFÊMEAS (XY) MACHOS NORMAIS (XY) FÊMEAS NORMAIS (XX) Nas pisciculturas de truta arco-íris, onde uma das finalidades seria produzirpopulações monossexuais de fêmeas, as larvas indiferenciadas são alimentadas comração contendo 20 mg de 17-beta-estradiol/kg de dieta durante um período de 40 dias,obtendo-se normalmente 100% de fêmeas revertidas. 0 consumo de peixes revertidos sexualmente por administração de esteróidesanabólicos pode levantar uma série de questões na área de saúde pública, conformedeverá ser discutido mais detalhadamente no item 6 - Riscos Potenciais de Linhagens dePeixes Geneticamente Manipulados, do presente trabalho. Este tipo de problema podeser contornado, em parte, pela incorporação do processo de reversão sexual emprogramas de piscicultura que possibilitem a produção de linhagens monossexuais defêmeas para espécies com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY e de linhagensmonossexuais de machos, para espécies com sistema de determinação do sexo tipoZZ/ZW. 2) Produção de linhagens monossexuais de fêmeas em duas etapas - Érelativamente fácil obter matrizes que sejam capazes de produzir linhagens constituídassomente de fêmeas em espécies de peixes que possuem o sistema de determinação dosexo tipo XX/XY. Nesse caso, são usados andrógenos para produzir neornachos XX(Tabela 5). Numa primeira etapa, as larvas sexualmente indiferenciadas são alimentadas comração contendo andrógenos ou mantidas em banho de água, também contendohormônios. Os peixes são criados até que possam ser sexados e, então, são separadosem duas categorias: fêmeas, que são descartadas e machos, que são guardados.
  15. 15. Tabela 5 - Esquema geral do protocolo para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas em espécies de peixes com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY 1. Etapa: Produção de linhagens de machos revertidos (XX) - Larvas indiferenciadas → Andrógenos → Machos revertidos (XX) e Machos normais (XY) 2. Etapa de Progênie para identificação dos machos revertidos (XX) - Fêmeas normais (XX) x Machos revertidos (XX) → 100% de Fêmeas normais (XX) - Fêmeas normais (XX) x Machos normais (XY) → 50% de Machos normais (XY) + + 50% de Fêmeas normais (XX) Guardar Linhagens de Machos Revertidos (XX) É impossível separar os neomachos ou machos revertidos tipo XX dos machosnormais XY pelo simples exame de características sexuais externas. Assim, numa 29etapa é necessário realizar um teste de progênie para identificar os machos revertidos,dos normais. Para esta finalidade, são feitos cruzamentos entre casais de fêmeas normaise machos tratados hormonalmente e cada família é criada separadamente até que adescendência possa ser sexada. Caso a descendência se mostre constituída por 50% defêmeas e 50% de machos, o macho parental é do tipo XY e deve ser descartado. Se, poroutro lado, a descendência for constituída somente de fêmeas, então o macho parentaltestado é um neomacho tipo XX e deve ser mantido, porque são estes tipos de matrizesque servirão para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas. Vários programas em piscicultura têm sido desenvolvidos para a produção delinhagens monossexuais de fêmeas como, por exemplo, em carpa capim, truta arco-íris esalmão do Atlântico. No caso da carpa comum, foram produzidos ginogenéticos revertidos(ginogenéticos em carpa comum são todos fêmeas XX) e criada uma linhagem queproduzia somente filhas. Tanto na truta arco-íris como no salmão do Atlântico, não énecessário realizar o teste de progênie, porque os machos revertidos ou neomachos XXapresentam dutos espermáticos incompletos, o que significa que o esperma não pode sernormalmente liberado desses machos, mesmo por compressão abdominal. Devido a isso,o esperma de machos revertidos XX de trutas arco-íris somente pode ser obtido atravésdo sacrifício dos animais. Portanto, os machos de truta arco-íris e de salmão do Atlânticopodem ser caracterizados como neomachos (XX) ou como machos normais (XY) peloexame dos dutos espermáticos. 3) Produção de linhagens monossexuais de machos em duas etapas - Para seobterem matrizes que sejam capazes de produzir linhagens monossexuais de machos emespécies com sistema de determinação do sexo tipo ZZ/ZW, as larvas devem serrevertidas sexualmente com estrógenos. Assim são produzidas linhagens de neofêmeasZZ. 0 único modo de diferenciar as neofêmeas ZZ de fêmeas normais ZW é através doteste de progênie das fêmeas. As fêmeas normais ZW produzem descendênciaconstituída de 50% de machos e 50% de fêmeas, e devem ser descartadas. Por outrolado, neofêmeas ZZ irão produzir 100% de descendentes machos e serão estas asmatrizes que deverão ser guardadas porque são capazes de produzir linhagensmonossexuais de machos. Em certos casos, como verificado em tilápias da espécieáurea, algumas fêmeas produzem famílias somente de machos e outras famíliasconstituídas por machos e hermafroditas. As razoes para o insucesso parcial deprogramas com esta espécie de tilápia não são completamente conhecidas, mas podem
  16. 16. ser devidas à contaminação com cromossomos sexuais de outras espécies, emdecorrência de hibridação ou introgressão,ou devidas a genes modificadores do sexo. 3.2 Produção de Supermachos A maioria das espécies utilizadas em piscicultura apresenta sistema dedeterminação do sexo tipo XX/XY Nesses casos, a obtenção de linhagens monossexuaisde machos pode ser feita através da produção de matrizes de supermachos (machos quesão YY em vez de XY). A Tabela 6 apresenta um esquema do roteiro em três etapas,necessário para a produção de supermachos. A primeira etapa deste programa consta dese alimentarem larvas sexualmente indiferenciadas com ração contendo estrógenos, coma finalidade de produzir neofêmeas ou fêmeas revertidas (fêmeas que geneticamente sãomachos XY, mas que fenotipicamente e fisiologicamente são fêmeas). Quando sãosexados, verifica-se que os peixes tratados por hormônios se enquadram em trêscategorias: machos normais XX, neofêmeas revertidas XY e fêmeas normais XX. Osmachos normais XY devem ser descartados porque não serão usados neste tipo deprograma. As fêmeas normais XX também não são usadas neste tipo de programa depiscicultura, mas e impossível separá-las das neofêmeas XY examinando-se apenas ascaracterísticas sexuais externas. Portanto, a segunda etapa do programa consta darealização do teste de progênie para identificar as fêmeas revertidas XY e se poderdescartar as fêmeas normais XX. Isto é feito pelo cruzamento de cada fêmea com ummacho normal e, então, pelo cultivo de cada família em tanques individuais, até que adescendência possa ser sexada. As fêmeas que produzirem descendência constituída por50% de fêmeas e 50% de machos, são geneticamente XX e devem ser descartadas. Poroutro lado, as fêmeas que produzirem 75% de descendentes machos, são neofêmeas XYe devem ser mantidas. No entretanto, neste ponto, as neofêmeas XY são menosimportantes do que os 25% de seus descendentes que são supermachos YY, comoindicado na Tabela 5 22,31. Tabela 6 - Esquema geral do protocolo para a produção de supermachos em espécies de peixes com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY 1. Etapa: Produção de linhagens de fêmeas revertidas - Larvas indiferenciadas → Estrógenos → Fêmeas Normais XX + Fêmeas revertidas XY 2. Etapa: Teste de progênie para identificar fêmeas revertidas - Fêmeas revertidas XY x Machos normais XY → 25% Fêmeas normais XX + - +50% Machos normais XY - 3. Etapa: Teste de Progênie para identificar os supermachos - Fêmeas normais XX x Supermachos YY → 100% Machos - Fêmeas normais XX x Machos normais XY → 50% Machos normais XY - + 50% Fêmeas normais XX Guardar as Linhagens de Supermachos YY Os supermachos são o objeto principal deste tipo de programa de reversãosexual, porque são as matrizes capazes de produzir descendência constituída somentede machos. Infelizmente é impossível separar machos normais XY e supermachos YYpelo exame das características sexuais externas, de modo que é necessário, numa
  17. 17. terceira etapa, realizar um teste de progênie para identificar os supermachos, guardaressas linhagens, e descartar as linhagens de Machos normais. As linhagens de machosque produzirem descendência constituída por 50% de fêmeas e 50% de machos devemser descartadas e aquelas que produzirem 100% de machos devem ser guardadas,porque são constituídas por supermachos, ou seja, são matrizes capazes de produzirdescendência formada por 100% de machos, quando cruzadas com fêmeas normais, semo uso de hormônios anabolizantes. Programas para a produção de supermachos têm sido levados a efeito, porexemplo, com truta arco-íris, bagre do canal e tilápia do Nilo. As matrizes de supermachospodem ser produzidas também pela combinação das biotecnologias de reversão sexual eginogênese, conforme esquematizado na Tabela 7 para espécies com sistema dedeterminação do sexo do tipo XX/XY. Esse procedimento se mostrou bastante satisfatóriona produção de linhagens monossexuais de machos de tilápia do Nilo20,22,31. Tabela 7 - Esquema geral do protocolo para a produção de supermachos combinando reversão sexual e ginogênese em peixes com o sistema de determinação do sexo tipo XX/XY 1. Etapa: produção de linhagens de fêmeas revertidas XY - Larvas indiferenciadas → Estrógenos → Fêmeas normais XX + Fêmeas revertidas XY 2. Etapa: produção de supermachos ginogenéticos Fêmeas revertidas XY x Machos normais XY com espermatozóides inativados por UV → Ovos → Choque Térmico Precoce para restaurar a diploidia → 50% Fêmeas ginogenéticas XX + 50% Supermachos ginogenéticos YY Fêmeas normais XX x Machos normais XY com espermatozóides inativados por UV → ovos → Choque Térmico Precoce para restaurar a diploidia → 100% Fêmeas ginogenéticas Guardar as Linhagens de Supermachos Ginogenéticos YY Um pré-requisito, absolutamente necessário para o sucesso dos programasprodução de supermachos com tilápias, é começar sempre com espécies "puras", porquelinhagens resultantes de hibridação ou introgressão, por exemplo, entre tilápia do Nilo(com sistema de determinação do sexo do tipo XX/XY) e tilápia da espécie homorum (comsistema de determinação do sexo do tipo ZZ/ZW), irão apresentar uma mistura desistemas de determinação do sexo, o que tornará bastante difícil, senão impossível naprática, levar avante qualquer programa bem sucedido de produção de supermachos comtilápias. 3.3 Produção de Superfêmeas As matrizes de superfêmeas (WW) possibilitam a produção de linhagensmonossexuais de fêmeas em espécies de peixes que apresentam o sistema dedeterminação do sexo tipo ZZ/ZW. A primeira etapapara a produção de superfêmeas consiste na alimentação delarvas sexualmente indiferenciadas com dietas contendo andrógenos, com a finalidade deproduzir machos revertidos ZW. Quando os peixes puderem ser sexados, são separadosem duas categorias: fêmeas normais ZW, que são descartadas e machos, que sãomantidos. Há dois tipos de machos, os neornachos ZW e os machos normais ZZ, os quaissão impossíveis de serem separados pelo exame das características sexuais externas.
  18. 18. Para identificar os machos revertidos ZW, é necessário, numa segunda etapa,realizar o teste de progênie. Os machos que produzem descendência constituída por 50%de fêmeas e 50% de machos são geneticamente ZZ e devem ser descartados e, os queproduzem 75% de fêmeas são machos revertidos ZW e devem ser mantidos. Cerca de25% das fêmeas produzidas por machos revertidos ZW, serão constituídas porsuperfêmeas WW, que devem ser mantidas, e por cerca de 50% de fêmeas normais ZW,que podem ser descartadas. As matrizes de superfêmeas WW produzem descendênciaconstituída por 100% de fêmeas normais ZW, quando cruzadas com machos normais ZZ.0 único meio para se diferenciar as superfêmeas das fêmeas normais é realizar numaterceira etapa, um outro teste de progênie. Caso a proporção sexual da descendênciadesse teste for constituída por 50% de fêmeas e 50% de machos, sabe-se que a parentalfêmea é geneticamente normal ZW e deve ser descartada; por outro lado, se toda adescendência do teste for constituída somente por fêmeas, então a parental materna seráa matriz superfêmea WW que está sendo procurada e deve ser mantida porque, quandocruzada com machos normais ZZ, produzirá somente uma descendência de fêmeas ZW23,31. Poucas espécies importantes para a piscicultura apresentam sistema dedeterminação do sexo tipo ZZ/ZW, como por exemplo, o bagre africano, a tilápia homorume a enguia japonesa, porém é pouco provável o interesse na produção comercial delinhagens monossexuais de fêmeas, por exemplo, no caso das tilápias, uma vez que,neste grupo são os machos que apresentam maior interesse econômico, pois crescemmais que as fêmeas. Os programas de reversão sexual em piscicultura desenvolveram-se tanto que,sob o ponto de vista comercial, são atualmente os grandes responsáveis pela *produçãode peixes em larga escala em vários países. Por exemplo, cerca de 50% da truta arco-írisproduzida no Reino Unido e 40% do salmão "chinook” produzido no Canadá, sãoprovenientes de linhagens monossexuais de fêmeas produzidas por matrizessexualmente revertidas, conforme procedimento sumarizado na Tabela 5.4. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENÉTICA, Nos últimos anos, tem havido um crescente aumento no uso de marcadoresmoleculares ao nível do DNA, em projetos de ictiogenética aplicados à piscicultura 4. Na Tabela 8, encontram-se resumidas informações gerais sobre os principaismarcadores moleculares mais usados na área de ictiogenética e sobre o grau decontribuição de cada tipo de marcador para estudos genético-evolutivos. 1) mtDNA - o DNA mitocondrial (mtDNA) é de natureza haplóide, apresentamolécula circular, não é recombinante, é transmitido via materna e contém cerca de 16 a20 mil pares de bases. Quando o mt DNA é digerido por enzimas de restrição (enzimasque clivam a molécula de DNA em locais específicos) e submetido a eletroforese,originam-se até cerca de 10 fragmentos por indivíduo, que são chamados RFLP(“restriction fragment length polymorphism"). Esses fragmentos podem variar ou porsubstituições de bases que causam ganho ou perda de sítios ou pela inserção/deleção demutações que mudam o comprimento dos fragmentos. Diferentes enzimas de restriçãoreconhecem e clivam seqüências de 4, 5 ou 6 bases; por exemplo, a Xba 1, derivada dabactéria Xanthomonas badrii, atua sobre seqüências T^ CTAGA (^ = ponto de clivagem).0 mt DNA tem sido o marcador molecular mais usado em vários projetos na áreaictiogenéticas,10,14,15. 2) scn DNA - é um tipo de DNA nuclear de cópia única ("single-copy"), presentesomente uma vez no genoma haplóide, sendo por isso também designado não-repetitivo.Engloba cerca de 70% do genoma dos mamíferos e geralmente é visualizado pela análisedos RFLP.
  19. 19. 3) DNA repetitivo interdisperso - é uma categoria de DNA nuclear constituída porelementos repetitivos longos (LINE) e curtos (SINE), que ocorrem múltiplas vezes, cercade centenas de milhares, no genoma. Normalmente é visualizado também pela análisedos RFLP. 4) DNA satélite - é um tipo de DNA nuclear, repetitivo, que contêm seqüênciascurtas que se repetem em tandem. Um dos tipos mais conhecidos de DNA satélite é o minissatélite multilocos, quedá origem ao chamado "DNA fingerprinting". 0 minissatélite multilocus é constituído porduas a várias centenas de cópias de seqüências curtas de DNA com 9 a 100 bases,muitas vezes concentradas nas regiões teloméricas. Quando esse tipo de DNA é cortadopor enzimas de restrição, produz padrões bastante complexos que se parecem com umpadrão de código de barras, que é característico para cada indivíduo, sendo por issochamado de "DNA fingerprint". Até o momento existem na literatura boas e más notícias arespeito do "DNA fingerprint. Primeiro as boas. o desempenho e a aplicação desta técnicanos últimos anos tem sido cada vez mais promissores. Agora as más. É ainda umatécnica cara, com custos de U$ 50 a 100 por animal. Um outro tipo de DNA satélite é o chamado minissatélite loco-único tambémdesignado por VNTR (“variable number of tandem repeats"), cujo polimorfismo se deve avariação no comprimento dos alelos. Há alguns anos foi possível confirmar a presença e opotencial do VNTR no salmão do Atlântico 4.Tabela 8 - Principais tipos de marcadores moleculares ao nível de diferentes classes de DNA e o grau de desempenho em estudos genético-evolutivos Tipos de Marcadores mt DNA scn DNA Repetições VNTR Micros- RAPD e contribuição interdispersas satélites Análise de NA B NA E S B Genealogias Genética de B B NA B E S Populações Detecção de Zonas B/E S B NA NA NA Híbridas Filogenias E B E NA NA NA E - excelente; B - boa; S - satisfatória; NA - não adequada Outro tipo ainda de DNA satélite é o microssatélite formado por seqüênciassimples de 1 a 6 bases repetidas de 5 a 100 vezes em cada loco e, usualmente,espalhadas ao longo do genoma. Por exemplo, a unidade CA pode ser encontrada repe-tida 50 vezes em tandem. 0 número de repetições pode ser altamente variável, dandoorigem a um amplo Polimorfismo, que pode ser detectado via eletroforese. Osmicrossatélites exibem atributos que os tornam favoráveis como marcadores genéticosem vários projetos de piscicultura. São abundantes, apresentam altos níveis de variaçãoalélica, e são bastantes úteis em várias situações: por exemplo, em espécies queapresentam baixo nível de variação com marcadores genético-bioquímicos (isozimas) oumoleculares (mt DNA) como por exemplo o salmão do Atlântico, espécie na qual váriosmicrossatélites exibem mais do que 25 alelos e níveis de heterozigose que excedem 90%.Se, por um lado, o uso de microssatélites é bastante favorável porque seus alelos secomportam como marcadores mendelianos codominantes, por outro lado apresentammenores informações sob o aspecto filogenético4.
  20. 20. 5) RAPD("random amplífied polymorphic DNA")- consiste de regiões arbitrárias doDNA, mas de seqüências conhecidas, constituídas por 10 a 20 bases do genoma, quesão amplificadas pela técnica chamada PCR ("polymerase chain reaction") e cujosprodutos podem ser detectados por eletroforese. 0 RAPD foi usado com sucesso, porexemplo, na distinção de tilápias, evidenciando sua utilidade em investigações aos níveistaxonômicos de subespécies e espécies4.5. ENGENHARIA GENÉTICA EM PEIXES A engenharia genética é um tipo de biotecnologia molecular pela qual um ou maisgenes são transferidos ou transplantados de organismos de uma espécie chamadadoadora, para organismos de outra espécie chamada receptora, que será constituídapelos indivíduos transgênicos. Os programas com peixes transgênicos, a nível mundial, estão ainda em faseexperimental e acredita-se que comecem a ser incorporados na rotina da piscicultura atéo final da década de noventa 6,11,18,19. 0 tipo de tecnologia usada pela engenharia genéticaé de tal ordem sofisticado, que praticamente nenhum pesquisador ou piscicultorindependente terá condições de desenvolver sozinho tal tipo de programa. Além disso,em muitos países já há uma série de leis federais, estaduais e até municipais regulando edisciplinando sobre pesquisas na área de engenharia genética. Há também o receio deque o escape de animais transgênicos para a natureza possa apresentar riscos deimpactos ambientais ainda não totalmente conhecidos. Esses fatos, somados ao tipo delegislação, problemas éticos, morais e filosóficos sobre a produção de transgênicos,acrescidos ainda aos problemas de financiamento de projetos nessa área, leva a crer quea engenharia genética de peixes permanecerá durante vários anos ainda no âmbito decertas instituições de pesquisa e de algumas grandes empresas agroindustriais6,19. 5.1 Produção de Transgênicos As etapas básicas para a produção de peixes transgênicos são: a) clonagemgênica, ou seja, a escolha e a obtenção de um determinado gene que, por exemplo,codifique a produção de hormônio do crescimento; b) microinjeção do gene escolhido nosovos da espécie receptora; c) incorporação ou inserção do gene transferido nocromossomo da espécie receptora; d) expressão do gene inserido; e) transmissão dogene transplantado. 1) Clonagem gênica - Para a obtenção de um determinado gene de um doador,existem três caminhos principais. 0 primeiro é recorrer às chamadas "bibliotecas gênicas",ou seja, há estoques de genes anteriormente já clonados e guardados em muitoslaboratórios em várias partes do mundo. 0 segundo, é clonar os genes de maneira direta,ou seja, removendo o gene dos cromossomos da espécie doadora por digestão do DNAnuclear com auxílio de enzimas de restrição. Após a obtenção dos fragmentos e aidentificação dos seus conteúdos gênicos, o gene a ser transplantado é inserido emplasmídios bacterianos (pequenos anéis de DNA localizados no citoplasma dasbactérias), cortando-se esses plasmídios com enzimas de restrição, ligando-se o geneescolhido ao plasmídio, e então fechando-se os plasmídios com ligases (enzimas dereparo do DNA). 0 complexo gene-plasmídio é, então, transferido para uma bactéria, comauxílio de um choque térmico e, então, as bactérias são cultivadas e multiplicadas. Asbactérias replicam os seus plasmídios ao se dividirem e, deste modo, são produzidasmilhões de cópias do plasmídio e do gene a ele ligado. As bactérias são cultivadas atéque haja material suficiente e depois são mortas e rompidas para a liberação dos
  21. 21. complexos plasmídios-genes a serem transplantados. Os plasmídios são então isolados epurificados e o gene que interessa é isolado e removido. Um terceiro caminho é o métodode clonagem indireta que começa com a extração do RNA do tecido, sua purificação eseu uso como modelo para sintetizar o DNA complementar (c DNA). A vantagem em seusar o material nuclear é que este material engloba as diferentes partes do gene, taiscomo o promotor e o espaçador que, normalmente, não são obtidos durante a transcrição.No entretanto, o c DNA contém apenas aquelas seqüências do nucleotídio que codificampara o trecho específico do RNA ativo na transcrição da molécula de proteína; por essarazão é necessário usar outros promotores para possibilitar a ativação do gene c DNA.Esses promotores não são específicos e podem ser usados para uma variedade de genescodificadores. Por exemplo, o plasmídio usado no caso do famoso gene para o hormôniodo crescimento de rato que foi transplantado para camundongo em 1982, também incluíaum promotor. Este mesmo plasmídio também foi usado em truta arco-íris. A maioria dostrabalhos com peixes tem usado DNA clonados para outros organismos, porém váriosprogramas vêm sendo desenvolvidos visando a clonagem gênica em peixes; nessesentido, já foram clonados os genes para o hormônio do crescimento do salmão "chum"em 1985, da truta arco-íris em 1988 e do salmão do Atlântico em 198919. 2) Microinjeção de DNA nos ovos -Cerca de um milhão de cópias do DNApurificado devem ser injetadas em cada ovo. Os ovos de peixes são bastante favoráveispara esse tipo de procedimento, porque são grandes (geralmente têm mais de 1 mm dediâmetro), a fertilização é externa e pode ser controlada, as injeções não exigemmicromanipuladores especiais e os ovos são fáceis de incubar. Existem"duas dificuldadesprincipais relativas à manipulação dos ovos de peixes. Uma delas se deve à presença docórion, que é uma membrana externa envoltória do ovo. Em algumas espécies, como nocaso do peixe dourado japonês, há necessidade de usar produtos químicos ou enzimasproteolíticas para remover o córion. Os ovos dos salmonídeos resistem à retirada docórion, que deve ser puncionado previamente com uma agulha sólida, antes daintrodução da agulha para microinjeção do DNA. Sabe-se que a microinjeção do DNA nonúcleo dos zigotos parece produzir melhores resultados do que injeções no citoplasma.Uma outra desvantagem dos ovos de peixes é que os núcleos são pequenos e não sãovisíveis, como ocorre com os núcleos dos zigotos de mamíferos; isto faz com que asinjeções do DNA a ser transferido atinjam geralmente o citoplasma mais ou menospróximo do núcleo do zigoto. Centenas de milhares de cópias precisam ser injetadas emcada ovo, porque um grande número será destruído pelas enzimas celulares. 3) Incorporação do gene transferido - As primeiras indicações do sucesso dotransgenismo, ou seja, de que o DNA transferido foi incorporado ao genoma hospedeiro,irão surgir durante o período de intensa replicação do DNA, que acompanha os rápidosestádios de divisão celular do embrião jovem. A replicação conjunta do DNA introduzido edo DNA receptor pode ser detectada após a extração e detecção por sondas que hibridamespecificamente com o DNA introduzido. Mesmo que o DNA transferido seja incorporado ao genoma do hospedeiro, osgenes podem estar "danificados", de modo que pode ocorrer que somente uma parte dogenoma venha a ser incorporada, os genes podem vir a ser incorretamente incorporados,ou incorporados no lugar errado. Mesmo que ocorra incorporação correta, a mensagemcodificada pode não ser apropriadamente transcrita em RNA mensageiro, bloqueandoassim a produção do produto gênico. 4) Expressão do gene inserido - Tendo sido produzidos peixes transgênicos, aquestão que se segue é saber se o novo gene transplantado está ou não transcrevendoem RNA e se o RNA está sendo traduzido em proteína. A expressão do gene inseridopode ser monitorada testando-se o RNA mensageiro dos tecidos transgênicos por testesimunológicos apropriados. A transferência bem-sucedida de um determinado gene não égarantia de sucesso. Os genes contêm reguladores e promotores que os ligam ou
  22. 22. desligam em situações determinadas e, também, estes tipos de genes precisam sertransplantados junto com os genes estruturais. Logo, os complexos formados pelos genesestruturais e reguladores devem ser também injetados, pois suas presenças sãoessenciais para o funcionamento gênico. Por exemplo, as trutas arco-íris transgênicasproduzidas em 1988 não apresentaram expressão gênica quanto ao hormônio docrescimento, porque foi usado na época um promotor de camundongo. 8,19,20 5) Transmissão dos genes transplantados - A transmissão do DNA transplantadoé um dos aspectos cruciais dos programas de engenharia genética, porque a finalidadedesses programas é produzir linhagens de peixes com características vantajosas quepossam ser transmitidas para a descendência. Em um peixe transgênico, espera-se quenão só todas as células somáticas, como as germinativas, contenham o genetransplantado. Caso o peixe seja um heterozigoto transgênico, com a integração do genetransplantado em apenas um loco, então 50% de todos os espermatozóides ou "óvulos"produzidos transportarão a nova seqüência e, em cruzamentos com peixesnão-transgênicos, 50% de toda a descendência será transgênica heterozigota. Caso ospeixes transgênicos apresentem mais de uma cópia integrada em seu genoma, como, porexemplo, em diferentes locais dos cromossomos e em vários cromossomos, adescendência será constituída por mais de 50% de transgênicos. Caso, a partir de ovosde fêmeas transgênicas heterozigotas, sejam produzidos ginogenéticos mitóticos, cercade 50% da progênie será formada por fêmeas transgênicas homozigotas. Evidências de transmissão de características transgênicas têm sido mostradasem programas de engenharia genética desenvolvidos na França com trutas arco-íris, nosEstados Unidos com a carpa comum, com o peixinho zebra danio e na China com opeixinho dourado 113,19,20,23 5.2 Contribuição dos Transgênicos em Projetos de Piscicultura Atualmente começam a ser testadas em condições de piscicultura nos EUA,carpas comuns transgênicas para o gene do hormônio do crescimento. Pesquisasequivalentes, conduzidas na China em condições de laboratório, mostraram que o peixedourado transgênico também para o gene do hormônio do crescimento, apresentadesempenho quatro vezes superior aos dos normais19. Nos EUA e Canadá já foi clonado o gene que codifica proteínas anticongelamentoexistentes no sangue de alguns linguados do Ártico, que permitem a sobrevivência destesanimais em temperaturas inferiores a O°C. Os salmões do Atlântico não possuem asproteínas anticongelamento e morrem nos tanques-rede na região da Escandináviaquando as temperaturas caem a -0,7°C. A transferência dos genes para proteínasanticongelamento certamente seria muito útil se fosse feita tanto para salmões doAtlântico como para espécies de regiões tropicais, candidatas ao cultivo em regiõestemperadas19. Outra possibilidade de aplicação da engenharia genética em piscicultura seria autilização dos genes para a metalotioneína, que é uma proteína que se liga a metaispesados nas células, particularmente o cádmio, cobre, zinco e mercúrio18,19. Os genespara a metalotioneína estão presentes em muitas espécies de vertebrados, inclusive nospeixes, e têm uma dupla função: uma, que parece ser a principal, é de suplementar comzinco as enzimas zinco-dependentes. Outra seria uma função de desintoxicação, umprocesso que envolve sua ligação com metais pesados e sua excreção pelos rins. Emteoria pelo menos, os genes da metalotioneína poderiam ser introduzidos em espéciesque habitassem áreas poluídas por metais pesados. Infelizmente, a metalotioneína não seliga ao alumínio e não oferece proteção para peixes que vivem em águas acidificadas. Logo, prevê-se que a aplicação da tecnologia de engenharia genética empiscicultura demore ainda pelo menos mais uma década. Durante este período, a
  23. 23. pesquisa em engenharia genética deve ficar mais restrita a instituições de pesquisa e acompanhias agroindustriais. Além disso, os dados atualmente disponíveis não fornecemgarantia total de que os peixes transgênicos sejam capazes de transferir para adescendência os genes transplantados e, mesmo que isto seja possível, não há garantiaplena de que a inserção do gene para o hormônio do crescimento ou outrascaracterísticas desejáveis apresentem resultados positivos. 0 manejo sanitário de peixesassim como a produção de vacinas contra doenças bacterianas e virais na área ictiológicasão áreas que provavelmente serão bastante beneficiadas nos próximos dez anos pelaengenharia genética aplicada à piscicultura19.6. RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS DE LINHAGENS DE PEIXESGENETICAMENTE MANIPULADOS Na área de biotecnologia aplicada à piscicultura é também importante avaliar osriscos biológicos potenciais das linhagens geneticamente manipuladas, tanto para odesenvolvimento satisfatório de projetos neste setor, como para propósitos deconservação genética de estoques selvagens e cultivados de peixes6. As linhagens de peixes geneticamente modificadas podem ser intencional ouacidentalmente introduzidas em ambientes naturais onde possam sobreviver, dispersar-seou reproduzir-se. Diferentes tipos de modificações genéticas podem ocasionar impactosecológicos. Por exemplo, a reprodução de peixes transgênicos pode levar à introgressãode transgenes em populações selvagens de peixes, enquanto a introdução de linhagensde triplóides transgênicos pode envolver certa percentagem de não-triplóides férteis. Apossibilidade de impacto ecológico destes eventos ainda não pode ser adequadamenteavaliada face aos dados atualmente disponíveis. Na verdade, os riscos potenciais depeixes transgênicos em ecossistemas naturais se baseiam, até o momento, apenas emevidências de natureza teórica. 6.1 Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas As linhagens de peixes cromossomicamente manipuladas apresentam riscos deimpactos bioecológicos que podem ser considerados previsíveis. Estes riscos potenciaisdizem respeito a dois aspectos principais: efeitos dos graus de ploidia sobre o sucessoreprodutivo de populações naturais coespecíficas e das conseqüências dos novos níveisde variabilidade genética pós-manipulação cromossômica sobre a coadaptaçãopopulacional6. 1) Problemas com os triplóides - Sabemos que grande parte da utilidade daslinhagens triplóides de peixes se deve a sua esterilidade. No entanto, o uso de triplóidesem piscicultura pode apresentar três tipos básicos de problemas potenciais. Um deles é aobrigatoriedade de verificação dos níveis de ploidia dos indivíduos pertencentes àslinhagens a serem introduzidas na natureza. A necessidade deste procedimento se deveao fato de a percentagem de triplóides induzidos artificialmente variar de maneiraconsiderável, de acordo com os diferentes protocolos seguidos e as várias espécies depeixes usadas. Caso não se adote este tipo de encaminhamento, corre-se o risco deplanejar projetos para o emprego de triplóides e, na realidade, acabar realizando, naprática, trabalhos com grande número de diplóides. Outro problema é o de que ostriplóides apresentam desenvolvimento sexual anormal e são estéreis. A despeito deapresentarem desenvolvimento sexual anormal, os triplóides machos de truta arco-íris,por exemplo exibem diferenciação sexual, níveis de testosterona, comportamento de cortee "espermiação" comparáveis aos normais. Além disso, podem se cruzar com fêmeasnormais diplóides, porém sem sucesso reprodutivo, porque a progênie não sobrevivepossivelmente pelo fato de os embriões serem aneuplóides. Portanto, nos casos em que
  24. 24. ocorrem cruzamentos entre fêmeas diplóides e machos triplóides, haverá uma perda totalda descendência, o que poderia reduzir o potencial reprodutivo da população. Empopulações selvagens, os fatos acima mencionados podem aumentar dois tipos de riscosgenéticos: com a perda da variabilidade genética e o declínio demográfico, pode até haverrisco de extinção populacional. Em certos lagos dos EUA, onde foram introduzidosestoques de peixes triplóides híbridos entre a truta " Yellowstone cutthroat" e a trutaarco-íris para se obterem exemplares mais vigorosos destinados à pesca esportiva, estáocorrendo uma sensível diminuição do tamanho populacional das trutas nativas diplóides.Este tipo de impacto genético de uma linhagem cromossomicamente manipulada sobreoutra cromossomicamente normal poderia ter sido atenuado, caso tivessem sidoutilizadas somente linhagens de fêmeas triplóides que, como sabemos, não apresentammaturidade sexual, comportamento de corte, etc. Por outro lado, caso se desejasse propor um programa visando ao controlepopulacional de uma espécie exótica, poderia ser experimentado o uso de linhagens demachos triplóides; é evidente que tentativas iniciais deveriam ser realizadas, por exemplo,em tanques experimentais e não diretamente na natureza. Admitamos, por exemplo, quese pretendesse tentar reduzir o tamanho populacional do tucunaré que, há alguns anos foiintroduzido na bacia superior do rio Paraguai, usando linhagens triplóides de machos dopróprio tucunaré, como já mencionado no item 2 - Manipulação Cromossômica emPeixes, deste trabalho. Neste caso, seria necessário começar com a produção eidentificação de linhagens triplóides de tucunaré e, a seguir, com ensaios em tanquesexperimentais para a análise do comportamento reprodutivo dos machos triplóidesestocados junto com machos e fêmeas diplóides normais. Desse modo, seria possíveldeterminar se os machos triplóides de tucunaré teriam ou não acesso sexual às fêmeasdiplóides, se interfeririam ou não no comportamento de desova dessas fêmeas, e sepoderiam interferir na biologia populacional dos diplóides férteis. Um outro problema biológico dos triplóides é o fato de poderem apresentar maiorsobrevivência que os diplóides. Há indicações de que salmões estéreis maiores e maisvelhos consomem 40% mais alimento do que os exemplares férteis maduros. Os estéreistambém competem com os férteis quanto aos itens alimentares, durante todo o seu ciciode vida, o que pode limitar a taxa de crescimento populacional. 2) Problemas com os tetraplóides- 0 maior interesse prático dos tetraplóides é ode servir de matrizes para a produção de linhagens triplóides quando são cruzados comestoques de diplóides. 0 escape de tetraplóides para a natureza pode apresentar riscospotenciais. Um dos problemas que podem surgir é o cruzamento entre fêmeastetraplóides e machos diplóides, levando à produção de grande quantidade de triplóidesestéreis, ocasionando uma diminuição dos diplóides normais. Bem mais problemáticoparece ser o cruzamento reciproco entre fêmeas diplóides e machos tetraplóides, porqueo esperma diplóide apresenta baixa capacidade de fertilização, possivelmente devido adificuldades de penetração através da micrópila de um "óvulo" normal haplóide, comojá.mencionado. 0 escape continuado de tetraplóides confinados em direção a ecossistemasnaturais poderia, em princípio, levar a uma redução do sucesso reprodutivo daspopulações naturais6. 3) Problemas com os ginogenéticos e androgenéticos -A ginogênese e aandrogênese são biotecnologias genéticas que levam à produção de linhagens comdiferentes graus de consangüinidade. Em condições de cultivo, as linhagensconsangüíneas podem constituir matrizes vantajosas para o desenvolvimento deprogramas envolvendo hibridações entre diferentes estoques de peixes. 0 risco potencialque essas linhagens consangüíneas apresentam é o de serem. introduzidas na naturezae virem a se cruzar com estoques selvagens, resultando em descendência comvariabilidade genética reduzida. Como se sabe, a uniformidade genética geralmente
  25. 25. perturba a coadaptação biológica historicamente estabelecida nas populações selvagense leva ao decréscimo do tamanho populacional. Portanto, seria bastante importante queas linhagens ginogenéticas e androgenéticas fossem cultivadas em locais bastanteseguros e, sempre que possível, que também fossem biologicamente estéreis. 6.2 Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas 0 uso de anabolizantes para a produção de peixes revertidos sexualmente é umassunto ainda acompanhado mundialmente, de muita polêmica6. Os anabolizantes têm acapacidade de aumentar, por exemplo, em cerca de 20% a produtividade da trutaarco-íris21. Um dos principais pontos de discussão é se os anabolizantes fazem ou nãomal para a saúde do ser humano, No Brasil, o uso de anabolizantes na área de pecuáriade corte, por exemplo, está suspenso há vários anos e muito se tem discutido a favor oucontra sua liberação. Em peixes, há vários trabalhos na literatura mostrando que, desdeque corretamente usados para a reversão sexual, os hormônios não ofereceriam riscospara a saúde dos consumidores humanos6. Um dos principais argumentos favoráveis aouso de hormônios em peixes é que a quantidade de anabolizantes ingerida por animal,para a produção de linhagens monossexuais ou revertidas de fêmeas ou machos, é muitopequena, sendo inferior a 5 mg por animal. Outro argumento favorável ao uso, é o de quea maior parte do hormônio ingerido é rapidamente eliminado. Por exemplo, no decorrer doperíodo de 24 horas a truta arco-íris excreta cerca de 67% da 17-alfa-metiltestosteronaingerida; e, em juvenis de tilápia da espécie áurea, permanece apenas 0,9% da 17-alfa-metiltestosterona, após esta ter sido suspensa há 21 dias da dieta. Outro argumento afavor é que, desde que sejam utilizados ,segundo os protocolos indicados na literatura, osanabolizantes são detectados somente ao nível de partes por bilhão nos peixes revertidoscom tamanho comercial, o que, em princípio, não ofereceria problemas para a saúde dosseres humanos. Os argumentos contrários ao consumo de peixes revertidos para a alimentaçãohumana, em especial, dizem respeito aos riscos potenciais decorrentes do uso incorretode anabolizantes sem controle de qualidade ou aplicados em dosagens aleatórias eelevadas, resultando na produção de resíduos acima dos limites biologicamenteaceitáveis6,13. Em vários países europeus, para se evitarem riscos potenciais, não são usadospara consumo alimentar peixes revertidos diretamente em uma etapa13 como indicado naTabela 4. Pelo contrário, as linhagens revertidas são usadas como matrizes para aprodução indireta, em duas etapas, de linhagens monossexuais de fêmeas ou de machos(Tabela 5), ou de linhagens de superfêmeas ou supermachos (Tabelas 6 e 7). Sugerimos que os projetos brasileiros de piscicultura destinados à produção depeixes revertidos adotem preferencialmente os protocolos de produção indireta, em duasetapas, de linhagens monossexuais como resenhado nas Tabelas 5 e 6. No entanto, casovenham a ser usados os protocolos para produção direta de linhagens revertidas comoindicado na Tabela 4, há necessidade e obrigação por parte dos produtores, de prestaremos esclarecimentos necessários e cabíveis contidos nos códigos nacionais e federais e/ouestaduais de proteção aos consumidores, e de se orientarem previamente junto aosserviços veterinários oficiais responsáveis pelos controles sanitário e alimentar existentesa nível estadual e/ou federal, sobre o uso de anabolizantes em piscicultura. Os programas de piscicultura para a produção de linhagens monossexuais depeixes pelo uso de esteróides anabolizantes sofrem, a nível mundial, uma pressãocontinuada de grupos de consumidores para que seja proibido o uso desses hormôniosque, na opinião de várias entidades poderiam aumentar a incidência, por exemplo, decâncer da mama. De fato, recentemente, alguns pesquisadores têm proposto hipótesessugerindo que os xenoestrógenos (substâncias provenientes do ambiente, que mimetizam

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