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Caderno referencia 3 bvsms

Os principais pontos deste tópico são: 1. A fixação é o processo de interrupção da autólise pós-morte para preservar a estrutura e constituição do tecido. 2. Isso é feito usando soluções químicas que penetram no tecido, tornando-o rígido e bloqueando enzimas de degradação. 3. A solução padrão é formol a 10% tamponado, ideal para análises histológicas, histoquímicas, imuno-histoquímica e biologia molecular. 4.

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©Ministério da Saúde Todos os direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é da área técnica. Pode ser acessada na íntegra na Biblioteca Virtual em Saúde do Ministério da Saúde: http://www.saude.gov/bvs. Tiragem: 1a Edição - 2012 - 5.000 exemplares Elaboração, distribuição, informações: MINISTÉRIO DA SAÚDE Secretaria de Gestão do Trabalho e da Educação na Saúde Departamento de Gestão da Educação na Saúde Esplanada dos Ministérios, bloco G, sala 725 CEP: 70058-900, Brasília - DF Telefones: (61) 3315 2858 / 3315 3848 - Fax: (061) 3315 2862 E-mails: sgtes@saude.gov.br / deges@saude.gov.br Homepage: www.saude.gov.br/sgtes Coordenação: Maria Auxiliadora Córdova Christófaro Mônica Sampaio de Carvalho Mozart Julio Tabosa Sales Autor: Abel Dorigan Neto Revisão técnica: Gyl Eanes Barros Silva Coordenação editorial: Léa Simone Carvalho Mario Correia da Silva Impresso no Brasil / Printed in Brazil Projeto gráfico, diagramação, capa e arte final: Breno Santos Pessoa de Luna Dino Vinícius Ferreira de Araujo Apoio técnico Maria Aparecida Timo Brito Maria Ivanildes Resende de Oliveira Ilustração: Antonio Carlos Acioli da Silva Junior Normalização e revisão editorial: Centro de Estudos e Pesquisa em Saúde Coletiva - CEPESC Endereço: Rua São Francisco Xavier, 524 – 7º andar – Bl. D Maracanã – Rio de Janeiro – RJ www.cepesc.org.br cepesc@ims.uerj.br/ Cepesc@cepesc.org.br (21) 2569-1143/ 2234-7457 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Sandra Infurna, CRB nº 7 – 4607) D697 Dorigan Neto, Abel Caderno de referência 3: técnicas de Histopatologia / Abel Dorigan Neto - Brasília: Ministério da Saúde; Rio de Janeiro: CEPESC, 2012. 94p. (Coleção Cadernos de Referência; 3) ISBN 978-85-324-0035-2 1. Histopatologia. 2. Educação em Saúde. 3. Ensino Profissional. 4. Ensino Técnico. I. Título. II. Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde. CDU 576.385:37 Títulos para indexação: Em inglês: Notebook Reference 3: Histopathology techniques Em espanhol: Cuaderno de Referencia 3: técnicas de Histopatología 3.indd 2 11/08/12 20:30
Lista de abreviaturas e siglas ABC AgNO3 APTS BAAR C-erb-2 Ck-7 CD3 DAB DEGES EDTA ETSUS GMS HE HRP HPV PA PAAF PAMS PAS PBS pH Profaps RE rpm SGTES SUS TBS Avidina-biotina-complexo Nitrato de Prata Aminopropiltrietóxi Bacilos Álcool-Ácido Resistentes Oncogene localizado no cromossoma 17q21 Citoceratina 7 Complexo proteico que ativa linfócitos T Diamino Benzidina Departamento de Gestão da Educação na Saúde Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético Escola Técnica do SUS Prata Metenamina de Gomori Hematoxilina e Eosina Peroxidase de Rábano (Horseradish) Papiloma Vírus Humano Pró-análise Punções Aspirativas por Agulha Fina Ácido Periódico Prata Metenamina de Gomori Ácido Periódico de Schiff Solução Tampão Salina Potencial Hidrogeniônico Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio Para a Saúde Receptor de Estrógeno Rotações por minuto Secretaria de Gestão da Educação na Saúde Sistema Único de Saúde Salina tamponada com tris 3.indd 3 11/08/12 20:30
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5 SUMÁRIO Apresentação.................................................................................................................................. 1 Introdução................................................................................................................................... 2 Técnicas histológicas.................................................................................................................. 3 Colorações histológicas para grânulos, depósitos e pigmentos.................................................. 4 Coloração para tecido conjuntivo............................................................................................... 5 Coloração para agentes etiológicos............................................................................................ 6 Coloração para sistema nervoso................................................................................................. 7 Imuno-histoquímica.................................................................................................................... 8 Descalcificação........................................................................................................................... 9 Protocolos especiais.................................................................................................................... 10 Técnicas citológicas.................................................................................................................. Referências.................................................................................................................................... Apêndice........................................................................................................................................ 7 9 13 27 41 51 63 67 73 77 83 89 93 3.indd 5 11/08/12 20:30
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7 Apresentação A Secretaria de Gestão do Trabalho e da Educação na Saúde (SGTES) do Ministério da Saúde (MS), por meio da Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde do Departamento de Gestão da Educação na Saúde (DEGES), desenvolve políticas e programas com o propósito finalístico de ordenar recursos humanos para a saúde, como determina o Art. 200 da Constituição Federal, e, nesta perspectiva: • Atender ao que dispõe a Lei Nº 8080/90, especificamente no seu Art. 6º; • Contribuir para a adequada formação, alocação, qualificação dos profissionais e valorização e democratização das relações do trabalho; • Ampliar as oportunidades de formação profissional e de qualificação técnica para trabalhadores do nível médio, tendo como propósito a qualidade das Redes de Atenção à Saúde do SUS; • Consolidar, nos planos político, pedagógico e administrativo, as Escolas Técnicas do SUS (ETSUS). A efetividade, o atendimento oportuno e a qualidade dos serviços de saúde guardam intrínseca relação com a formação e a qualificação profissional. Portanto, é imprescindível que os acordos e respectivos contratos de colaboração entre os entes federativos, objetivando a organização da rede de atenção à saúde, assegurem recursos para o cumprimento e efetivação dos processos de formação e de qualificação técnica para o grupo de trabalhadores. Profissionais estes que formam o maior segmento da força de trabalho da área da saúde, os técnicos de nível médio. A efetivação dos objetivos do Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde (PROFAPS) implica a definição de diretrizes e prioridades para a área de formação profissional e de qualificação técnica com foco nos trabalhadores de nível médio do SUS. Entre essas prioridades está a formação do Técnico em Citopatologia. Para tanto, foi definido plano de trabalho cuja execução resultou no estabelecimento das “Diretrizes e Orientações para a Formação”, fundamentadas nas diretrizes e princípios das políticas nacionais da educação e da saúde, publicadas em 2011. Nessa linha, a SGTES/DEGES investiu na aquisição e produção de recursos e material didático específico para os cursos de formação profissional técnica, prioritários no PROFAPS e que estão sendo desenvolvidos pelas ETSUS. Para o curso técnico em citopatologia, a Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde, junto com as ETSUS e especialistas da área, definiu e coordenou o processo de elaboração e produção de material didático específico, o que traduz a relevância da formação profissional técnica de nível médio na política nacional de saúde. Este atlas (impresso e digital) é um desses recursos. Organizado tendo como referência as diretrizes para a formação do técnico em citopatologia, seguramente, é base tanto para a elaboração e definição do projeto político-pedagógico como para o desenvolvimento do curso. A produção de material bibliográfico para o Curso Técnico em Citopatologia inclui: • Atlas de Citopatologia Ginecológica (versão impressa e digital) • Caderno de Referência 1: Citopatologia Ginecológica • Caderno de Referência 2: Citopatologia Não Ginecológica • Caderno de Referência 3: Técnicas de Histopatologia 3.indd 7 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8 Apoiar o desenvolvimento do curso é o objetivo específico, contudo tem-se como propósito consolidar e ampliar a articulação das Escolas Técnicas com as Redes de Atenção à Saúde do SUS e, a partir dessa base, consolidar as Escolas como rede de excelência na formação profissional e na qualificação técnica do nível médio na área da saúde. Nessa perspectiva, fundamentada nos princípios das políticas de saúde, de educação e da regulação do trabalho, o SUS desenvolve a ordenação dos recursos humanos para a saúde. 3.indd 8 11/08/12 20:30
9 1 Introdução 3.indd 9 11/08/12 20:30
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11 Desde o seu surgimento, as técnicas histocitopatológicas permitiram grande avanço às ciências biológicas e médicas. No entanto, nada foi tão impactante quanto o uso desses conhecimentos na diferenciação entre tumores benignos e malignos. De lá para cá, esse conhecimento tem se difundido com as mais diversas finalidades, para uma enormidade de áreas do conhecimento humano, tais como: medicina legal, genética, biologia molecular e em pesquisa básica com modelos experimentais e humanos. Dessas, a patologia cirúrgica é a mais significativa área. A interpretação histopatológica é crítica para estabelecer o diagnóstico de benignidade e malignidade e pode discriminar os diferentes tipos e graus de câncer, bem como determinar mecanismos e percursos moleculares específicos dos tumores. No câncer, essas informações são importantes para estimar o prognóstico e a melhor escolha do tratamento a ser ministrado. As técnicas citopatológicas também são usadas para o diagnóstico de outras patologias, como: doenças infecciosas, idiopáticas e autoimunes. Nos transplantes, a histologia continua sendo o método padrão-ouro para diagnóstico das rejeições, toxicidades e disfunções em geral. Outra importante aplicação histórica dos métodos citológicos é na prevenção do câncer, sobretudo ginecológico. A possibilidade de se revelar lesões precursoras do câncer de colo uterino, que representa a segunda causa de mortalidade por neoplasia entre mulheres brasileiras, promoveu um grande impacto na diminuição da morbimortalidade da população feminina. Diagnósticos preliminares, evitando procedimentos mais invasivos, podem ser obtidos nas punções da tireoide, da mama, dos linfonodos etc. No exame de congelação, o patologista pode fornecer informações imediatas para o cirurgião, com o paciente ainda aberto na sala de cirurgia, garantindo o melhor resultado possível para o paciente. A microscopia tradicional é agora suplementada por técnicas sofisticadas, como a imuno- histoquímica, a imunofluorescência e a hibridização in situ. Aqui, além de contribuir para o diagnóstico mais adequado, esses métodos também ajudam na identificação dos potenciais alvos terapêuticos (exemplo dos receptores hormonais nos tumores de mama e c-kit nos tumores do estroma gastrointestinal) e na tipagem de agentes etiológicos (por exemplo, separando os sorotipos mais carcinogênicos dos menos carcinogênicos do HPV). Para que todas essas funções sejam realizadas com sucesso, o material fornecido ao médico patologista deve ser de muito boa qualidade. Conhecer e observar os passos de todas as técnicas que aqui serão apresentadas é imprescindível para atingir esse objetivo, tornando o trabalho do técnico tão importante quanto o do patologista. 1 Introdução • • • • • • • • • • 3.indd 11 11/08/12 20:30
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13 2 Técnicas histológicas 3.indd 13 11/08/12 20:30
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15 2.1 Fixação Significa o processo de interrupção dos fenômenos de putrefação pós-morte a fim de manter a integridade do tecido obtido através de ato cirúrgico, mantendo sua arquitetura e constituição química, preservando suas proteínas e antígenos e inativando enzimas proteolíticas causadoras da autólise, ou seja, conservando o tecido a ser estudado para que se mantenha o mais próximo possível de quando estava no paciente. Para isso, são utilizadas soluções químicas, isoladas ou em forma de mistura, para o processo chamado fixação. Imediatamente após a colheita do material através do ato cirúrgico, a amostra deve ser colocada em solução fixadora. Os fixadores penetram no tecido, tornando-o rígido e bloqueando os sistemas enzimáticos capazes de destruí-lo. Atualmente, além dos procedimentos de rotina Hematoxilina & Eosina (HE) e histoquímica, sabe- se que a solução de formol a 10% tamponado é o fixador ideal para imuno-histoquímica e reações de biologia molecular. O volume de fixador deve ser 20 vezes o volume do fragmento e o tempo de fixação varia de acordo com o tamanho (espessura) do mesmo; fragmentos pequenos, como biópsias obtidas em endoscopia, colonoscopia, punção de agulha fina tipo renal, hepática ou prostática, requerem em torno de quatro horas de fixação. Fragmentos maiores e com espessura em torno de 4 mm necessitam de até 12 horas. Orienta-se a quem estiver fazendo o recorte dessas peças cirúrgicas que, quando a espessura for de tamanho maior (útero, mama, estômago, baço etc), que elas sejam fatiadas com o intuito de se tornarem fragmentos mais delgados, facilitando, assim, a penetração do fixador. 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Figura 1 - Tecido em diferentes etapas de fixação. a - Peça cirúrgica a fresco. b - Peça cirúrgica fixada. c - Peça cirúrgica mal fixada. a b c 3.indd 15 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 16 Tipos fixadores Formol puro (37% - 40%) 100 ml Água destilada 900 ml Fosfato de sódio monobásico 4 g Fosfato de sódio dibásico 6,5 g Não necessita de tratamento pós-fixação Formol 10% tamponado (mais usado) Bicromato de potássio 2,5 g Cloreto de mercúrio 5 g Sulfato de sódio 1 g Água destilada 100 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 12 a 24 horas Tratamento após fixação com solução Zenker Após fixado, o material deverá ser lavado em água corrente por 12 a 24 horas para retirar o bicromato de potássio. Em seguida, deve ter início o processamento do material (desidratação, diafanização, inclusão, corte e pesca); após a obtenção dos cortes, retirar os cristais de cloreto de mercúrio do seguinte modo: • Desparafinar e levar até água corrente. • Colocar em solução de lugol de 10 a 15 minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar em solução de tiossulfato de sódio a 5% por três minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Corar pelo método desejado. Solução de Zenker Iodo metálico 1 g Iodato de potássio 2 g Água destilada 100 ml Solução de Lugol Tiossulfato de sódio 5 g Água destilada 100 ml Solução de Tiossulfato de Sódio 5% 3.indd 16 11/08/12 20:30
17 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Bicromato de potássio a 3% 80 ml Formol puro 20 ml Tempo de fixação 6 a 12 horas Removerobicromatoantesdoprocessamentolavandoosfragmentoscomáguacorrentepor 12 horas. Solução de Regaud Álcool 90% 85 ml Formol puro 10 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 6 a 12 horas Preparar o fixador no momento do uso. Solução de Alfac Solução alcoólica saturada de ácido pícrico 80 ml Formol puro 15 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 4 a 6 horas Solução de Gendre (fixador empregado para demonstração de glicogênio) Álcool absoluto 60 ml Clorofórmio 30 ml Ácido acético glacial 10 ml Tempo de fixação 3 a 6 horas Não é necessário tratamento pós-fixação. O material segue para processamento histológico. Solução de Carnoy Bicromato de potássio 2,5 g Cloreto de mercúrio 5 g Formol puro 5 ml Água destilada 100 ml Tempo de fixação 12 a 24 horas Remover o bicromato de potássio e os cristais de cloreto de mercúrio do mesmo modo utilizado no fixador de Zenker. Solução de Helly 3.indd 17 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 18 Bicloreto de mercúrio 4,5 g Cloreto de sódio 0,5 ml Água destilada 80 ml Formol puro 20 ml Ácido tricloroacético 4 g Tempo de fixação 12 a 24 horas Não necessita de tratamento pós-fixação. 2.2 Processamento histológico (desidratação, diafanização e impregnação) Uma vez fixado, o fragmento de tecido deve ser acondicionado em cassetes identificados, embrulhado quando pequeno e submetido ao chamado processamento histológico, que compreende três etapas: desidratação, diafanização e impregnação. A desidratação, em bateria com concentração crescente de alcoóis (80°, 90°, 100°), corresponde ao processo de retirada total de água do tecido, necessária para as etapas seguintes. Esse processo deforma o tecido, uma vez que os espaços de onde fora retirada a água se contraem (murcham). Conforme foi dito anteriormente, é necessário se manter a arquitetura tecidual, e isso é feito substituindo os espaços vazios deixados pela retirada da água por misturas de parafina e de polímeros plásticos fundidos a temperaturas em torno de 58° C e 60° C, chamados de Paraplast®. Esse processo é conhecido como impregnação. Sabendo da propriedade do álcool de não ser miscível com a parafina, utiliza-se o xilol como ponte entre álcool e parafina. O xilol também tem a propriedade de clarificar o tecido, fenômeno chamado de diafanização. O tempo de duração desse processamento histológico é proporcional ao tamanho do fragmento que se está processando. Figura 2 - Cassetes. a - Cassete com fragmento de biópsia (pequeno e embrulhado). b - Cassete com fragmento tecidual de peça cirúrgica (grande e não embrulhado). Solução de Susa a b 3.indd 18 11/08/12 20:30
19 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Material a ser processado Solução Tempo Peça cirúrgica Biópsias Pequenas Álcool 80° Álcool 95° 1º Álcool 100° 2º Álcool 100° 3º Álcool 100° 4º Álcool 100° 1º Xilol 2º Xilol 1ª Parafina 2ª Parafina 3ª Parafina Álcool 80° Álcool 95° 1º Álcool 100° 2º Álcool 100° 3º Álcool 100° 4º Álcool 100° 1º Xilol 2º Xilol 1ª Parafina 2ª Parafina 3ª Parafina 1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 2h 2h 2h 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 1h 1h 1h Caso não se disponha de processador automático de tecidos, o mesmo pode ser substituído por frascos de vidro, onde o processamento ocorrerá manualmente. 3.indd 19 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 20 2.3 Inclusão Nesta etapa, a amostra de tecido, que posteriormente será submetida ao processo de corte, necessita de um suporte que permita efetuar o processo. Chama-se inclusão o ato de emblocar esse fragmento em um meio que deve ser obrigatoriamente o mesmo em que foi embebido, ou seja, a mistura de parafina conhecida por Paraplast®. Já pensando na etapa seguinte, de corte, os fragmentos a serem emblocados devem obedecer a alguns critérios técnicos no seu posicionamento e na sua ordenação durante o processo de inclusão, o que facilitará a obtenção de um corte de qualidade. a b Figura 3 - Processadores. a - Modelo atual, com capacidade para 200 cassetes. b - Modelo antigo, com capacidade para aproximadamente 50 cassetes. Figura 4 - Central de inclusão ou autoinclusor. 3.indd 20 11/08/12 20:30
21 Após a inclusão, deve-se conferir o número de identificação e a quantidade de fragmentos de cada bloco, de acordo com o mapa estabelecido pelo serviço. Em seguida, os blocos são colocados em forma com gelo e enviados ao congelador por alguns minutos para endurecer. O bloco a ser cortado necessita estar gelado, e, de preferência, o ambiente do laboratório deve ser refrigerado, para permitir cortes de qualidade. e f d c a b Figura 5 - Fragmentos de tecido emblocados em parafina. a; b; c; d - Fotos de blocos de parafina contendo fragmentos de pele incluídos de forma correta. A epiderme (setas) orienta a in- clusão de forma paralela. e - Fragmento de tecido contendo lesão de aspecto cístico (seta) a ser examinada. f - Fragmento de tecido prostático com bordas (margens de se- gurança) pintadas em nanquim verde (seta). 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 21 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 22 2.4 Microtomia (corte) Para procedimento de corte necessita-se de micrótomo, navalha, banho-maria histológico, pinça, pincel, lápis e lâminas. Ao preparar a mesa de trabalho, deve-se observar se todos os botões do micrótomo estão bem apertados e se o suporte de navalhas está na angulação 10. O bloco retirado do gelo é fixado ao micrótomo e deve ser aparado até que todo o fragmento seja exposto e, a partir daí, submetido ao corte. • Os cortes de rotina costumam variar entre 4 e 6 µ (micras). • Biópsias de linfonodo 3 µ (micras). • Biópsias de Medula óssea 2 μ (micras). • Cortes para reação de imuno-histoquímica 3 µ (micras). • Biópsias renais 2 µ (micras). • Por melhor que esteja a navalha, o corte sempre necessita ser mais bem esticado, e, algumas vezes, pregas se formam sobre o tecido. Utiliza-se neste momento o banho-maria histológico, que permite a obtenção de corte de qualidade que será pescado em lâmina de vidro. • A água do banho-maria deve estar em temperatura abaixo do ponto de fusão do meio de inclusão (mais ou menos 50° C). • Os cortes histológicos agora na lâmina devem ser colocados em estufa com temperatura superior ao ponto de fusão do meio de inclusão (máximo de 65° C), o que permite que a parafina que cir- cunda o corte escorra e o mesmo se fixe à lâmina de vidro. Os blocos agora cortados são enviados ao arquivo e, sempre que necessário, podem ser requisita- dos, gelados e cortados novamente para realização de outros procedimentos, como colorações especiais, imuno-histoquímica e biologia molecular. b c a Figura 6 - Mesa de microtomia. a - Micrótomo: corte. b - Banho-maria: estender. c. Banho-maria: pesca. 3.indd 22 11/08/12 20:30
23 2.5 Coloração de Rotina (HE) As lâminas acondicionadas em rede são retiradas da estufa e colocadas no primeiro frasco de xilol (seta preta) da bateria de coloração, onde o meio de inclusão que ainda resta na lâmina é retirado. Seguem- se mais 3 cubas com xilol (xilol 2, 3, 4), 2 cubas com álcool absoluto 100º (que retiram o xilol), álcool 95°, álcool 80° e, finalmente, água corrente. • Numa pia, cora-se hematoxilina (núcleos) por três minutos. Lava-se em água corrente. • Diferencia-se rapidamente com álcool-ácido 1%. Lava-se em água corrente. • Azula-se com água amoniacal por 30 segundos. Lava-se em água corrente. • Retorna-se à bateria de coloração (álcool 95°, duas cubas, seta vermelha). • Mergulha-se em eosina (citoplasma) por um minuto. • Inicia-se a desidratação através de duas cubas de álcool 95°, cinco cubas de álcool 100° (absoluto, seta verde) e três cubas de xilol; nessa fase, as lâminas estão prontas para serem montadas. 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Hematoxilina Sulfato de alumínio e potássio Álcool 95 Óxido vermelho de mercúrio • Dissolver às vésperas do preparo a hematoxilina no álcool e o sulfato de alumínio e potássio na água, que deve ser aquecido em torno de 80° C. • No dia do preparo, levar a solução de sulfato de alumínio e potássio ao fogo e retirar após a fervura. •Acrescentardemaneiracuidadosaelenta,comconstanteagitação,asoluçãodehematoxilina em álcool e voltar à fonte de calor. • Ferver por várias vezes, retirando e voltando ao fogo, por mais ou menos dez minutos. • Acrescentar lenta e cuidadosamente o óxido vermelho de mercúrio, agitar e retornar à fonte de calor. • Ferver por mais ou menos dez minutos, colocando e retirando da fonte de calor várias vezes. • Resfriar imediatamente em água corrente, acondicionar em frasco escuro e filtrar quando usar. 5 g 100 g 50 ml 2,5 g Figura 7 - Esquema de bateria de coloração de rotina. Hematoxilina de Harris 3.indd 23 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 24 2.6 Montagem Os cortes histológicos, agora corados, necessitam ser recobertos por preservação e melhor refração no momento da microscopia. Para isso se utiliza um meio de montagem (Entellan®, Erv Mounth®, verniz etc.) que possibilite a fixação da lamínula de vidro sobre o corte histológico. Figura 8 - Procedimento de montagem de lâmina. a - Lâmina retirada da cuba de xilol. b - Lâmina sendo montada. c - Utilização da lamínula. d - Meio de montagem. Solução-mãe Solução aquosa de eosina a 1% Solução aquosa de floxina a 1% Solução uso (misturar em proveta ou cálice): Álcool comercial (95%) Solução de eosina aquosa a 1% Solução de floxina aquosa a 1% Ácido acético glacial PA puro a b c d 400 ml 50 ml 5 ml 2 ml Solução de Eosinafloxina 3.indd 24 11/08/12 20:30
25 Figura 9 - Lâminas prontas para leitura e diagnóstico. Os blocos dos quais foram confeccionados os cortes histológicos são acondicionados em gavetas de arquivo de madeira e, posteriormente, colocados em caixas de papelão apropriadas, quando são enviados ao arquivo definitivo do serviço. Durante a leitura da lâmina o profissional médico pode necessitar de outras colorações, chamadas de especiais, para ajudar no diagnóstico. Neste caso, os blocos escolhidos são retirados do arquivo nova- mente gelados e submetidos à microtomia – estufa – xilol – álcool 100° – álcool 95° – 80° e água. Então procedem-se as colorações solicitadas conforme o capítulo a seguir. Figura 10 - Arquivo. a - Arquivo de bloco tipo armário com gavetas, provisório, localizado no labo- ratório. b - Caixa arquivo de papelão, definitiva, armazenado no arquivo geral do ser- viço. b a 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 25 11/08/12 20:30
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27 3 Colorações histológicas para grânulos, depósitos e pigmentos 3.indd 27 11/08/12 20:30
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29 Colorações especiais A solicitação de coloração especial, ou específica, é um procedimento feito pelo patologista ou pesquisador sempre que a lâmina corada por Hematoxilina & Eosina (HE) não for suficiente para diagnóstico ou mostrar estruturas que necessitam ser melhor esclarecidas. Elas se prestam para corar pigmentos, bactérias, fungos, substâncias amorfas, estruturas teciduais e para classificar as fibras que compõem o tecido examinado. Neste capítulo, cada coloração especial, ou específica, será tratada obedecendo a seguinte ordem: seu nome, a técnica de coloração seguida do preparo das drogas e corantes utilizados, seu resultado esperado e foto ilustrativa do procedimento. Com o intuito de ser mais didático, o capítulo está dividido em grupos específicos. 3.1 Substância amiloide Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Colocar as lâminas de 40 minutos a uma hora em tubete com solução de vermelho-congo. • Lavar em água corrente. • Diferenciar as lâminas rapidamente em solução de álcool a 50% e hidróxido de sódio a 1%. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Corar pela Hematoxilina de Van Gienson (Weigert) por 15 a 30 segundos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Desidratar e montar as lâminas. Resultados Substância amiloide: corada em tom alaranjado. Núcleo: corado em tom azul. Preparo de soluções Solução de vermelho-congo Solução de vermelho-congo Água destilada 1 g 100 ml Hidróxido de sódio 1 % Hidróxido de sódio 1% Água destilada 1 g / 0,5g 100 ml / 50ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de álcool + hidróxido de sódio 1 % Hidróxido de sódio 1% Álcool 50% 1 g / 0,5g 100 ml / 50 ml Esta solução deve ser preparada na hora do uso. Vermelho-congo 3.indd 29 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 30 Hematoxilina férrica de Weigert - Solução A* Hematoxilina Álcool 95 º 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Solução de cloreto de Ferro 29 % - Solução B* Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17 % Ácido clorídrico PA 99 ml 1 ml *Na hora do uso, misturam-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu- ção sobre a lâmina. Figura 11 - Material amiloide de aspecto alaranjado presente em vasos sanguíneos. a - Vermelho-congo, 100x. b - Vermelho-congo, 200x. b a Solução de cloreto de Ferro 1,17% Cloreto de ferro III ou férrico Água destilada 1,17 g 100 ml Desprezar 1,0 ml desta solução. 3.indd 30 11/08/12 20:30
31 3.2 Glicogênio Procedimento • Colocar ácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos. • Lavar em água destilada. • Deixar escorrer bem a água. • Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos. • Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada. • Lavar em água corrente. • Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem – Entelan. Resultados Núcleos: azul-arroxeado. Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro. Glicogênio,mucina,fibrinaoutrombo,gotasdecoloide,depósitoshialinos,membranasbasaisetc. Reação Positiva: vermelho-púrpura. Preparo de soluções Ácido periódico 0,5 % Ácido periódico Água destilada 0,5 g / 2,5 g 100 ml / 500 ml Metabissulfito de sódio 10% Metabissulfito de sódio Água destilada 10 g / 5 g 100 ml / 50 ml Ácido clorídrico 1 N Ácido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 % Água destilada 41,25 ml 458,75 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Água sulfurosa Metabissulfito de sódio 10% Ácido clorídrico 1 N Água destilada 10 ml / 5 ml 10 ml 180 ml / 90 ml Este reativo deve ser preparado na hora do uso. PAS sem digestão 3.indd 31 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 32 Procedimento •Salivar(cuspir)bemsobrealâminaedeixaremcâmaraúmidapor20minutos.Lavaraslâminas em água corrente para retirar a saliva. • Colocar ácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos. • Deixar escorrer bem a água. • Lavar em água destilada. • Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos. • Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada. • Lavar em água corrente. • Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Núcleos: azul-arroxeado. Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro. Mucina, fibrina ou trombo, gotas de coloide, depósitos hialinos, membranas basais etc. Reação Positiva: vermelho-púrpura. Obs.: Nesse PAS o glicogênio é digerido, portanto não cora na cor púrpura. Preparo de soluções Ácido periódico 0,5 % Ácido periódico Água destilada 0,5 g / 2,5 g 100 ml / 500 ml a b Figura 12 - Reação PAS positiva de cor fúcsia em mucosa intestinal. a - PAS, 100x. b - PAS, 200x. PAS com digestão 3.indd 32 11/08/12 20:30
33 Água sulfurosa Metabissulfito de sódio 10% Ácido clorídrico 1 N Água destilada 10 ml / 5 ml 10 ml 180 ml / 90 ml Ácido clorídrico 1 N Ácido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 % Água destilada 41,25 ml 458,75 ml Metabissulfito de sódio 10% Metabissulfito de sódio Água destilada 10 g / 5 g 100 ml / 50 ml 3.3 Lipídeos Preparo de soluções Água sulfurosa Sudan III ou IV Álcool 70º Acetona 1 g 50 ml 50 ml Filtrar esta solução antes do uso. A solução não se conserva por muito tempo. Pode-se usar Scarlet C no lugar de Sudan IV. 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Mergulhar rapidamente as lâminas em tubete com álcool 70%. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Sudan III ou IV, previamente filtrada, por dois a cinco minutos. Voltar o reativo para o frasco após o uso. • Lavar as lâminas rapidamente em álcool 70%. • Lavar em água corrente. • Corar os núcleos com Hematoxilina de Harris por um a dois minutos. • Lavar cuidadosamente em água corrente. • Montar as lâminas com solução de gelatina de glicerina, previamente aquecida em micro -ondas. Não deixar formar bolhas. Resultados Lípideos Neutros: corados em tom vermelho-vivo. Ésteres de colesterol: corados em tom alaranjado. Sudan Este reativo deve ser preparado na hora do uso. 3.indd 33 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 34 3.4 Muco Procedimento •CoraraslâminasemhematoxilinadeHarrisportrêsacincominutos,dependendodaqualidade do corante. Diferenciar em álcool-ácido. •Enquantoaslâminasestãonahematoxilina,filtrarasoluçãodemucicarmimqueseráutilizada. • Lavar as lâminas em água corrente. • Azular na solução de amônia por 40 segundos. • Lavar as lâminas em água corrente. • Corar em solução de mucicarmim diluída com a mesma quantidade de água destilada, por 30 minutos. • Lavar as lâminas em água corrente rapidamente. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Muco: vermelho (carmim). Núcleos: negros. Cápsulas de criptococos: vermelho (carmim). Outros elementos do tecido: amarelos. Meio de montagem - geleia de glicerina Gelatina Água destilada Glicerina Fenol (cristais) 5 g / 10 g / 2,5 g 30 ml / 60 ml / 15 ml 35 ml / 70 ml / 17,5 ml 0,125 g / 0,25 g / 0,0625 g a b Figura 13 - Marcação alaranjada em glândula sebácea. a - Sudan, 40x. b - Sudan, 400x. Mucicarmim Dissolver a gelatina na água em um béquer em banho-maria (água esquentada no micro -ondas), adicionar a glicerina e o fenol. Conservar o meio de montagem em frasco vedado na geladeira. Quando for necessário usar, aquecê-lo no micro-ondas. 3.indd 34 11/08/12 20:30
35 Preparo de soluções Amarelo de metanilo - estoque Amarelo de metanilo Água destilada 0,25 g 100 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Figura 14 - Mucosa intestinal mostrando criptas com positividade carmim para mucinas. a - Mucicarmim, 100x. b - Mucicarmim, 200x. b a Solução matriz de mucicarmim Carmim Cloreto de alumínio Água destilada 1 g 1 g 100 ml Colocar os três reagentes em um balão volumétrico de 500 ml e agitar bem. Acrescentar pequenas quantidades (cerca de 0,5 g) de cloreto de alumínio aos poucos, agitando bem. Levar o balão para o micro-ondas e colocar em potência média/máxima. Assim que come- çar a levantar fervura, desligar o micro-ondas. Repetir o processo por três vezes. Retirar do micro-ondas, deixar esfriar e guardar na geladeira. Amarelo de metanilo uso Amarelo de metanilo estoque Água destilada 10 ml 40 ml Na hora do uso, retirar o volume que será utilizado sobre as lâminas e pingar de uma a duas gotas de ácido acético glacial para acidificar a solução. 3.indd 35 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 36 Preparo de soluções Solução de nitrato de prata 10% Solução de cloreto de ouro uso Nitrato de prata Solução-matriz de cloreto de ouro 1% Água destilada Água destilada 10 g / 5 g / 2,5 g 10 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml 40 ml 3.5 Células cromafins Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água. • Preparar a prata de Fontana-Masson. • Colocar as lâminas em tubete com a solução de prata de Fontana e levar à estufa a 37º C por uma hora, até que os cortes apresentem uma coloração marrom-clara. Após 45 minutos de estufa, verificar constantemente a cor das lâminas, já que a temperatura da estufa pode variar. Se após esse tempo as lâminas ainda estiverem claras, retirar da estufa e deixar esfriar por cinco minutos à temperatura ambiente. • Enxaguar em água destilada três vezes. • Matizar em solução de cloreto de ouro por dez minutos. • Enxaguar em água destilada. • Colocar em tubete com solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos. • Enxaguar em água destilada. • Corar fundo com solução de vermelho-neutro nuclear sobre as lâminas por cinco minutos. • Enxaguar bem com água destilada. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Grânulos argentafins: corados em negro. Melanina: corada em negro. Núcleos e citoplasma: corados em rosa-claro. Solução de nitrato de frata de Fontana Procedimento • Separar pequeno volume da prata 10% preparada de 3 a 5 ml. • Pingar hidróxido de amônia concentrado gota a gota na solução de maior volume. Logo nas primeiras gotas a solução irá turvar, ficar pardacenta. • Adicionar amônia gota a gota até clarear esta solução novamente. Quando clarear, pingar gota a gota o restante do nitrato de prata, até que a solução turve novamente. Esta solução turva é que será utilizada na coloração. Filtrar antes de usar. Fontana Masson 3.indd 36 11/08/12 20:30
37 Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g 100 ml Solução de vermelho-neutro nuclear Vermelho-neutro nuclear Água destilada 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Figura 15 - Melanócitos da epiderme mostrando positividade granular e escurecida. a - Fontana Massom, 100x. b - Fontana Massom, 200x. a b 3.6 Pigmento biliar Preparo de soluções Solução reagente de Fouchet Solução aquosa de cloreto de ferro 10% Solução aquosa de ácido tricloroacético 25% 1 ml / 5 ml / 10 ml 10 ml / 50 ml /100 ml Solução de picro fucsina de Van Gienson – solução-mãe Solução aquosa fucsina ácida 1% Solução aquosa de ácido pícrico 2,5 ml 97,5 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Lavar em água destilada. • Corar pelo reagente de Fouchet por cinco minutos. • Lavar em água corrente por dois a três minutos. • Corar pela solução de Van Gienson durante cinco minutos. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Pigmento biliar: corado em verde-oliva. Colágeno: corado em vermelho. Outras estruturas: coradas em amarelo. Fouchet 3.indd 37 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 38 Solução de picro fucsina de Van Gienson - solução uso Solução-mãe Água destilada 10 ml 40 ml Solução de vermelho-neutro nuclear 1% Vermelho-neutro nuclear Água destilada 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Solução de nitrato de prata 1% Nitrato de prata Água destilada 1,0 g / 0,5 g / 0,25 g 100 ml / 50 ml / 25 ml 3.7 Cálcio Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Colocar as lâminas em tubete com solução de prata a 1% por uma hora exposto ao sol ou bem próximo a uma lâmpada. • Lavar em água destilada. • Corar os núcleos com vermelho-neutro nuclear ou safranina o pingado sobre a lâmina por 30 segundos. • Lavar em água corrente. • Desidratar, diafanizar e montar as lâminas. Resultados Cálcio: corado em negro-opaco. Preparo de soluções Van Kossa Figura 16 - Calcificações de tonalidade escura em túbulos renais (Van Kossa, 400x). 3.indd 38 11/08/12 20:30
39 3.8 Ferro Procedimento • Dependendo da quantidade de lâminas a ser corada, preparar uma solução com partes iguais de ferrocianeto de potássio e ácido clorídrico. • Deixar as lâminas em tubete com esta solução por 30 minutos. • Lavar as lâminas rapidamente em água destilada. • Contracorar com solução de eosina 1% (preparar na hora diluição 1:9) por 30 segundos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Retirar as lâminas do tubete. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Pigmentos de ferro: azul. Núcleos: vermelhos. Citoplasma: róseo. Solução de ferrocianeto de potássio a 10% Solução de nitrato de prata 1% Eosina 1% Ferrocianeto de potássio Ácido clorídrico PA Eosina Água destilada Água destilada Água destilada 10 g / 5 g 20 ml / 10 ml / 5 ml 1,0 ml / 0,5 ml / 0,25 ml 100 ml / 50 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml Preparo de soluções Figura 17 - Depósitos hepáticos de hemossiderina. Positividade azulada e granular em depó- sitos hepáticos de hemossiderina. a - Perl’s, 200x. b - Perls, 400x. a b 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Perl´s 3.indd 39 11/08/12 20:30
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41 4 Coloração para tecido conjuntivo 3.indd 41 11/08/12 20:30
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43 4.1 Fibras colágenas Procedimento • Desparafinar e hidratar as duas lâminas que serão utilizadas na coloração em água corrente. • Colocar a hematoxilina de Weigert (soluções A e B) sobre as lâminas por dez minutos. • Lavar as lâminas em água corrente por dez minutos. • Colocar a solução de Van Gienson - Picrofucsina sobre as lâminas por cinco minutos. • Passar direto para o álcool 95º. • Retirar as lâminas do tubete. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras colágenas - vermelhas Núcleos - negros Citoplasma - amarelo. Hematoxilina férrica de Weigert - solução A Solução estoque de picrofucsina de Van Gienson Solução de cloreto de ferro 1,17% Solução uso de picrofucsina de Van Gienson Solução de cloreto de ferro 29% - solução B Hematoxilina Solução aquosa de fucsina ácida 1% Cloreto de ferro III ou férrico Solução estoque de picrofucsina Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17% Álcool 95º Solução aquosa de ácido pícrico Água destilada Água destilada Ácido clorídrico PA 1 g / 0,5 g 2,5 ml 1,17 g 10 ml 99 ml 100 ml / 50 ml 97,5 ml 100 ml 40 ml 1 ml Preparo de soluções 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Van Gienson Desprezar 1 ml desta solução. Na hora do uso, mistura-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu- ção sobre a lâmina. 3.indd 43 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 44 4.2 Fibras elásticas Procedimento • Colocar hematoxilina de Verhoeff sobre as lâminas por 15 minutos, até que fiquem negras. • Diferenciar na solução aquosa de cloreto de ferro (férrico) a 2%. Coloca-se o cloreto de ferro em um tubete e a água em outro tubete. Mergulha-se a lâmina no cloreto e depois na água. •Controla-seadiferenciaçãopelomicroscópioatéqueotecidoconjuntivotomeacordasolução de lugol. • Durante a diferenciação, deve-se agitar a lâmina dentro do tubete. Se a diferenciação for excessiva, recorar pela hematoxilina de Verhoeff. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Corar pela solução de Van Gienson (picrofucsina uso) por cinco minutos. • Passar as lâminas pelo álcool 95º. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras elásticas: negras. Núcleos: azuis ou negros. Colágeno: vermelho. Outros elementos do tecido: amarelos. Hematoxilina de Verhoeff - solução A Hematoxilina de Verhoeff - solução B Hematoxilina de Verhoeff - solução C Hematoxilina (cristais) Cloreto de ferro (férrico) Iodo metálico Álcool absoluto Água destilada Iodeto de potássio Água destilada 2,5 g / 0,5 g / 5 g 10 g / 5 g 2 g / 1 g 50 ml / 10 ml / 100 ml 100 ml / 50 ml 4 g / 2 g 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Na hora de usar, misturar as soluções na seguinte ordem e quantidade: Solução uso Solução A Solução B Solução C 2,5 ml / 1,25 ml 1 ml / 0,5 ml 1 ml / 0,5 ml Misturar em quantidade adequada à necessidade da rotina. Colocar esta solução sobre as lâminas. Preparar a solução na hora do uso. Verchoeff 3.indd 44 11/08/12 20:30
45 Ou Solução de Van Gienson (picrofucsina) - solução-mãe (Stock) Solução de Van Gienson (picrofucsina) - solução uso Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2% Solução aquosa de fucsina ácida 1% Solução-mãe Cloreto de ferro (férrico) Solução aquosa de ácido pícrico Água destilada Água destilada 2,5 ml 10 ml 2 g / 1 g 97,5 ml 40 ml 100 ml / 50 ml Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2% Solução aquosa de cloreto de ferro 10% Água destilada 20 ml 80 ml 4.3 Fibras reticulares 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Enquanto as lâminas estão no xilol, filtra-se o permanganato de potássio em cone de papel. • Oxidar pingando permanganato de potássio 0,5% já filtrado sobre as lâminas por um minuto. • Lavar rapidamente as lâminas em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Diferenciar pingando solução de ácido oxálico 3% sobre a lâmina por um minuto. • Lavar em água corrente, rapidamente, dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Sensibilizar pingando a solução de sulfato férrico amoniacal a 2% (ou alúmen de ferro 2%) sobre a lâmina por um minuto. • Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Reduzir na solução de formol 10%, colocando as lâminas em tubete, por três minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Matizar em cloreto de ouro 0,2%, em tubete, por cinco minutos. • Colocar de volta o reativo no frasco. • Lavar as lâminas em água corrente rapidamente. • Fixar a prata com tiossulfato de sódio 2%, em tubete, por um minuto. • Lavar rapidamente em água corrente. • Contracorar na solução de verde-luz por um a três minutos, dependendo da validade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras reticulares: negras. Coloração de fundo: esverdeada. Retículo 3.indd 45 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 46 Solução de permanganato de potássio 0,5% Permanganato de potássio Água destilada 0,5 g / 0,25 g 100 ml / 50 ml Solução de ácido oxálico 3% Ácido oxálico Água destilada 15 g / 9 g / 3 g 500 ml / 300 ml / 100 ml Solução de hidróxido de potássio a 10% Hidróxido de potássio Água destilada 10 g / 5 g / 2,5 g 100 ml / 50 ml / 25 ml A solução de prata amoniacal deve ser preparada na hora do uso. Os reagentes utilizados em seu preparo já ficam prontos, com exceção do nitrato de prata a 10%, que deve ser pre- parado na hora. Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2% Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferro Água destilada 8 g / 2 g / 1 g 400 ml / 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Solução de nitrato de prata a 10% Nitrato de prata Água destilada 0,5 g / 0,25 g 5 ml / 2,5 ml Pesar a quantidade de droga necessária de acordo com a quantidade de lâminas a serem coradas. Geralmente, em nossa rotina, usamos a receita inteira, ou seja, 5,0 ml. Solução de formol a 10% Formol PA Água destilada 10 ml / 5 ml 100 ml / 50 ml Esta solução deve ser preparada na hora do uso. Solução de prata amoniacal Solução aquosa de nitrato de prata 10% Solução aquosa de hidróxido de potássio Hidróxido de amônia concentrado 5 g / 2,5 g 50 ml / 25 ml 1,5 ml (20 a 24 gotas) / 0,75 ml (10 a 12 gotas) Pipetar o hidróxido de potássio no béquer do nitrato de prata e misturar levemente. Colocar a amônia gota a gota até que o precipitado formado desapareça e a solução fique bem clara, transparente como água. Em seguida, filtrar e dobrar o volume da solução com água destilada. Este reativo deve ser desprezado após o uso. 3.indd 46 11/08/12 20:30
47 Solução-mãe de cloreto de ouro a 1 % Ampola de 1 g de cloreto de ouro Água destilada uma ampola 100 ml Figura 18 - Trama reticular enegrecida em fígado cirrótico (Retículo, 200x). 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml Em geral, preparamos quatro receitas, o que nos dá um volume final de 400 ml. Solução de cloreto de ouro 0,2% Solução de cloreto de ouro 1% Água destilada 10 ml 40 ml Preparar sempre entre duas receitas, o que dá 100 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses, ou até que fique em tom de amarelo muito claro. 3.indd 47 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 48 Dissolverahematoxilinanocalor.Depoisdefria,acrescentaroácidofosfotúngstico.Oama- durecimento é longo, de três a quatro semanas. Para amadurecimento rápido, acrescentar 0,02 g de permanganato de potássio. 4.4 Fibrina Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Zenker por 90 minutos na estufa 56º C. • Retirar as lâminas da estufa e deixar na mesma solução de Zenker, agora em temperatura ambiente por 15 minutos. • Colocar solução de Lugol sobre as lâminas por 15 minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas em solução de tiossulfato de sódio 2% por três minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas em tubete com hematoxilina fosfotúngstica de Mallory por 90 minutos na estufa 56º C. •Retiraraslâminasdaestufaedeixarnamesmahematoxilina,agoraemtemperaturaambiente, por 15 minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Desidratar e montar as lâminas. Resultados Conectivo: vermelho/amarelo. Estrias musculares: azuis. Fibroglia e microglia: azuis-escuros. Solução de hematoxilina fosfotúngstica Iodine Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2% Hematoxilina Iodine (iodo metálico) Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferro Ácido fosfotúngstico Iodeto de potássio Água destilada Água destilada Água destilada 0,1 g 1 g 8 g / 2 g / 1 g 2 g 2 g 100 ml 300 ml 400 ml / 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory (PTAH) 3.indd 48 11/08/12 20:30
49 Solução de Zenker Solução de tiossulfato de dódio 2% Dicromato de potássio Tiossulfato de sódio Cloreto de mercúrio Água destilada Sulfato de sódio Água destilada Ácido acético glacial 2,5 g / 1,25 g 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 5 g / 2,5 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml 5 ml / 2,5 ml 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 4.5 Colágeno Procedimento • Desparafinar, hidratar. • Corar pela mematoxilina de Groat por dez minutos. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Lavar em água acética a 1% por 30 segundos. • Corar em Rouge Mallory por dez minutos. • Lavar para retirar o excesso do corante com água acética a 1%. • Imergir as lâminas em solução de ácido fosfomolibdico a 10% por 10 minutos. • Lavar para retirar o excesso do ácido com água acética a 1%. • Corar com Vert-Lumiere ou Azul de Anilina por dez minutos. • Lavar em água acética a 1% para retirar o excesso do corante. • Desidratar, diafanizar e montar. Resultados Núcleos: marrons. Citoplasma, queratina e fibras musculares: vermelhos. Fundo: verde-claro. Colágeno: azul ou verde. Preparo de Soluções Tricrômico de Masson (tempo rápido) Água acética 1% Ácido acético Água destilada 5 ml 50 ml 3.indd 49 11/08/12 20:30
Rouge Mallory Fucsina ácida Orange G Ácido acético Água destilada 1 g 0,4 g 3 ml 300 ml Ácido fosfomolibdico 10% Ácido fosfomolibdico Água destilada 10 g 100 ml Vert-Lumiere – light-green Light-green Água destilada Ácido acético 1 g 100 ml 1 ml Azul de anilina 1% Azul de Anilina Água destilada Ácido acético 1 g 100 ml 1 ml 50 Hematoxilina de Groat - Solução A Álcool 95° Hematoxilina 50 ml 0,5 g Hematoxilina de Groat - Solução B Água destilada Ácido sulfúrico concentrado 50 ml 0,8 ml Sulfato férrico amoniacal 1 g Misturar Solução A + Solução B em partes iguais e dobrar o volume com água destilada. Figura 19 – Feixes de tecido conjuntivo de tonalidade azulada ao redor de fibras musculares (50x). 3.indd 50 11/08/12 20:30
51 5 Coloração para agentes etiológicos 3.indd 51 11/08/12 20:30
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53 Iodine de Gram Iodine (iodo metálico) Iodeto de potássio Água destilada 1 g / 0,5 g 2 g / 1 g 300 ml / 150 ml Preparo de soluções 5.1 Bactérias Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Pingar solução de cristal violeta filtrado sobre a lâmina e deixar por dois minutos. • Lavar em água corrente para retirar o excesso do corante. • Cobrir a lâmina com solução de Lugol por cinco minutos. • Lavar em água corrente. • Escorrer o excesso de água e colocar em acetona pura, diferenciando a lâmina com aproximadamente três a quatro mergulhos (verificar a olho nu a diferenciação). • Lavar em água corrente. • Lavar em água corrente para remover o excesso de ccetona. • Colocar solução de carbolfucsina sobre a lâmina de 1 minuto a 1 minuto e 30 segundos. • Lavar em água corrente. • Colocar em tubete com solução de Gallego por cinco minutos. •Lavaremáguacorrente,deixandoescorreroexcesso,epassarimediatamenteparatubetecom acetona pura, aproximadamente por três mergulhos. •Passaraslâminasemtubetecomácidopícricoeacetonaaproximadamenteportrêsmergulhos. • Passar as lâminas em tubete com acetona aproximadamente por três mergulhos. • Passar as lâminas por três mergulhos no xilol. • Montar a lâmina. Resultados Bactérias gram-positivas: roxas. Bactérias gram-negativas: rosas. 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Gram Solução de hematoxilina fosfotúngstica Hematoxilina Ácido fosfotúngstico Água destilada 0,1 g 2 g 100 ml Filtrar antes de usar. 3.indd 53 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 54 Carbol fucsina Solução de Gallego Ácido pícrico acetona Fucsina básica Formol concentrado Ácido pícrico Fenol (ácido fênico) Ácido acético glacial Acetona Álcool absoluto Água destilada Água destilada 1 g / 0,5 g / 0,25 g 1 g / 0,5 g 1 g / 0,5 g 5 g / 2,5 g / 1,25 g 0,5 ml / 0,25 ml 100 ml / 50 ml 10 ml / 5 ml / 2,5 ml 50 ml / 25 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml Figura 20- Agrupamento de bactérias com positividade azulada (Gram, 400x). 3.indd 54 11/08/12 20:30
55 5.2 Tuberculose Procedimento • Colocar as lâminas em suporte próprio (bandeja) para colocar os reativos utilizados sobre a lâmina. •ColocarasoluçãodeZiehl-Neelsenfiltradasobreaslâminasedeixarde40minutosaumahora aproximadamente. • Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante. • Colocar álcool-ácido em um tubete. • Diferenciar as lâminas, uma a uma, mergulhando-as em álcool ácido e lavando em cuba com água corrente até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais. • Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em uma cuba com água corrente (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos. • Mergulharaslâminas,umaauma,notubetecomsoluçãousodeazuldemetileno,rapidamente, cerca de dois ou três mergulhos intercalados com lavagens em cuba com água corrente. • Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem. • Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos brilhantes. Outros elementos do tecido: azuis-claros. Fucsina fenol de Ziehl Fenol Álcool absoluto Fucsina básica Água destilada 20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g 40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml 4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g 400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml Preparo de soluções Álcool-ácido 1% Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe) Álcool 70% Azul de metileno Ácido clorídrico Álcool comercial (95º) 500 ml 1,4 g 5 ml 100 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Ziehl-Neelsen 3.indd 55 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 56 5.3 Lepra Solução uso de azul de metileno Azul de metileno estoque Água destilada 10 ml 90 ml Figura 21 - Bacilos avermelhados, intracelulares, presentes em tecido pulmonar. a - Ziehl-Neelsen, 200x. b - Ziehl-Neelsen, 400x. Procedimento • Nesta coloração, as lâminas não são desparafinizadas no xilol, e sim na terebentina. O tempo de exposição é o mesmo utilizado para o xilol. • Lavar as lâminas em água corrente para retirada do excesso de terebentina. Secar as lâminas em papel de filtro. •ColocarasoluçãodeZiehl-Neelsenfiltradasobreaslâminasedeixarde40minutosaumahora aproximadamente. • Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante. • Colocar álcool-ácido em um tubete. • Diferenciar as lâminas, uma u uma, mergulhando-as em álcool-ácido e lavando em cuba com água corrente, até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais. • Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em água corrente em uma cuba (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos. • Mergulharaslâminas,umaauma,notubetecomsoluçãousodeazuldemetileno,rapidamente, cercadedoisoutrêsmergulhosintercalados,dependendodavalidadedocorante,comlavagens em cuba com água corrente. • Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem. • Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos. Filamentos de nocárdia: vermelhos. Bacilos de lepra: vermelhos. Fundo: azul-pálido. Fite-faraco a b 3.indd 56 11/08/12 20:30
57 Preparo de soluções Álcool-ácido 1% Álcool 70% Ácido clorídrico 500 ml 5 ml Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe) Azul de metileno Álcool comercial (95º) 1,4 g 100 ml Solução uso de Azul de metileno Azul de metileno estoque Água destilada 10 ml 90 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Fucsina fenol de Ziehl Fenol Álcool absoluto Fucsina básica Água destilada 20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g 40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml 4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g 400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml Esta solução deve ser filtrada antes do uso. Figura 22 - Aglomerados de bacilos de Hansen de tonalidade avermelhada em derme. a - Fite-Faraco, 200x. b - Fite-Faraco, 1000x. a b 3.indd 57 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 58 5.4 Fungos Procedimento • Colocar as lâminas para oxidar em tubete ou cálice de vidro com solução aquosa de ácido crômico a 5% por 40 minutos. Caso necessário, o tempo pode ser maior. • Voltar o reativo para o frasco. • Lavar as lâminas em água corrente. • Mergulhar as lâminas na solução de bissulfito de sódio a 1% por um minuto para remover o ácido crômico. • Lavar as lâminas em água corrente duas vezes. • Lavar as lâminas em água destilada duas vezes. • Deixar água destilada em quantidade suficiente para cobrir as lâminas no tubete. • Mergulhar na solução de nitrato de prata metanamina. • Levar o tubete e o recipiente onde foi preparada a solução de prata metanamina para o micro -ondas. • Iniciaroaquecimentodaprataparaqueestaalcancecercade56ºCdetemperatura,colocando -se o micro-ondas em potência máxima por 50 segundos. • Descartaraáguadestiladadotubeteesubstituí-lapelasoluçãodenitratodepratametanamina. • Ligar o micro-ondas em potência média por dez segundos. Abrir e verificar a impregnação da prata. Ir repetindo este procedimento, intercalando com um tempo, na potência mínima, de seis segundos, para não aquecer muito a prata, até se verificar que os cortes atingiram uma cor amarelo-pardacenta, indicando que a impregnação está correta. • Retirar o tubete do micro-ondas e lavar várias vezes em água corrente. • Colocar solução de cloreto de ouro a 0,2% no tubete por cinco minutos. • Lavar em água corrente. • Remover a prata não reduzida passando pela solução de tiossulfato de sódio a 2% por cinco minutos. • Lavar em água corrente cuidadosamente. • Preparar a solução de amarelo de metanilo a 0,25% em quantidade suficiente para cobrir as lâminas na bandeja. • Acidificar o amarelo de metanilo, pingando uma gota de ácido glacial acético. • Colocar as lâminas na bandeja de coloração e pingar sobre os cortes o amarelo já acidificado. • Lavar as lâminas cuidadosamente em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fungos: negros. Mucina: preto-acinzentada. Partes centrais do micélio e hifas: rosa-avermelhadas. Coloração de fundo: amarela. Prata metenamina de Gomori (GMS) 3.indd 58 11/08/12 20:30
59 Preparo de soluções Solução de ácido crômico 5% Ácido crômico Água destilada 5 g / 10 g /20 g 100 ml / 200 ml / 400 ml Bissulfito de sódio Bissulfito de Sódio Água destilada 1 g / 2 g 100 ml / 200 ml Solução de Bórax Bórax, ou ácido bórico Água destilada 5 g / 10 g 100 ml / 200 ml Solução de nitrato de prata 5% Nitrato de prata Água destilada 5 g / 10 g 100 ml / 200 ml Solução-mãe de cloreto de ouro 1% Ampola de 1 g de cloreto de ouro Água destilada uma ampola 100 ml Solução de metanamina 3% Hexamethylenotetramine ou metanamina ou urotropina Água destilada 3 g / 6 g / 9 g 100 ml / 200 ml / 300 ml Solução de cloreto de ouro 0,2% Solução de cloreto de ouro 1% Água destilada 10 ml 40 ml Preparamos sempre entre duas receitas, o que nos dá 80 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses ou até que fique em tom de amarelo muito claro. 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de prata metanamina Solução metanamina 3% Solução de bórax 5% Nitrato de prata 5% Água destilada 25 ml / 50 ml 2 ml / 4 ml 1,25 ml / 2,5 ml 25 ml / 50 ml Preparar esta solução com os reativos sempre nesta ordem. A quantidade de reagente pre- parado depende da quantidade de lâminas que estão sendo coradas. Este reagente deve ser sempre preparado na hora do uso. 3.indd 59 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 60 Amarelo de metanilo - estoque Amarelo de metanilo Água destilada 0,25 g 100 ml Figura 23 - Positividade escurecida em parede de fungos (paracoccidioidomicose), GMS, 200x. Amarelo de metanilo uso Amarelo de metanilo stock Água destilada 10 ml 40 ml Acidificar com uma a duas gotas de ácido acético glacial na hora do uso. Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml Em geral, preparamos quatro receitas, o que dá um volume final de 400 ml. 3.indd 60 11/08/12 20:30
61 5.5 Espiroquetas Preparo de soluções Solução A da água tamponada de pH 3,6 (fica na geladeira) Acetato de sódio Água destilada 1,64 g / 8,2 g 100 ml / 500 ml Solução B da água tamponada de pH 3,6 (preparar na hora do uso ) Ácido acético glacial Água destilada 0,59 ml / 1,18 ml / 5,9 ml 50 ml / 960 ml / 480 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Nesta reação, utilizar sempre água tamponada para lavagem das lâminas e preparo das soluções. • Deve-se preparar os reativos antes do início da reação, de preferência enquanto as lâminas estão desparafinando. Todos eles devem ficar na estufa 56º C durante toda a reação, inclusive o que sobrar de água tamponada. Cada um deve ser acondicionado em um béquer diferente, e o da prata deve ter capacidade para 60 ml de solução, já que a solução reveladora será preparada nele. • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água tamponada de pH 3,6, que estará em um tubete. • Impregnaroscortesnasoluçãodenitratodeprata1%,sempredissolvidaemáguatamponada, colocando as lâminas no tubete que já está na estufa 56º C junto com a prata, por uma hora. •ApósesteperíodoiremosdescartaraSoluçãodePrata1%emumbéquervazio.Oscortesainda estarão brancos, e não de cor acastanhada, o que só ocorrerá após a revelação. • Preparar a solução reveladora juntando os reativos que estão na estufa na seguinte ordem: solução de Prata 2%, gelatina e hidroquinona. Agitar levemente. • Colocar a solução reveladora no tubete onde estão as lâminas e observar atentamente, já que o processo derevelaçãoé bemrápido. Agora sim aslâminasficarão decor amarelo-pardacenta, acastanhada. • Após a revelação, descartar a solução reveladora e lavar as lâminas com o restante da água tamponada que também estava na estufa. • Desidratar, clarificar e montar. • Depois de montadas, manter as lâminas em local escuro (dentro de uma gaveta ou entre bandejas), ao abrigo da luz. Resultados Espiroquetas: negras. Fundo: amarelo-canela. Warthin Starry Solução de água tamponada de pH 3,6 Solução A Solução B Água destilada 3 ml / 1,5 ml 37 ml / 18,5 ml 960 ml / 480 ml Para um tubete, até três lâminas, preparar 500 ml desta solução. 3.indd 61 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 62 Nitrato de prata 1 e 2% Pesar 0,68 g de nitrato de prata. Acrescentar 34 ml de água tamponada. Retirar 9 ml dessa solução e reservar. Esta será a prata 2% que será utilizada. O restante da prata que ficou no béquer (2%) terá seu volume dobrado com 25 ml de água tamponada e passará a ser a prata 1% utilizada na reação. Gelatina Gelatina Água tamponada 2,5 ml 45 ml Hidroquinona Hidroquinona Água destilada 0,3 g 3 ml Figura 24 - Corte de pulmão. Estruturas espiraladas, alongadas e negras (espiroquetas). Warthin Starry, 1000x. 3.indd 62 11/08/12 20:30
63 6 Coloração para sistema nervoso 3.indd 63 11/08/12 20:30
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65 6.1 Fibras nervosas Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água. • Pesar 5 g de AgNO3 e diluir em 25 ml de água destilada. Esta será nossa solução de prata 20% - solução A. • Separar 13 ml desta solução, aquecer no micro-ondas na potência mínima (20%) por aproximadamente 48 segundos. Colocar o termômetro e verificar se a prata atingiu a temperatura desejada de 56º C. Esta solução tem que ser preparada na hora do uso. • Caso a temperatura esteja adequada, colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente 5 minutos. •Retirarotubetedaestufa56ºCepassarparaaestufa37ºCpordezminutos,semretiraropapel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução B. • Lavar em água destilada morna (aquecida em tubete por 15 segundos em potência máxima no micro-ondas). • Os 12 ml de AgNO3 que restaram irão receber gotas de hidróxido de amônia. Logo na primeira gota, a solução irá ficar pardacenta. A partir da segunda gota, iremos pingando amônia para clarear a solução novamente (para este volume de prata, serão aproximadamente de 50 a 60 gotas). Essa prata deverá ser aquecida da mesma forma que a anterior antes de ser utilizada. Esta será nossa solução B. • Com a temperatura adequada (56º C), colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente cinco minutos. Retirar o tubete da estufa 56º C e passar para a estufa 37º C por dez minutos, sem retirar o papel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução reveladora, que será nossa solução C. • Preparar a solução reveladora de trabalho e a solução uso adicionando-se oito gotas de amônia concentrada e oito gotas da solução C a 50 ml de água destilada. Esta solução também deve ser preparada na hora do uso. • Retirar as lâminas da estufa, lavá-las em água destilada morna e colocá-las na solução reveladora uso até que as fibras nervosas (axônios) fiquem de cor negra, quando observados sobre um fundo amarelo. O tempo esperado para esta mudança pode estar entre um e cinco minutos, dependendo da região a ser corada (geralmente o tempo é de um a dois minutos). • Checar a lâmina ao microscópio para verificar se a impregnação está correta. •Lavaralâminaemáguaamoniacalfresca(oitogotasdeamôniapara50mldeáguaDestilada). • Lavar as lâminas em água destilada por um minuto. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Axônios: negros. Background: amarelo-acastanhado. Placas neuríticas e tangles: negros. Placas e amiloide vascular: castanhas/castanho-escuras. 6 Coloração Para Sistema Nervoso • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Bielschowsky 3.indd 65 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 66 Preparo de soluções Solução reveladora - estoque - solução C Ácido cítrico Formaldeído PA Ácido nítrico Água destilada 0,5 g / 0,25 g / 1 g 20 ml / 10 ml / 40 ml 2 gotas / 1 gota / 4 gotas 100 ml / 50 ml / 200 ml Figura 25 - Trama fibrilar de aspecto escurecido em processos axionais do encéfalo (Bielschowsky, 400x). Solução reveladora - uso - solução C Solução C – estoque Amônia Água destilada 8 gotas 8 gotas 50 ml Esta quantidade de solução uso é suficiente para se corar de cinco a dez lâminas. 3.indd 66 11/08/12 20:30
67 7 Imuno-histoquímica 3.indd 67 11/08/12 20:30
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69 7.1 Conceitos Básicos O termo surgiu das palavras imunologia, histologia e química. • Imunologia: estuda o sistema imunológico. • Histologia: estuda tecidos e órgãos com auxílio do microscópio. • Química: estuda os elementos da natureza e a maneira pela qual se ligam e reagem entre si. O processo de identificar antígenos nos tecidos com anticorpos através de cortes histológicos co- rados é chamado imuno-histoquímica. A coleta e os passos seguintes do material a ser estudado obedecem os mesmos passos do material colhido para diagnóstico de rotina Hematoxilina & Eosina (HE), ou seja, coleta, fixação, macroscopia, processamento histológico (desidratação, diafanização e inclusão), microtomia e pesca, sendo que, após esta fase, as lâminas com os cortes devem secar preferencialmente ao ar livre, ser escorridas em estufa, desparafinizadas e assim serem submetidas à técnica imuno-histoquímica, conforme protocolo básico abaixo. 7.2 Protocolo para reação de imuno-histoquímica 1. Cortes de 2 µm e 3 µm em lâminas silanizadas. 2. Secar bem as lâminas e escorrer a 60º C na estufa. 3. Desparafinizar em xilol. 4. RE hidratar em álcoois decrescentes 5. Lavar em água corrente e água destilada. 6. Proceder à recuperação antigênica conforme a orientação da bula. • Micro-ondas • Panela de pressão • Steamer – Panela a vapor – 96º C • Banho sorológico – 96º C a 98º C Tampões de recuperação antigênica • Citrato pH 6,0 • EDTA pH 8,0 • Tris EDTA pH 9,0 Independentemente do procedimento utilizado na recuperação antigênica, deve-se deixar esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente ou em água corrente. 7. Lavar as lâminas em tampão de lavagem (PBS ou TBS). 8. Bloquear a peroxidase endógena por meio do peróxido de hidrogênio/metanol a 0,5 /v/v durante dez minutos. 9. Lavar em lâminas em TBS por três minutos. 10. Incubar em soro bloqueador (bloqueio da proteína) durante dez minutos. 11. Incubar no anticorpo primário. 7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 69 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 70 Preparação das lâminas para imuno-histoquímica •OAPTS(silano)étóxicoecausaqueimadurasnapele,portantoomesmodeverásermanipulado com cuidado, utilizando luva. • Colocar as lâminas em berço de alumínio. • Preparar três cubas de vidro na capela de exaustão. - Cuba 1: solução de APTS a 6% em acetona. - Cuba 2: água destilada. - Cuba 3: água destilada. • Colocar a rede metálica com as lâminas na solução de APTS a 6% (cuba 1) por três minutos. Escorrer o excesso. • Colocar em água destilada (cuba 2) por três minutos. Escorrer o excesso. • Colocar em água destilada (cuba 3), imergir quatro vezes, escorrer o excesso e acondicionar as redes com as lâminas em bandeja forrada com papel filtro ou compressa cirúrgica, sendo que as lâminas devem ficar com a extremidade fosca voltada para cima. • Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite protegidas de poeira. • Guardar em caixas. Silano (silanização) • Colocar as lâminas em solução de Poly-L-lysina (1:10). Utilizar recipientes plásticos. • Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite. • Guardar as lâminas em caixas para evitar contaminação e poeira. Poly-L-Lysina 12. Lavar em TBS durante três minutos. 13. Incubar as lâminas no anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos. 14. Lavar em tampão TBS durante três minutos. 15. Incubar as lâminas em ABC – HRP por 30 minutos. 16. Lavar em TBS por três minutos. 17. Incubar as lâminas em DAB por cinco minutos. 18. Lavar as lâminas em TBS por três minutos. 19. Lavar em água destilada. 20. Corar na hematoxilina. 21. Lavar em água corrente. 22. Azular em água amoniacal. 23. Desidratar, diafanizar e montar em meio de montagem. Atécnica de imuno-histoquímica é um processo sensível de detecção molecular (antígenos), sendo de grande valor nos diagnóstico anatomopatológicos. O mecanismo básico é o reconhecimento do antíge- no por um anticorpo primário associado a diversos tipos de visualização 3.indd 70 11/08/12 20:30
71     a   b   d c Figura 26 - Positividade marrom em células malignas da mama, em pâncreas e linfonodo. a - Positividade em membrana (C-erb, 100x). b - Positividade nuclear (RE, 100x). c - Positividade citoplasmática. (CK-7, 100x). d - Positividade em membrana de linfócitos (CD3, 100x). 7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 71 11/08/12 20:30
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73 8 Descalcificação 3.indd 73 11/08/12 20:30
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75 Tecidos ósseos ou qualquer outro tecido contendo sais de cálcio requerem a remoção destes sais para posteriormente serem submetidos à técnica histológica. Esses fragmentos, após recorte com serra, são colocados em contato com as soluções descalcificadoras para a retirada dos sais de cálcio. Durante muito tempo, o ácido nítrico a 7,5% em solução aquosa foi considerado como uma boa solução descalcificadora. Esta solução tem o inconveniente de demorar a retirar o cálcio do material (dois, três, quatro ou mais dias), o que acaba destruindo o tecido mole adjacente. Hoje utiliza-se solução descalcificadora à base de EDTA, que permite maior rapidez, além de preservar o tecido adjacente. Para descalcificar biópsia de medula óssea, que contém espículas ósseas, ainda utiliza-se o ácido nítrico, porém a 2%. As biópsias já fixadas são colocadas na solução descalcificadora, onde permanecem durante o período das 7 horas até 16 horas, quando são retiradas da solução, lavadas por cinco minutos em água corrente e, então, são submetidas a processamento histológico. 8 Descalcificação • • • • • • • • • • • • • Solução descalcificadora com EDTA EDTA, tetrassódio Tartarato de sódio e potássio Tartarato de sódio Ácido clorídrico PA Água destilada 0,7 g 8,0 g 0,14 g 120 ml 900 ml 2 ml 98 ml Ácido nítrico PA Água destilada Solução ácido nítrico 2% (medula óssea) Ácido nítrico PA Água destilada 7,5 ml 92,5 ml Solução ácido nítrico 7,5% (tecido ósseo) 3.indd 75 11/08/12 20:30
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77 9 Protocolos especiais 3.indd 77 11/08/12 20:30
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79 A amostra recebida deve ser medida, embrulhada e acondicionada em cassete plástico para seguir processamento histológico: O fragmento deve ser incluído e cortado, sendo que devem ser obtidas dez lâminas sequenciais com dois cortes de 2 micras em cada lâmina. • As lâminas de números 1 e 10 são coradas por HE. • As lâminas de números 2,5 e 9 são coradas pelo tricrômico de Masson. • As lâminas de números 3, 6 e 8 são coradas pela técnica de prata metenamina – PAMS. Ver téc- nica a seguir. • As lâminas de números 4 e 7 são coradas pela técnica de PAS. • Nos casos de transplante renal, deve-se cortar mais duas lâminas para imuno-histoquímica. A avaliação de alguns tecidos requer uma rotina diferenciada, quer seja na fixação, processamen- to, espessura de corte e colorações específicas. Duas dessas situações são descritas abaixo: biópsia renal e de medula óssea. 9.1 Biópsia renal A amostra a ser examinada normalmente é obtida através de punção com agulha fina, resultando numa amostra de fragmento filiforme e delgado, que deve ser fixada em solução de Bouin alcoólico: Álcool 80% Ácido pícrico Formol PA 40% Ácido acético Solução de Bouin 300 ml 2 g 120 ml 30 ml Conservar a mistura em geladeira. Solução 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 30 min 30 min Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100° Xilol Xilol Parafina 1 (56° C - 58° C) na estufa Parafina 2 (56° C - 58° C) na estufa 9 Protocolos Especiais • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 79 11/08/12 20:30
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 80 Preparo de soluções Solução de ácido periódico 0,5% Ácido periódico Água destilada 0,5 g 100 ml Solução de ácido crômico 5% Ácido crômico Água destilada 0,5 g 100 ml Solução de bissulfito de sódio 1% Bissufito de sódio Água destilada 1 g 100 ml Procedimento • Antes de iniciar a coloração, preparar a solução impregnadora de prata metanamina. • Colocar esta solução na estufa a 56° C para que, na hora do uso, ela esteja quente. • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água corrente. • Colocar o ácido periódico a 1% sobre a lâmina por 15 minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Imergir as lâminas em ácido crômico 5% por cinco minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Colocar bissulfito de sódio 1% sobre a lâmina por cinco minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Passar por 6 trocas de água destilada. • Impregnar na solução previamente preparada (item 1) por aproximadamente 30 minutos. Os cortes devem ficar impregnados com coloração acastanhada. • Lavar em água destilada. • Imergir em solução de cloreto de ouro 0,1% por três a cinco minutos. • Lavar em água destilada. • Imergir em solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos. • Lavar em água destilada. • Corar em hematoxilina de Harris por um minuto. • Lavar em água corrente. • Corar com eosina por um minuto. • Desidratar, diafanizar e montar. Obs.: A coloração pela hematoxilina e eosina é opcional. Resultados Membranas de túbulos e glomérulos corados em negro. Método do ácido periódico prata metenamina de Gomori (PAMS) Solução de metanamina 3% Hexametyleno tetramina Água destilada 3 g 100 ml 3.indd 80 11/08/12 20:31
81 Solução de Bórax 5% Bórax ou ácido bórico Água destilada 5 g 100 ml Solução de nitrato de prata 5% Nitrato de prata Água destilada 5 g 100 ml Solução de cloreto de ouro 0,1% Cloreto de ouro Água destilada 0,1 g 100 ml Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g 100 ml Figura 27 - Colorações básicas na rotina de pato- logia renal. a - Córtex renal corado pela HE (100x). b - Córtex renal corado pelo tricrômico de Mas- son (100x). c - Glomérulos e túbulos renais impregnados com prata (400x). d - Imuno-histoquímica positiva em capilares pe- ritubulares e glomérulos. (C4d,100x). Solução de prata impregnadora Solução de metanamina 3% Solução de nitrato de prata 50 ml 2,5 ml Misturar e jogar fora 2,5 ml desta solução. Acrescentar 6 ml de solução de bórax 5%.   a b d c 9 Protocolos Especiais • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 81 11/08/12 20:31
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 82 Medula óssea As biópsias de medula óssea obtidas por punção, após fixadas, sofrem processo de descalcificação utilizando acido nítrico a 2% por oito horas. Seguem para o processamento histológico como biópsia pe- quena. Após inclusão, obtêm-se cortes para HE com espessura de 2 micras e lâminas para colorações de Perl’s e retículo com espessura de 4 micras. 3.indd 82 11/08/12 20:31
83 10 Técnicas citológicas 3.indd 83 11/08/12 20:31
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85 Este caderno prioriza as técnicas histológicas, porém não pode deixar de mencionar noções bási- cas de citologia, as quais estão descritas com detalhes nos Cadernos de Referência 1 e 2, específicos da citologia. 10.1 Processamento de Líquidos e Secreções O material a ser submetido a estudo citológico deve ser enviado ao laboratório imediatamente após a coleta, sem fixador ou conservante, devidamente identificado e acompanhado de uma requisição contendo a história clínica do paciente. Estas amostras a serem processadas podem ser: lavados vesicais, brônquicos, líquidos ascítico e pleural, escarro, urina e outros. 10.1.1 Escarro A parte mais representativa (área espessa, sanguinolenta etc.) é colocada sobre uma lâmina de vidro e em seguida coberta com outra lâmina, que, após compressão e desligamento, transforma-se em esfregaços, que devem ser imediatamente fixados em álcool comercial (95%). Caso a amostra seja abun- dante, deverá ser fixada, submetida a processamento histológico, o qual poderá ser utilizado para proce- dimentos especiais (colorações especiais, imunoperoxidase, biologia molecular). Esses esfregaços devem ser corados pelos métodos de HE e H. Shorr. 10.1.2 Líquidos (lavados brônquico, vesical, urina, líquor, líquidos ascíticos e da cavidade toráxica) Estes líquidos são submetidos à centrífuga convencional para que haja concentração de elementos celulares (dez minutos/1.500 rpm), em seguida despreza-se o sobrenadante, e o sedimento é utilizado para confecção de esfregaço, que após fixação imediata é submetido à coloração. 10.2 Processamento deesfregaços/punções aspirativas por agulha fina (PAAF) Estes materiais são resultantes de PAAF de mama, tireoide e outros órgãos sólidos. As amostras são recebidas fixadas ou a seco (sem fixador). Os fixadores mais usados são o álcool 95° e o spray. Obs.: Lâminas fixadas em álcool ou spray podem ser coradas por HE ou H. Shorr. Para a coloração de Giemsa, o esfregaço deve ser seco ao ar livre antes de ser submetido à coloração. Fixação em citologia • Fixadores de spray - Que fixam e formam película protetora, a exemplo do polietilenoglicol dissolvido em álcool. • Fixadores líquidos - O álcool comercial (92% a 95%) é considerado fixador citológico uni- versal. Quanto mais curto for o período em segundos entre a confecção do esfregaço e a fixação, melhor será a qualidade deste. 10 Técnicas Citológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 85 11/08/12 20:31
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 86 Técnica de coloração diferencial de Shorr As lâminas fixadas em spray devem ser mergulhadas por dez minutos em álcool 80° para a reti- rada do fixador. Agora estas lâminas, juntamente com as recebidas em álcool 95°, passam pelo seguinte processo de coloração: Álcool 80° Álcool 70° Água corrente Corar pela hematoxilina Lavar em água corrente Álcool 95° Corante Shorr Álcool 95° 1º álcool 100° 2º álcool 100° 3º álcool 100° 4º álcool 100° 1º xilol 2º xilol Montar 10 mergulhadas 10 mergulhadas 10 mergulhadas 1 min 10 min 3 min 6 min Para retirar o excesso 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min - montar com resina e lamínula Lâminas fixadas em álcool 95° Álcool 80° Álcool 70° Lavar em água corrente Corar pela hematoxilina de Harris Lavar em água corrente Álcool 95° Eosinafloxina Álcool 95° 1º álcool absoluto 2º álcool absoluto 3º álcool absoluto 4º álcool absoluto 1º xilol 2º xilol Montar com resína e lamínula 1 min 1 min 1 min 10 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Técnica Coloração de H.E. (punções e líquidos) + - + - + - 3.indd 86 11/08/12 20:31
87 Caso se prefira uma coloração mais intensa, aumenta-se a concentração dos corantes, conforme abaixo. Giemsa Quando solicitado pelo patologista ou quando o laboratório recebe esfregaços secos sem fixação, o ideal é recorrer à coloração de Giemsa, que é específica para esfregaços secos, como segue abaixo: • As lâminas recebidas a seco são fixadas em álcool metílico por três minutos. • Preparar solução uso: diluir a solução-mãe de Giemsa na proporção de 2 ml do corante para 30 ml de água destilada. • Cobrir os esfregaços com solução uso do corante Giemsa e deixar corando por 30 minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Secar as lâminas ao ar livre ou estufa 60 °C. • Após secas, passar as lâminas discretamente no xilol. • Montar com resina e lamínula. Corante Shorr O corante Shorr é encontrado à venda pronto para uso, porém muitos serviços dão a opção de pre- parar seu corante, de acordo com a receita abaixo. 10 Técnicas Citológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução tricrômico de Shorr 0,3 g 0,075 g 0,075 g 0,025 g 0,25 g 0,25 g 100 ml 1 ml Biebrich Scarlat Azul de anilina Orange G Fast Green FCF Ácido fosfotúngstico Ácido fosfomolíbdico Álcool 50° C Ácido Acético Glacial Solução 1 g 0,25 g 0,075 g 0,1 g 0,5 g 0,5 g 100 ml 2 ml Biebrich Scarlat Orange G Fast Green FCC Azul de anilina Ácido fosfotúngstico Ácido fosfomolíbdico Álcool 50º C Ácido acético glacial 3.indd 87 11/08/12 20:31
Caderno de Referência 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 88 Preparo do corante giemsa 5 g 330 ml 330 ml Corante Giemsa Glicerina (não pode ser bidestilada) Álcool metílico (Metanol) Solução estoque • Deixar o corante Giemsa dissolver na glicerina em estufa a 60° C por 12 horas. • Esfriar em temperatura ambiente. • Deixar descansar por uma semana e mexer com bastão de vidro todos os dias. • Adicionar o álcool metílico após uma semana de descanso. • Filtrar (o processo de filtragem é demorado devido à viscosidade da glicerina). • Armazenar em frasco escuro. 3.indd 88 11/08/12 20:31
89 Referências MICHALANY J. Técnica Histológica em Anatomia Patológica. 3. ed. São Paulo: Editora Michalany, 1998. PROPHET, E. B.; Mills B. et al. Laboratory Methods In Histotechno-Armed Forces, Institute of Pathology. Washington, Estados Unidos: American Registry of Pathology, 1992. BANCROFT J. D.; STEVENS A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4. ed. Nova York, Estados Unidos: Churchill Livingstone, 1996. 89 3.indd 89 11/08/12 20:31
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Apêndice 3.indd 91 11/08/12 20:31
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93 Perfil dos autores Abel Dorigan Neto Biólogo; diretor técnico da Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (HCFMRP); diretor técnico do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMRP-USP). Gyl Eanes Barros Silva Médico, doutor em patologia pela Universidade de São Paulo (USP-SP); professor doutor da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMUSP-RP). 3.indd 93 11/08/12 20:31
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Caderno referencia 3 bvsms

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    ©Ministério da Saúde Todosos direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é da área técnica. Pode ser acessada na íntegra na Biblioteca Virtual em Saúde do Ministério da Saúde: http://www.saude.gov/bvs. Tiragem: 1a Edição - 2012 - 5.000 exemplares Elaboração, distribuição, informações: MINISTÉRIO DA SAÚDE Secretaria de Gestão do Trabalho e da Educação na Saúde Departamento de Gestão da Educação na Saúde Esplanada dos Ministérios, bloco G, sala 725 CEP: 70058-900, Brasília - DF Telefones: (61) 3315 2858 / 3315 3848 - Fax: (061) 3315 2862 E-mails: sgtes@saude.gov.br / deges@saude.gov.br Homepage: www.saude.gov.br/sgtes Coordenação: Maria Auxiliadora Córdova Christófaro Mônica Sampaio de Carvalho Mozart Julio Tabosa Sales Autor: Abel Dorigan Neto Revisão técnica: Gyl Eanes Barros Silva Coordenação editorial: Léa Simone Carvalho Mario Correia da Silva Impresso no Brasil / Printed in Brazil Projeto gráfico, diagramação, capa e arte final: Breno Santos Pessoa de Luna Dino Vinícius Ferreira de Araujo Apoio técnico Maria Aparecida Timo Brito Maria Ivanildes Resende de Oliveira Ilustração: Antonio Carlos Acioli da Silva Junior Normalização e revisão editorial: Centro de Estudos e Pesquisa em Saúde Coletiva - CEPESC Endereço: Rua São Francisco Xavier, 524 – 7º andar – Bl. D Maracanã – Rio de Janeiro – RJ www.cepesc.org.br cepesc@ims.uerj.br/ Cepesc@cepesc.org.br (21) 2569-1143/ 2234-7457 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Sandra Infurna, CRB nº 7 – 4607) D697 Dorigan Neto, Abel Caderno de referência 3: técnicas de Histopatologia / Abel Dorigan Neto - Brasília: Ministério da Saúde; Rio de Janeiro: CEPESC, 2012. 94p. (Coleção Cadernos de Referência; 3) ISBN 978-85-324-0035-2 1. Histopatologia. 2. Educação em Saúde. 3. Ensino Profissional. 4. Ensino Técnico. I. Título. II. Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde. CDU 576.385:37 Títulos para indexação: Em inglês: Notebook Reference 3: Histopathology techniques Em espanhol: Cuaderno de Referencia 3: técnicas de Histopatología 3.indd 2 11/08/12 20:30
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    Lista de abreviaturase siglas ABC AgNO3 APTS BAAR C-erb-2 Ck-7 CD3 DAB DEGES EDTA ETSUS GMS HE HRP HPV PA PAAF PAMS PAS PBS pH Profaps RE rpm SGTES SUS TBS Avidina-biotina-complexo Nitrato de Prata Aminopropiltrietóxi Bacilos Álcool-Ácido Resistentes Oncogene localizado no cromossoma 17q21 Citoceratina 7 Complexo proteico que ativa linfócitos T Diamino Benzidina Departamento de Gestão da Educação na Saúde Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético Escola Técnica do SUS Prata Metenamina de Gomori Hematoxilina e Eosina Peroxidase de Rábano (Horseradish) Papiloma Vírus Humano Pró-análise Punções Aspirativas por Agulha Fina Ácido Periódico Prata Metenamina de Gomori Ácido Periódico de Schiff Solução Tampão Salina Potencial Hidrogeniônico Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio Para a Saúde Receptor de Estrógeno Rotações por minuto Secretaria de Gestão da Educação na Saúde Sistema Único de Saúde Salina tamponada com tris 3.indd 3 11/08/12 20:30
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    5 SUMÁRIO Apresentação.................................................................................................................................. 1 Introdução................................................................................................................................... 2 Técnicashistológicas.................................................................................................................. 3 Colorações histológicas para grânulos, depósitos e pigmentos.................................................. 4 Coloração para tecido conjuntivo............................................................................................... 5 Coloração para agentes etiológicos............................................................................................ 6 Coloração para sistema nervoso................................................................................................. 7 Imuno-histoquímica.................................................................................................................... 8 Descalcificação........................................................................................................................... 9 Protocolos especiais.................................................................................................................... 10 Técnicas citológicas.................................................................................................................. Referências.................................................................................................................................... Apêndice........................................................................................................................................ 7 9 13 27 41 51 63 67 73 77 83 89 93 3.indd 5 11/08/12 20:30
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    7 Apresentação A Secretariade Gestão do Trabalho e da Educação na Saúde (SGTES) do Ministério da Saúde (MS), por meio da Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde do Departamento de Gestão da Educação na Saúde (DEGES), desenvolve políticas e programas com o propósito finalístico de ordenar recursos humanos para a saúde, como determina o Art. 200 da Constituição Federal, e, nesta perspectiva: • Atender ao que dispõe a Lei Nº 8080/90, especificamente no seu Art. 6º; • Contribuir para a adequada formação, alocação, qualificação dos profissionais e valorização e democratização das relações do trabalho; • Ampliar as oportunidades de formação profissional e de qualificação técnica para trabalhadores do nível médio, tendo como propósito a qualidade das Redes de Atenção à Saúde do SUS; • Consolidar, nos planos político, pedagógico e administrativo, as Escolas Técnicas do SUS (ETSUS). A efetividade, o atendimento oportuno e a qualidade dos serviços de saúde guardam intrínseca relação com a formação e a qualificação profissional. Portanto, é imprescindível que os acordos e respectivos contratos de colaboração entre os entes federativos, objetivando a organização da rede de atenção à saúde, assegurem recursos para o cumprimento e efetivação dos processos de formação e de qualificação técnica para o grupo de trabalhadores. Profissionais estes que formam o maior segmento da força de trabalho da área da saúde, os técnicos de nível médio. A efetivação dos objetivos do Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde (PROFAPS) implica a definição de diretrizes e prioridades para a área de formação profissional e de qualificação técnica com foco nos trabalhadores de nível médio do SUS. Entre essas prioridades está a formação do Técnico em Citopatologia. Para tanto, foi definido plano de trabalho cuja execução resultou no estabelecimento das “Diretrizes e Orientações para a Formação”, fundamentadas nas diretrizes e princípios das políticas nacionais da educação e da saúde, publicadas em 2011. Nessa linha, a SGTES/DEGES investiu na aquisição e produção de recursos e material didático específico para os cursos de formação profissional técnica, prioritários no PROFAPS e que estão sendo desenvolvidos pelas ETSUS. Para o curso técnico em citopatologia, a Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde, junto com as ETSUS e especialistas da área, definiu e coordenou o processo de elaboração e produção de material didático específico, o que traduz a relevância da formação profissional técnica de nível médio na política nacional de saúde. Este atlas (impresso e digital) é um desses recursos. Organizado tendo como referência as diretrizes para a formação do técnico em citopatologia, seguramente, é base tanto para a elaboração e definição do projeto político-pedagógico como para o desenvolvimento do curso. A produção de material bibliográfico para o Curso Técnico em Citopatologia inclui: • Atlas de Citopatologia Ginecológica (versão impressa e digital) • Caderno de Referência 1: Citopatologia Ginecológica • Caderno de Referência 2: Citopatologia Não Ginecológica • Caderno de Referência 3: Técnicas de Histopatologia 3.indd 7 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8 Apoiar o desenvolvimento do curso é o objetivo específico, contudo tem-se como propósito consolidar e ampliar a articulação das Escolas Técnicas com as Redes de Atenção à Saúde do SUS e, a partir dessa base, consolidar as Escolas como rede de excelência na formação profissional e na qualificação técnica do nível médio na área da saúde. Nessa perspectiva, fundamentada nos princípios das políticas de saúde, de educação e da regulação do trabalho, o SUS desenvolve a ordenação dos recursos humanos para a saúde. 3.indd 8 11/08/12 20:30
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    11 Desde oseu surgimento, as técnicas histocitopatológicas permitiram grande avanço às ciências biológicas e médicas. No entanto, nada foi tão impactante quanto o uso desses conhecimentos na diferenciação entre tumores benignos e malignos. De lá para cá, esse conhecimento tem se difundido com as mais diversas finalidades, para uma enormidade de áreas do conhecimento humano, tais como: medicina legal, genética, biologia molecular e em pesquisa básica com modelos experimentais e humanos. Dessas, a patologia cirúrgica é a mais significativa área. A interpretação histopatológica é crítica para estabelecer o diagnóstico de benignidade e malignidade e pode discriminar os diferentes tipos e graus de câncer, bem como determinar mecanismos e percursos moleculares específicos dos tumores. No câncer, essas informações são importantes para estimar o prognóstico e a melhor escolha do tratamento a ser ministrado. As técnicas citopatológicas também são usadas para o diagnóstico de outras patologias, como: doenças infecciosas, idiopáticas e autoimunes. Nos transplantes, a histologia continua sendo o método padrão-ouro para diagnóstico das rejeições, toxicidades e disfunções em geral. Outra importante aplicação histórica dos métodos citológicos é na prevenção do câncer, sobretudo ginecológico. A possibilidade de se revelar lesões precursoras do câncer de colo uterino, que representa a segunda causa de mortalidade por neoplasia entre mulheres brasileiras, promoveu um grande impacto na diminuição da morbimortalidade da população feminina. Diagnósticos preliminares, evitando procedimentos mais invasivos, podem ser obtidos nas punções da tireoide, da mama, dos linfonodos etc. No exame de congelação, o patologista pode fornecer informações imediatas para o cirurgião, com o paciente ainda aberto na sala de cirurgia, garantindo o melhor resultado possível para o paciente. A microscopia tradicional é agora suplementada por técnicas sofisticadas, como a imuno- histoquímica, a imunofluorescência e a hibridização in situ. Aqui, além de contribuir para o diagnóstico mais adequado, esses métodos também ajudam na identificação dos potenciais alvos terapêuticos (exemplo dos receptores hormonais nos tumores de mama e c-kit nos tumores do estroma gastrointestinal) e na tipagem de agentes etiológicos (por exemplo, separando os sorotipos mais carcinogênicos dos menos carcinogênicos do HPV). Para que todas essas funções sejam realizadas com sucesso, o material fornecido ao médico patologista deve ser de muito boa qualidade. Conhecer e observar os passos de todas as técnicas que aqui serão apresentadas é imprescindível para atingir esse objetivo, tornando o trabalho do técnico tão importante quanto o do patologista. 1 Introdução • • • • • • • • • • 3.indd 11 11/08/12 20:30
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    15 2.1 Fixação Significa oprocesso de interrupção dos fenômenos de putrefação pós-morte a fim de manter a integridade do tecido obtido através de ato cirúrgico, mantendo sua arquitetura e constituição química, preservando suas proteínas e antígenos e inativando enzimas proteolíticas causadoras da autólise, ou seja, conservando o tecido a ser estudado para que se mantenha o mais próximo possível de quando estava no paciente. Para isso, são utilizadas soluções químicas, isoladas ou em forma de mistura, para o processo chamado fixação. Imediatamente após a colheita do material através do ato cirúrgico, a amostra deve ser colocada em solução fixadora. Os fixadores penetram no tecido, tornando-o rígido e bloqueando os sistemas enzimáticos capazes de destruí-lo. Atualmente, além dos procedimentos de rotina Hematoxilina & Eosina (HE) e histoquímica, sabe- se que a solução de formol a 10% tamponado é o fixador ideal para imuno-histoquímica e reações de biologia molecular. O volume de fixador deve ser 20 vezes o volume do fragmento e o tempo de fixação varia de acordo com o tamanho (espessura) do mesmo; fragmentos pequenos, como biópsias obtidas em endoscopia, colonoscopia, punção de agulha fina tipo renal, hepática ou prostática, requerem em torno de quatro horas de fixação. Fragmentos maiores e com espessura em torno de 4 mm necessitam de até 12 horas. Orienta-se a quem estiver fazendo o recorte dessas peças cirúrgicas que, quando a espessura for de tamanho maior (útero, mama, estômago, baço etc), que elas sejam fatiadas com o intuito de se tornarem fragmentos mais delgados, facilitando, assim, a penetração do fixador. 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Figura 1 - Tecido em diferentes etapas de fixação. a - Peça cirúrgica a fresco. b - Peça cirúrgica fixada. c - Peça cirúrgica mal fixada. a b c 3.indd 15 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 16 Tipos fixadores Formol puro (37% - 40%) 100 ml Água destilada 900 ml Fosfato de sódio monobásico 4 g Fosfato de sódio dibásico 6,5 g Não necessita de tratamento pós-fixação Formol 10% tamponado (mais usado) Bicromato de potássio 2,5 g Cloreto de mercúrio 5 g Sulfato de sódio 1 g Água destilada 100 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 12 a 24 horas Tratamento após fixação com solução Zenker Após fixado, o material deverá ser lavado em água corrente por 12 a 24 horas para retirar o bicromato de potássio. Em seguida, deve ter início o processamento do material (desidratação, diafanização, inclusão, corte e pesca); após a obtenção dos cortes, retirar os cristais de cloreto de mercúrio do seguinte modo: • Desparafinar e levar até água corrente. • Colocar em solução de lugol de 10 a 15 minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar em solução de tiossulfato de sódio a 5% por três minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Corar pelo método desejado. Solução de Zenker Iodo metálico 1 g Iodato de potássio 2 g Água destilada 100 ml Solução de Lugol Tiossulfato de sódio 5 g Água destilada 100 ml Solução de Tiossulfato de Sódio 5% 3.indd 16 11/08/12 20:30
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    17 2 Técnicas Histológicas •• • • • • • • • • • • • • • • • • Bicromato de potássio a 3% 80 ml Formol puro 20 ml Tempo de fixação 6 a 12 horas Removerobicromatoantesdoprocessamentolavandoosfragmentoscomáguacorrentepor 12 horas. Solução de Regaud Álcool 90% 85 ml Formol puro 10 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 6 a 12 horas Preparar o fixador no momento do uso. Solução de Alfac Solução alcoólica saturada de ácido pícrico 80 ml Formol puro 15 ml Ácido acético glacial 5 ml Tempo de fixação 4 a 6 horas Solução de Gendre (fixador empregado para demonstração de glicogênio) Álcool absoluto 60 ml Clorofórmio 30 ml Ácido acético glacial 10 ml Tempo de fixação 3 a 6 horas Não é necessário tratamento pós-fixação. O material segue para processamento histológico. Solução de Carnoy Bicromato de potássio 2,5 g Cloreto de mercúrio 5 g Formol puro 5 ml Água destilada 100 ml Tempo de fixação 12 a 24 horas Remover o bicromato de potássio e os cristais de cloreto de mercúrio do mesmo modo utilizado no fixador de Zenker. Solução de Helly 3.indd 17 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 18 Bicloreto de mercúrio 4,5 g Cloreto de sódio 0,5 ml Água destilada 80 ml Formol puro 20 ml Ácido tricloroacético 4 g Tempo de fixação 12 a 24 horas Não necessita de tratamento pós-fixação. 2.2 Processamento histológico (desidratação, diafanização e impregnação) Uma vez fixado, o fragmento de tecido deve ser acondicionado em cassetes identificados, embrulhado quando pequeno e submetido ao chamado processamento histológico, que compreende três etapas: desidratação, diafanização e impregnação. A desidratação, em bateria com concentração crescente de alcoóis (80°, 90°, 100°), corresponde ao processo de retirada total de água do tecido, necessária para as etapas seguintes. Esse processo deforma o tecido, uma vez que os espaços de onde fora retirada a água se contraem (murcham). Conforme foi dito anteriormente, é necessário se manter a arquitetura tecidual, e isso é feito substituindo os espaços vazios deixados pela retirada da água por misturas de parafina e de polímeros plásticos fundidos a temperaturas em torno de 58° C e 60° C, chamados de Paraplast®. Esse processo é conhecido como impregnação. Sabendo da propriedade do álcool de não ser miscível com a parafina, utiliza-se o xilol como ponte entre álcool e parafina. O xilol também tem a propriedade de clarificar o tecido, fenômeno chamado de diafanização. O tempo de duração desse processamento histológico é proporcional ao tamanho do fragmento que se está processando. Figura 2 - Cassetes. a - Cassete com fragmento de biópsia (pequeno e embrulhado). b - Cassete com fragmento tecidual de peça cirúrgica (grande e não embrulhado). Solução de Susa a b 3.indd 18 11/08/12 20:30
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    19 2 Técnicas Histológicas •• • • • • • • • • • • • • • • • • Material a ser processado Solução Tempo Peça cirúrgica Biópsias Pequenas Álcool 80° Álcool 95° 1º Álcool 100° 2º Álcool 100° 3º Álcool 100° 4º Álcool 100° 1º Xilol 2º Xilol 1ª Parafina 2ª Parafina 3ª Parafina Álcool 80° Álcool 95° 1º Álcool 100° 2º Álcool 100° 3º Álcool 100° 4º Álcool 100° 1º Xilol 2º Xilol 1ª Parafina 2ª Parafina 3ª Parafina 1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 2h 2h 2h 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 1h 1h 1h Caso não se disponha de processador automático de tecidos, o mesmo pode ser substituído por frascos de vidro, onde o processamento ocorrerá manualmente. 3.indd 19 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 20 2.3 Inclusão Nesta etapa, a amostra de tecido, que posteriormente será submetida ao processo de corte, necessita de um suporte que permita efetuar o processo. Chama-se inclusão o ato de emblocar esse fragmento em um meio que deve ser obrigatoriamente o mesmo em que foi embebido, ou seja, a mistura de parafina conhecida por Paraplast®. Já pensando na etapa seguinte, de corte, os fragmentos a serem emblocados devem obedecer a alguns critérios técnicos no seu posicionamento e na sua ordenação durante o processo de inclusão, o que facilitará a obtenção de um corte de qualidade. a b Figura 3 - Processadores. a - Modelo atual, com capacidade para 200 cassetes. b - Modelo antigo, com capacidade para aproximadamente 50 cassetes. Figura 4 - Central de inclusão ou autoinclusor. 3.indd 20 11/08/12 20:30
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    21 Após a inclusão,deve-se conferir o número de identificação e a quantidade de fragmentos de cada bloco, de acordo com o mapa estabelecido pelo serviço. Em seguida, os blocos são colocados em forma com gelo e enviados ao congelador por alguns minutos para endurecer. O bloco a ser cortado necessita estar gelado, e, de preferência, o ambiente do laboratório deve ser refrigerado, para permitir cortes de qualidade. e f d c a b Figura 5 - Fragmentos de tecido emblocados em parafina. a; b; c; d - Fotos de blocos de parafina contendo fragmentos de pele incluídos de forma correta. A epiderme (setas) orienta a in- clusão de forma paralela. e - Fragmento de tecido contendo lesão de aspecto cístico (seta) a ser examinada. f - Fragmento de tecido prostático com bordas (margens de se- gurança) pintadas em nanquim verde (seta). 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 21 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 22 2.4 Microtomia (corte) Para procedimento de corte necessita-se de micrótomo, navalha, banho-maria histológico, pinça, pincel, lápis e lâminas. Ao preparar a mesa de trabalho, deve-se observar se todos os botões do micrótomo estão bem apertados e se o suporte de navalhas está na angulação 10. O bloco retirado do gelo é fixado ao micrótomo e deve ser aparado até que todo o fragmento seja exposto e, a partir daí, submetido ao corte. • Os cortes de rotina costumam variar entre 4 e 6 µ (micras). • Biópsias de linfonodo 3 µ (micras). • Biópsias de Medula óssea 2 μ (micras). • Cortes para reação de imuno-histoquímica 3 µ (micras). • Biópsias renais 2 µ (micras). • Por melhor que esteja a navalha, o corte sempre necessita ser mais bem esticado, e, algumas vezes, pregas se formam sobre o tecido. Utiliza-se neste momento o banho-maria histológico, que permite a obtenção de corte de qualidade que será pescado em lâmina de vidro. • A água do banho-maria deve estar em temperatura abaixo do ponto de fusão do meio de inclusão (mais ou menos 50° C). • Os cortes histológicos agora na lâmina devem ser colocados em estufa com temperatura superior ao ponto de fusão do meio de inclusão (máximo de 65° C), o que permite que a parafina que cir- cunda o corte escorra e o mesmo se fixe à lâmina de vidro. Os blocos agora cortados são enviados ao arquivo e, sempre que necessário, podem ser requisita- dos, gelados e cortados novamente para realização de outros procedimentos, como colorações especiais, imuno-histoquímica e biologia molecular. b c a Figura 6 - Mesa de microtomia. a - Micrótomo: corte. b - Banho-maria: estender. c. Banho-maria: pesca. 3.indd 22 11/08/12 20:30
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    23 2.5 Coloração deRotina (HE) As lâminas acondicionadas em rede são retiradas da estufa e colocadas no primeiro frasco de xilol (seta preta) da bateria de coloração, onde o meio de inclusão que ainda resta na lâmina é retirado. Seguem- se mais 3 cubas com xilol (xilol 2, 3, 4), 2 cubas com álcool absoluto 100º (que retiram o xilol), álcool 95°, álcool 80° e, finalmente, água corrente. • Numa pia, cora-se hematoxilina (núcleos) por três minutos. Lava-se em água corrente. • Diferencia-se rapidamente com álcool-ácido 1%. Lava-se em água corrente. • Azula-se com água amoniacal por 30 segundos. Lava-se em água corrente. • Retorna-se à bateria de coloração (álcool 95°, duas cubas, seta vermelha). • Mergulha-se em eosina (citoplasma) por um minuto. • Inicia-se a desidratação através de duas cubas de álcool 95°, cinco cubas de álcool 100° (absoluto, seta verde) e três cubas de xilol; nessa fase, as lâminas estão prontas para serem montadas. 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • Hematoxilina Sulfato de alumínio e potássio Álcool 95 Óxido vermelho de mercúrio • Dissolver às vésperas do preparo a hematoxilina no álcool e o sulfato de alumínio e potássio na água, que deve ser aquecido em torno de 80° C. • No dia do preparo, levar a solução de sulfato de alumínio e potássio ao fogo e retirar após a fervura. •Acrescentardemaneiracuidadosaelenta,comconstanteagitação,asoluçãodehematoxilina em álcool e voltar à fonte de calor. • Ferver por várias vezes, retirando e voltando ao fogo, por mais ou menos dez minutos. • Acrescentar lenta e cuidadosamente o óxido vermelho de mercúrio, agitar e retornar à fonte de calor. • Ferver por mais ou menos dez minutos, colocando e retirando da fonte de calor várias vezes. • Resfriar imediatamente em água corrente, acondicionar em frasco escuro e filtrar quando usar. 5 g 100 g 50 ml 2,5 g Figura 7 - Esquema de bateria de coloração de rotina. Hematoxilina de Harris 3.indd 23 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 24 2.6 Montagem Os cortes histológicos, agora corados, necessitam ser recobertos por preservação e melhor refração no momento da microscopia. Para isso se utiliza um meio de montagem (Entellan®, Erv Mounth®, verniz etc.) que possibilite a fixação da lamínula de vidro sobre o corte histológico. Figura 8 - Procedimento de montagem de lâmina. a - Lâmina retirada da cuba de xilol. b - Lâmina sendo montada. c - Utilização da lamínula. d - Meio de montagem. Solução-mãe Solução aquosa de eosina a 1% Solução aquosa de floxina a 1% Solução uso (misturar em proveta ou cálice): Álcool comercial (95%) Solução de eosina aquosa a 1% Solução de floxina aquosa a 1% Ácido acético glacial PA puro a b c d 400 ml 50 ml 5 ml 2 ml Solução de Eosinafloxina 3.indd 24 11/08/12 20:30
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    25 Figura 9 -Lâminas prontas para leitura e diagnóstico. Os blocos dos quais foram confeccionados os cortes histológicos são acondicionados em gavetas de arquivo de madeira e, posteriormente, colocados em caixas de papelão apropriadas, quando são enviados ao arquivo definitivo do serviço. Durante a leitura da lâmina o profissional médico pode necessitar de outras colorações, chamadas de especiais, para ajudar no diagnóstico. Neste caso, os blocos escolhidos são retirados do arquivo nova- mente gelados e submetidos à microtomia – estufa – xilol – álcool 100° – álcool 95° – 80° e água. Então procedem-se as colorações solicitadas conforme o capítulo a seguir. Figura 10 - Arquivo. a - Arquivo de bloco tipo armário com gavetas, provisório, localizado no labo- ratório. b - Caixa arquivo de papelão, definitiva, armazenado no arquivo geral do ser- viço. b a 2 Técnicas Histológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 25 11/08/12 20:30
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    27 3 Colorações histológicaspara grânulos, depósitos e pigmentos 3.indd 27 11/08/12 20:30
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    29 Colorações especiais Asolicitação de coloração especial, ou específica, é um procedimento feito pelo patologista ou pesquisador sempre que a lâmina corada por Hematoxilina & Eosina (HE) não for suficiente para diagnóstico ou mostrar estruturas que necessitam ser melhor esclarecidas. Elas se prestam para corar pigmentos, bactérias, fungos, substâncias amorfas, estruturas teciduais e para classificar as fibras que compõem o tecido examinado. Neste capítulo, cada coloração especial, ou específica, será tratada obedecendo a seguinte ordem: seu nome, a técnica de coloração seguida do preparo das drogas e corantes utilizados, seu resultado esperado e foto ilustrativa do procedimento. Com o intuito de ser mais didático, o capítulo está dividido em grupos específicos. 3.1 Substância amiloide Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Colocar as lâminas de 40 minutos a uma hora em tubete com solução de vermelho-congo. • Lavar em água corrente. • Diferenciar as lâminas rapidamente em solução de álcool a 50% e hidróxido de sódio a 1%. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Corar pela Hematoxilina de Van Gienson (Weigert) por 15 a 30 segundos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Desidratar e montar as lâminas. Resultados Substância amiloide: corada em tom alaranjado. Núcleo: corado em tom azul. Preparo de soluções Solução de vermelho-congo Solução de vermelho-congo Água destilada 1 g 100 ml Hidróxido de sódio 1 % Hidróxido de sódio 1% Água destilada 1 g / 0,5g 100 ml / 50ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de álcool + hidróxido de sódio 1 % Hidróxido de sódio 1% Álcool 50% 1 g / 0,5g 100 ml / 50 ml Esta solução deve ser preparada na hora do uso. Vermelho-congo 3.indd 29 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 30 Hematoxilina férrica de Weigert - Solução A* Hematoxilina Álcool 95 º 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Solução de cloreto de Ferro 29 % - Solução B* Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17 % Ácido clorídrico PA 99 ml 1 ml *Na hora do uso, misturam-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu- ção sobre a lâmina. Figura 11 - Material amiloide de aspecto alaranjado presente em vasos sanguíneos. a - Vermelho-congo, 100x. b - Vermelho-congo, 200x. b a Solução de cloreto de Ferro 1,17% Cloreto de ferro III ou férrico Água destilada 1,17 g 100 ml Desprezar 1,0 ml desta solução. 3.indd 30 11/08/12 20:30
  • 31.
    31 3.2 Glicogênio Procedimento • Colocarácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos. • Lavar em água destilada. • Deixar escorrer bem a água. • Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos. • Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada. • Lavar em água corrente. • Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem – Entelan. Resultados Núcleos: azul-arroxeado. Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro. Glicogênio,mucina,fibrinaoutrombo,gotasdecoloide,depósitoshialinos,membranasbasaisetc. Reação Positiva: vermelho-púrpura. Preparo de soluções Ácido periódico 0,5 % Ácido periódico Água destilada 0,5 g / 2,5 g 100 ml / 500 ml Metabissulfito de sódio 10% Metabissulfito de sódio Água destilada 10 g / 5 g 100 ml / 50 ml Ácido clorídrico 1 N Ácido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 % Água destilada 41,25 ml 458,75 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Água sulfurosa Metabissulfito de sódio 10% Ácido clorídrico 1 N Água destilada 10 ml / 5 ml 10 ml 180 ml / 90 ml Este reativo deve ser preparado na hora do uso. PAS sem digestão 3.indd 31 11/08/12 20:30
  • 32.
    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 32 Procedimento •Salivar(cuspir)bemsobrealâminaedeixaremcâmaraúmidapor20minutos.Lavaraslâminas em água corrente para retirar a saliva. • Colocar ácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos. • Deixar escorrer bem a água. • Lavar em água destilada. • Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos. • Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada. • Lavar em água corrente. • Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Núcleos: azul-arroxeado. Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro. Mucina, fibrina ou trombo, gotas de coloide, depósitos hialinos, membranas basais etc. Reação Positiva: vermelho-púrpura. Obs.: Nesse PAS o glicogênio é digerido, portanto não cora na cor púrpura. Preparo de soluções Ácido periódico 0,5 % Ácido periódico Água destilada 0,5 g / 2,5 g 100 ml / 500 ml a b Figura 12 - Reação PAS positiva de cor fúcsia em mucosa intestinal. a - PAS, 100x. b - PAS, 200x. PAS com digestão 3.indd 32 11/08/12 20:30
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    33 Água sulfurosa Metabissulfito desódio 10% Ácido clorídrico 1 N Água destilada 10 ml / 5 ml 10 ml 180 ml / 90 ml Ácido clorídrico 1 N Ácido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 % Água destilada 41,25 ml 458,75 ml Metabissulfito de sódio 10% Metabissulfito de sódio Água destilada 10 g / 5 g 100 ml / 50 ml 3.3 Lipídeos Preparo de soluções Água sulfurosa Sudan III ou IV Álcool 70º Acetona 1 g 50 ml 50 ml Filtrar esta solução antes do uso. A solução não se conserva por muito tempo. Pode-se usar Scarlet C no lugar de Sudan IV. 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Mergulhar rapidamente as lâminas em tubete com álcool 70%. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Sudan III ou IV, previamente filtrada, por dois a cinco minutos. Voltar o reativo para o frasco após o uso. • Lavar as lâminas rapidamente em álcool 70%. • Lavar em água corrente. • Corar os núcleos com Hematoxilina de Harris por um a dois minutos. • Lavar cuidadosamente em água corrente. • Montar as lâminas com solução de gelatina de glicerina, previamente aquecida em micro -ondas. Não deixar formar bolhas. Resultados Lípideos Neutros: corados em tom vermelho-vivo. Ésteres de colesterol: corados em tom alaranjado. Sudan Este reativo deve ser preparado na hora do uso. 3.indd 33 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 34 3.4 Muco Procedimento •CoraraslâminasemhematoxilinadeHarrisportrêsacincominutos,dependendodaqualidade do corante. Diferenciar em álcool-ácido. •Enquantoaslâminasestãonahematoxilina,filtrarasoluçãodemucicarmimqueseráutilizada. • Lavar as lâminas em água corrente. • Azular na solução de amônia por 40 segundos. • Lavar as lâminas em água corrente. • Corar em solução de mucicarmim diluída com a mesma quantidade de água destilada, por 30 minutos. • Lavar as lâminas em água corrente rapidamente. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Muco: vermelho (carmim). Núcleos: negros. Cápsulas de criptococos: vermelho (carmim). Outros elementos do tecido: amarelos. Meio de montagem - geleia de glicerina Gelatina Água destilada Glicerina Fenol (cristais) 5 g / 10 g / 2,5 g 30 ml / 60 ml / 15 ml 35 ml / 70 ml / 17,5 ml 0,125 g / 0,25 g / 0,0625 g a b Figura 13 - Marcação alaranjada em glândula sebácea. a - Sudan, 40x. b - Sudan, 400x. Mucicarmim Dissolver a gelatina na água em um béquer em banho-maria (água esquentada no micro -ondas), adicionar a glicerina e o fenol. Conservar o meio de montagem em frasco vedado na geladeira. Quando for necessário usar, aquecê-lo no micro-ondas. 3.indd 34 11/08/12 20:30
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    35 Preparo de soluções Amarelode metanilo - estoque Amarelo de metanilo Água destilada 0,25 g 100 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Figura 14 - Mucosa intestinal mostrando criptas com positividade carmim para mucinas. a - Mucicarmim, 100x. b - Mucicarmim, 200x. b a Solução matriz de mucicarmim Carmim Cloreto de alumínio Água destilada 1 g 1 g 100 ml Colocar os três reagentes em um balão volumétrico de 500 ml e agitar bem. Acrescentar pequenas quantidades (cerca de 0,5 g) de cloreto de alumínio aos poucos, agitando bem. Levar o balão para o micro-ondas e colocar em potência média/máxima. Assim que come- çar a levantar fervura, desligar o micro-ondas. Repetir o processo por três vezes. Retirar do micro-ondas, deixar esfriar e guardar na geladeira. Amarelo de metanilo uso Amarelo de metanilo estoque Água destilada 10 ml 40 ml Na hora do uso, retirar o volume que será utilizado sobre as lâminas e pingar de uma a duas gotas de ácido acético glacial para acidificar a solução. 3.indd 35 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 36 Preparo de soluções Solução de nitrato de prata 10% Solução de cloreto de ouro uso Nitrato de prata Solução-matriz de cloreto de ouro 1% Água destilada Água destilada 10 g / 5 g / 2,5 g 10 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml 40 ml 3.5 Células cromafins Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água. • Preparar a prata de Fontana-Masson. • Colocar as lâminas em tubete com a solução de prata de Fontana e levar à estufa a 37º C por uma hora, até que os cortes apresentem uma coloração marrom-clara. Após 45 minutos de estufa, verificar constantemente a cor das lâminas, já que a temperatura da estufa pode variar. Se após esse tempo as lâminas ainda estiverem claras, retirar da estufa e deixar esfriar por cinco minutos à temperatura ambiente. • Enxaguar em água destilada três vezes. • Matizar em solução de cloreto de ouro por dez minutos. • Enxaguar em água destilada. • Colocar em tubete com solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos. • Enxaguar em água destilada. • Corar fundo com solução de vermelho-neutro nuclear sobre as lâminas por cinco minutos. • Enxaguar bem com água destilada. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Grânulos argentafins: corados em negro. Melanina: corada em negro. Núcleos e citoplasma: corados em rosa-claro. Solução de nitrato de frata de Fontana Procedimento • Separar pequeno volume da prata 10% preparada de 3 a 5 ml. • Pingar hidróxido de amônia concentrado gota a gota na solução de maior volume. Logo nas primeiras gotas a solução irá turvar, ficar pardacenta. • Adicionar amônia gota a gota até clarear esta solução novamente. Quando clarear, pingar gota a gota o restante do nitrato de prata, até que a solução turve novamente. Esta solução turva é que será utilizada na coloração. Filtrar antes de usar. Fontana Masson 3.indd 36 11/08/12 20:30
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    37 Solução de tiossulfatode sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g 100 ml Solução de vermelho-neutro nuclear Vermelho-neutro nuclear Água destilada 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Figura 15 - Melanócitos da epiderme mostrando positividade granular e escurecida. a - Fontana Massom, 100x. b - Fontana Massom, 200x. a b 3.6 Pigmento biliar Preparo de soluções Solução reagente de Fouchet Solução aquosa de cloreto de ferro 10% Solução aquosa de ácido tricloroacético 25% 1 ml / 5 ml / 10 ml 10 ml / 50 ml /100 ml Solução de picro fucsina de Van Gienson – solução-mãe Solução aquosa fucsina ácida 1% Solução aquosa de ácido pícrico 2,5 ml 97,5 ml 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Lavar em água destilada. • Corar pelo reagente de Fouchet por cinco minutos. • Lavar em água corrente por dois a três minutos. • Corar pela solução de Van Gienson durante cinco minutos. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Pigmento biliar: corado em verde-oliva. Colágeno: corado em vermelho. Outras estruturas: coradas em amarelo. Fouchet 3.indd 37 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 38 Solução de picro fucsina de Van Gienson - solução uso Solução-mãe Água destilada 10 ml 40 ml Solução de vermelho-neutro nuclear 1% Vermelho-neutro nuclear Água destilada 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml Solução de nitrato de prata 1% Nitrato de prata Água destilada 1,0 g / 0,5 g / 0,25 g 100 ml / 50 ml / 25 ml 3.7 Cálcio Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas. • Colocar as lâminas em tubete com solução de prata a 1% por uma hora exposto ao sol ou bem próximo a uma lâmpada. • Lavar em água destilada. • Corar os núcleos com vermelho-neutro nuclear ou safranina o pingado sobre a lâmina por 30 segundos. • Lavar em água corrente. • Desidratar, diafanizar e montar as lâminas. Resultados Cálcio: corado em negro-opaco. Preparo de soluções Van Kossa Figura 16 - Calcificações de tonalidade escura em túbulos renais (Van Kossa, 400x). 3.indd 38 11/08/12 20:30
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    39 3.8 Ferro Procedimento • Dependendoda quantidade de lâminas a ser corada, preparar uma solução com partes iguais de ferrocianeto de potássio e ácido clorídrico. • Deixar as lâminas em tubete com esta solução por 30 minutos. • Lavar as lâminas rapidamente em água destilada. • Contracorar com solução de eosina 1% (preparar na hora diluição 1:9) por 30 segundos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Retirar as lâminas do tubete. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Pigmentos de ferro: azul. Núcleos: vermelhos. Citoplasma: róseo. Solução de ferrocianeto de potássio a 10% Solução de nitrato de prata 1% Eosina 1% Ferrocianeto de potássio Ácido clorídrico PA Eosina Água destilada Água destilada Água destilada 10 g / 5 g 20 ml / 10 ml / 5 ml 1,0 ml / 0,5 ml / 0,25 ml 100 ml / 50 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml Preparo de soluções Figura 17 - Depósitos hepáticos de hemossiderina. Positividade azulada e granular em depó- sitos hepáticos de hemossiderina. a - Perl’s, 200x. b - Perls, 400x. a b 3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Perl´s 3.indd 39 11/08/12 20:30
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    41 4 Coloração paratecido conjuntivo 3.indd 41 11/08/12 20:30
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    43 4.1 Fibras colágenas Procedimento •Desparafinar e hidratar as duas lâminas que serão utilizadas na coloração em água corrente. • Colocar a hematoxilina de Weigert (soluções A e B) sobre as lâminas por dez minutos. • Lavar as lâminas em água corrente por dez minutos. • Colocar a solução de Van Gienson - Picrofucsina sobre as lâminas por cinco minutos. • Passar direto para o álcool 95º. • Retirar as lâminas do tubete. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras colágenas - vermelhas Núcleos - negros Citoplasma - amarelo. Hematoxilina férrica de Weigert - solução A Solução estoque de picrofucsina de Van Gienson Solução de cloreto de ferro 1,17% Solução uso de picrofucsina de Van Gienson Solução de cloreto de ferro 29% - solução B Hematoxilina Solução aquosa de fucsina ácida 1% Cloreto de ferro III ou férrico Solução estoque de picrofucsina Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17% Álcool 95º Solução aquosa de ácido pícrico Água destilada Água destilada Ácido clorídrico PA 1 g / 0,5 g 2,5 ml 1,17 g 10 ml 99 ml 100 ml / 50 ml 97,5 ml 100 ml 40 ml 1 ml Preparo de soluções 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Van Gienson Desprezar 1 ml desta solução. Na hora do uso, mistura-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu- ção sobre a lâmina. 3.indd 43 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 44 4.2 Fibras elásticas Procedimento • Colocar hematoxilina de Verhoeff sobre as lâminas por 15 minutos, até que fiquem negras. • Diferenciar na solução aquosa de cloreto de ferro (férrico) a 2%. Coloca-se o cloreto de ferro em um tubete e a água em outro tubete. Mergulha-se a lâmina no cloreto e depois na água. •Controla-seadiferenciaçãopelomicroscópioatéqueotecidoconjuntivotomeacordasolução de lugol. • Durante a diferenciação, deve-se agitar a lâmina dentro do tubete. Se a diferenciação for excessiva, recorar pela hematoxilina de Verhoeff. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Corar pela solução de Van Gienson (picrofucsina uso) por cinco minutos. • Passar as lâminas pelo álcool 95º. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras elásticas: negras. Núcleos: azuis ou negros. Colágeno: vermelho. Outros elementos do tecido: amarelos. Hematoxilina de Verhoeff - solução A Hematoxilina de Verhoeff - solução B Hematoxilina de Verhoeff - solução C Hematoxilina (cristais) Cloreto de ferro (férrico) Iodo metálico Álcool absoluto Água destilada Iodeto de potássio Água destilada 2,5 g / 0,5 g / 5 g 10 g / 5 g 2 g / 1 g 50 ml / 10 ml / 100 ml 100 ml / 50 ml 4 g / 2 g 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Na hora de usar, misturar as soluções na seguinte ordem e quantidade: Solução uso Solução A Solução B Solução C 2,5 ml / 1,25 ml 1 ml / 0,5 ml 1 ml / 0,5 ml Misturar em quantidade adequada à necessidade da rotina. Colocar esta solução sobre as lâminas. Preparar a solução na hora do uso. Verchoeff 3.indd 44 11/08/12 20:30
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    45 Ou Solução de VanGienson (picrofucsina) - solução-mãe (Stock) Solução de Van Gienson (picrofucsina) - solução uso Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2% Solução aquosa de fucsina ácida 1% Solução-mãe Cloreto de ferro (férrico) Solução aquosa de ácido pícrico Água destilada Água destilada 2,5 ml 10 ml 2 g / 1 g 97,5 ml 40 ml 100 ml / 50 ml Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2% Solução aquosa de cloreto de ferro 10% Água destilada 20 ml 80 ml 4.3 Fibras reticulares 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Enquanto as lâminas estão no xilol, filtra-se o permanganato de potássio em cone de papel. • Oxidar pingando permanganato de potássio 0,5% já filtrado sobre as lâminas por um minuto. • Lavar rapidamente as lâminas em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Diferenciar pingando solução de ácido oxálico 3% sobre a lâmina por um minuto. • Lavar em água corrente, rapidamente, dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Sensibilizar pingando a solução de sulfato férrico amoniacal a 2% (ou alúmen de ferro 2%) sobre a lâmina por um minuto. • Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Reduzir na solução de formol 10%, colocando as lâminas em tubete, por três minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Matizar em cloreto de ouro 0,2%, em tubete, por cinco minutos. • Colocar de volta o reativo no frasco. • Lavar as lâminas em água corrente rapidamente. • Fixar a prata com tiossulfato de sódio 2%, em tubete, por um minuto. • Lavar rapidamente em água corrente. • Contracorar na solução de verde-luz por um a três minutos, dependendo da validade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fibras reticulares: negras. Coloração de fundo: esverdeada. Retículo 3.indd 45 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 46 Solução de permanganato de potássio 0,5% Permanganato de potássio Água destilada 0,5 g / 0,25 g 100 ml / 50 ml Solução de ácido oxálico 3% Ácido oxálico Água destilada 15 g / 9 g / 3 g 500 ml / 300 ml / 100 ml Solução de hidróxido de potássio a 10% Hidróxido de potássio Água destilada 10 g / 5 g / 2,5 g 100 ml / 50 ml / 25 ml A solução de prata amoniacal deve ser preparada na hora do uso. Os reagentes utilizados em seu preparo já ficam prontos, com exceção do nitrato de prata a 10%, que deve ser pre- parado na hora. Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2% Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferro Água destilada 8 g / 2 g / 1 g 400 ml / 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Solução de nitrato de prata a 10% Nitrato de prata Água destilada 0,5 g / 0,25 g 5 ml / 2,5 ml Pesar a quantidade de droga necessária de acordo com a quantidade de lâminas a serem coradas. Geralmente, em nossa rotina, usamos a receita inteira, ou seja, 5,0 ml. Solução de formol a 10% Formol PA Água destilada 10 ml / 5 ml 100 ml / 50 ml Esta solução deve ser preparada na hora do uso. Solução de prata amoniacal Solução aquosa de nitrato de prata 10% Solução aquosa de hidróxido de potássio Hidróxido de amônia concentrado 5 g / 2,5 g 50 ml / 25 ml 1,5 ml (20 a 24 gotas) / 0,75 ml (10 a 12 gotas) Pipetar o hidróxido de potássio no béquer do nitrato de prata e misturar levemente. Colocar a amônia gota a gota até que o precipitado formado desapareça e a solução fique bem clara, transparente como água. Em seguida, filtrar e dobrar o volume da solução com água destilada. Este reativo deve ser desprezado após o uso. 3.indd 46 11/08/12 20:30
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    47 Solução-mãe de cloretode ouro a 1 % Ampola de 1 g de cloreto de ouro Água destilada uma ampola 100 ml Figura 18 - Trama reticular enegrecida em fígado cirrótico (Retículo, 200x). 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml Em geral, preparamos quatro receitas, o que nos dá um volume final de 400 ml. Solução de cloreto de ouro 0,2% Solução de cloreto de ouro 1% Água destilada 10 ml 40 ml Preparar sempre entre duas receitas, o que dá 100 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses, ou até que fique em tom de amarelo muito claro. 3.indd 47 11/08/12 20:30
  • 48.
    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 48 Dissolverahematoxilinanocalor.Depoisdefria,acrescentaroácidofosfotúngstico.Oama- durecimento é longo, de três a quatro semanas. Para amadurecimento rápido, acrescentar 0,02 g de permanganato de potássio. 4.4 Fibrina Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Zenker por 90 minutos na estufa 56º C. • Retirar as lâminas da estufa e deixar na mesma solução de Zenker, agora em temperatura ambiente por 15 minutos. • Colocar solução de Lugol sobre as lâminas por 15 minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas em solução de tiossulfato de sódio 2% por três minutos. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas em tubete com hematoxilina fosfotúngstica de Mallory por 90 minutos na estufa 56º C. •Retiraraslâminasdaestufaedeixarnamesmahematoxilina,agoraemtemperaturaambiente, por 15 minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Desidratar e montar as lâminas. Resultados Conectivo: vermelho/amarelo. Estrias musculares: azuis. Fibroglia e microglia: azuis-escuros. Solução de hematoxilina fosfotúngstica Iodine Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2% Hematoxilina Iodine (iodo metálico) Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferro Ácido fosfotúngstico Iodeto de potássio Água destilada Água destilada Água destilada 0,1 g 1 g 8 g / 2 g / 1 g 2 g 2 g 100 ml 300 ml 400 ml / 100 ml / 50 ml Preparo de soluções Hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory (PTAH) 3.indd 48 11/08/12 20:30
  • 49.
    49 Solução de Zenker Soluçãode tiossulfato de dódio 2% Dicromato de potássio Tiossulfato de sódio Cloreto de mercúrio Água destilada Sulfato de sódio Água destilada Ácido acético glacial 2,5 g / 1,25 g 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 5 g / 2,5 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml 1 g / 0,5 g 100 ml / 50 ml 5 ml / 2,5 ml 4 Coloração Para Tecido Conjuntivo • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 4.5 Colágeno Procedimento • Desparafinar, hidratar. • Corar pela mematoxilina de Groat por dez minutos. • Lavar em água corrente por cinco minutos. • Lavar em água acética a 1% por 30 segundos. • Corar em Rouge Mallory por dez minutos. • Lavar para retirar o excesso do corante com água acética a 1%. • Imergir as lâminas em solução de ácido fosfomolibdico a 10% por 10 minutos. • Lavar para retirar o excesso do ácido com água acética a 1%. • Corar com Vert-Lumiere ou Azul de Anilina por dez minutos. • Lavar em água acética a 1% para retirar o excesso do corante. • Desidratar, diafanizar e montar. Resultados Núcleos: marrons. Citoplasma, queratina e fibras musculares: vermelhos. Fundo: verde-claro. Colágeno: azul ou verde. Preparo de Soluções Tricrômico de Masson (tempo rápido) Água acética 1% Ácido acético Água destilada 5 ml 50 ml 3.indd 49 11/08/12 20:30
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    Rouge Mallory Fucsina ácida OrangeG Ácido acético Água destilada 1 g 0,4 g 3 ml 300 ml Ácido fosfomolibdico 10% Ácido fosfomolibdico Água destilada 10 g 100 ml Vert-Lumiere – light-green Light-green Água destilada Ácido acético 1 g 100 ml 1 ml Azul de anilina 1% Azul de Anilina Água destilada Ácido acético 1 g 100 ml 1 ml 50 Hematoxilina de Groat - Solução A Álcool 95° Hematoxilina 50 ml 0,5 g Hematoxilina de Groat - Solução B Água destilada Ácido sulfúrico concentrado 50 ml 0,8 ml Sulfato férrico amoniacal 1 g Misturar Solução A + Solução B em partes iguais e dobrar o volume com água destilada. Figura 19 – Feixes de tecido conjuntivo de tonalidade azulada ao redor de fibras musculares (50x). 3.indd 50 11/08/12 20:30
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    51 5 Coloração paraagentes etiológicos 3.indd 51 11/08/12 20:30
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  • 53.
    53 Iodine de Gram Iodine(iodo metálico) Iodeto de potássio Água destilada 1 g / 0,5 g 2 g / 1 g 300 ml / 150 ml Preparo de soluções 5.1 Bactérias Procedimento • Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Pingar solução de cristal violeta filtrado sobre a lâmina e deixar por dois minutos. • Lavar em água corrente para retirar o excesso do corante. • Cobrir a lâmina com solução de Lugol por cinco minutos. • Lavar em água corrente. • Escorrer o excesso de água e colocar em acetona pura, diferenciando a lâmina com aproximadamente três a quatro mergulhos (verificar a olho nu a diferenciação). • Lavar em água corrente. • Lavar em água corrente para remover o excesso de ccetona. • Colocar solução de carbolfucsina sobre a lâmina de 1 minuto a 1 minuto e 30 segundos. • Lavar em água corrente. • Colocar em tubete com solução de Gallego por cinco minutos. •Lavaremáguacorrente,deixandoescorreroexcesso,epassarimediatamenteparatubetecom acetona pura, aproximadamente por três mergulhos. •Passaraslâminasemtubetecomácidopícricoeacetonaaproximadamenteportrêsmergulhos. • Passar as lâminas em tubete com acetona aproximadamente por três mergulhos. • Passar as lâminas por três mergulhos no xilol. • Montar a lâmina. Resultados Bactérias gram-positivas: roxas. Bactérias gram-negativas: rosas. 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Gram Solução de hematoxilina fosfotúngstica Hematoxilina Ácido fosfotúngstico Água destilada 0,1 g 2 g 100 ml Filtrar antes de usar. 3.indd 53 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 54 Carbol fucsina Solução de Gallego Ácido pícrico acetona Fucsina básica Formol concentrado Ácido pícrico Fenol (ácido fênico) Ácido acético glacial Acetona Álcool absoluto Água destilada Água destilada 1 g / 0,5 g / 0,25 g 1 g / 0,5 g 1 g / 0,5 g 5 g / 2,5 g / 1,25 g 0,5 ml / 0,25 ml 100 ml / 50 ml 10 ml / 5 ml / 2,5 ml 50 ml / 25 ml 100 ml / 50 ml / 25 ml Figura 20- Agrupamento de bactérias com positividade azulada (Gram, 400x). 3.indd 54 11/08/12 20:30
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    55 5.2 Tuberculose Procedimento • Colocaras lâminas em suporte próprio (bandeja) para colocar os reativos utilizados sobre a lâmina. •ColocarasoluçãodeZiehl-Neelsenfiltradasobreaslâminasedeixarde40minutosaumahora aproximadamente. • Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante. • Colocar álcool-ácido em um tubete. • Diferenciar as lâminas, uma a uma, mergulhando-as em álcool ácido e lavando em cuba com água corrente até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais. • Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em uma cuba com água corrente (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos. • Mergulharaslâminas,umaauma,notubetecomsoluçãousodeazuldemetileno,rapidamente, cerca de dois ou três mergulhos intercalados com lavagens em cuba com água corrente. • Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem. • Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos brilhantes. Outros elementos do tecido: azuis-claros. Fucsina fenol de Ziehl Fenol Álcool absoluto Fucsina básica Água destilada 20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g 40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml 4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g 400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml Preparo de soluções Álcool-ácido 1% Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe) Álcool 70% Azul de metileno Ácido clorídrico Álcool comercial (95º) 500 ml 1,4 g 5 ml 100 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Ziehl-Neelsen 3.indd 55 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 56 5.3 Lepra Solução uso de azul de metileno Azul de metileno estoque Água destilada 10 ml 90 ml Figura 21 - Bacilos avermelhados, intracelulares, presentes em tecido pulmonar. a - Ziehl-Neelsen, 200x. b - Ziehl-Neelsen, 400x. Procedimento • Nesta coloração, as lâminas não são desparafinizadas no xilol, e sim na terebentina. O tempo de exposição é o mesmo utilizado para o xilol. • Lavar as lâminas em água corrente para retirada do excesso de terebentina. Secar as lâminas em papel de filtro. •ColocarasoluçãodeZiehl-Neelsenfiltradasobreaslâminasedeixarde40minutosaumahora aproximadamente. • Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante. • Colocar álcool-ácido em um tubete. • Diferenciar as lâminas, uma u uma, mergulhando-as em álcool-ácido e lavando em cuba com água corrente, até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais. • Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em água corrente em uma cuba (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos. • Mergulharaslâminas,umaauma,notubetecomsoluçãousodeazuldemetileno,rapidamente, cercadedoisoutrêsmergulhosintercalados,dependendodavalidadedocorante,comlavagens em cuba com água corrente. • Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem. • Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos. Filamentos de nocárdia: vermelhos. Bacilos de lepra: vermelhos. Fundo: azul-pálido. Fite-faraco a b 3.indd 56 11/08/12 20:30
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    57 Preparo de soluções Álcool-ácido1% Álcool 70% Ácido clorídrico 500 ml 5 ml Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe) Azul de metileno Álcool comercial (95º) 1,4 g 100 ml Solução uso de Azul de metileno Azul de metileno estoque Água destilada 10 ml 90 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Fucsina fenol de Ziehl Fenol Álcool absoluto Fucsina básica Água destilada 20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g 40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml 4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g 400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml Esta solução deve ser filtrada antes do uso. Figura 22 - Aglomerados de bacilos de Hansen de tonalidade avermelhada em derme. a - Fite-Faraco, 200x. b - Fite-Faraco, 1000x. a b 3.indd 57 11/08/12 20:30
  • 58.
    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 58 5.4 Fungos Procedimento • Colocar as lâminas para oxidar em tubete ou cálice de vidro com solução aquosa de ácido crômico a 5% por 40 minutos. Caso necessário, o tempo pode ser maior. • Voltar o reativo para o frasco. • Lavar as lâminas em água corrente. • Mergulhar as lâminas na solução de bissulfito de sódio a 1% por um minuto para remover o ácido crômico. • Lavar as lâminas em água corrente duas vezes. • Lavar as lâminas em água destilada duas vezes. • Deixar água destilada em quantidade suficiente para cobrir as lâminas no tubete. • Mergulhar na solução de nitrato de prata metanamina. • Levar o tubete e o recipiente onde foi preparada a solução de prata metanamina para o micro -ondas. • Iniciaroaquecimentodaprataparaqueestaalcancecercade56ºCdetemperatura,colocando -se o micro-ondas em potência máxima por 50 segundos. • Descartaraáguadestiladadotubeteesubstituí-lapelasoluçãodenitratodepratametanamina. • Ligar o micro-ondas em potência média por dez segundos. Abrir e verificar a impregnação da prata. Ir repetindo este procedimento, intercalando com um tempo, na potência mínima, de seis segundos, para não aquecer muito a prata, até se verificar que os cortes atingiram uma cor amarelo-pardacenta, indicando que a impregnação está correta. • Retirar o tubete do micro-ondas e lavar várias vezes em água corrente. • Colocar solução de cloreto de ouro a 0,2% no tubete por cinco minutos. • Lavar em água corrente. • Remover a prata não reduzida passando pela solução de tiossulfato de sódio a 2% por cinco minutos. • Lavar em água corrente cuidadosamente. • Preparar a solução de amarelo de metanilo a 0,25% em quantidade suficiente para cobrir as lâminas na bandeja. • Acidificar o amarelo de metanilo, pingando uma gota de ácido glacial acético. • Colocar as lâminas na bandeja de coloração e pingar sobre os cortes o amarelo já acidificado. • Lavar as lâminas cuidadosamente em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem. Resultados Fungos: negros. Mucina: preto-acinzentada. Partes centrais do micélio e hifas: rosa-avermelhadas. Coloração de fundo: amarela. Prata metenamina de Gomori (GMS) 3.indd 58 11/08/12 20:30
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    59 Preparo de soluções Soluçãode ácido crômico 5% Ácido crômico Água destilada 5 g / 10 g /20 g 100 ml / 200 ml / 400 ml Bissulfito de sódio Bissulfito de Sódio Água destilada 1 g / 2 g 100 ml / 200 ml Solução de Bórax Bórax, ou ácido bórico Água destilada 5 g / 10 g 100 ml / 200 ml Solução de nitrato de prata 5% Nitrato de prata Água destilada 5 g / 10 g 100 ml / 200 ml Solução-mãe de cloreto de ouro 1% Ampola de 1 g de cloreto de ouro Água destilada uma ampola 100 ml Solução de metanamina 3% Hexamethylenotetramine ou metanamina ou urotropina Água destilada 3 g / 6 g / 9 g 100 ml / 200 ml / 300 ml Solução de cloreto de ouro 0,2% Solução de cloreto de ouro 1% Água destilada 10 ml 40 ml Preparamos sempre entre duas receitas, o que nos dá 80 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses ou até que fique em tom de amarelo muito claro. 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução de prata metanamina Solução metanamina 3% Solução de bórax 5% Nitrato de prata 5% Água destilada 25 ml / 50 ml 2 ml / 4 ml 1,25 ml / 2,5 ml 25 ml / 50 ml Preparar esta solução com os reativos sempre nesta ordem. A quantidade de reagente pre- parado depende da quantidade de lâminas que estão sendo coradas. Este reagente deve ser sempre preparado na hora do uso. 3.indd 59 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 60 Amarelo de metanilo - estoque Amarelo de metanilo Água destilada 0,25 g 100 ml Figura 23 - Positividade escurecida em parede de fungos (paracoccidioidomicose), GMS, 200x. Amarelo de metanilo uso Amarelo de metanilo stock Água destilada 10 ml 40 ml Acidificar com uma a duas gotas de ácido acético glacial na hora do uso. Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g / 4 g / 6 g / 8 g 100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml Em geral, preparamos quatro receitas, o que dá um volume final de 400 ml. 3.indd 60 11/08/12 20:30
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    61 5.5 Espiroquetas Preparo desoluções Solução A da água tamponada de pH 3,6 (fica na geladeira) Acetato de sódio Água destilada 1,64 g / 8,2 g 100 ml / 500 ml Solução B da água tamponada de pH 3,6 (preparar na hora do uso ) Ácido acético glacial Água destilada 0,59 ml / 1,18 ml / 5,9 ml 50 ml / 960 ml / 480 ml 5 Coloração Para Agentes Etiológicos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Procedimento • Nesta reação, utilizar sempre água tamponada para lavagem das lâminas e preparo das soluções. • Deve-se preparar os reativos antes do início da reação, de preferência enquanto as lâminas estão desparafinando. Todos eles devem ficar na estufa 56º C durante toda a reação, inclusive o que sobrar de água tamponada. Cada um deve ser acondicionado em um béquer diferente, e o da prata deve ter capacidade para 60 ml de solução, já que a solução reveladora será preparada nele. • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água tamponada de pH 3,6, que estará em um tubete. • Impregnaroscortesnasoluçãodenitratodeprata1%,sempredissolvidaemáguatamponada, colocando as lâminas no tubete que já está na estufa 56º C junto com a prata, por uma hora. •ApósesteperíodoiremosdescartaraSoluçãodePrata1%emumbéquervazio.Oscortesainda estarão brancos, e não de cor acastanhada, o que só ocorrerá após a revelação. • Preparar a solução reveladora juntando os reativos que estão na estufa na seguinte ordem: solução de Prata 2%, gelatina e hidroquinona. Agitar levemente. • Colocar a solução reveladora no tubete onde estão as lâminas e observar atentamente, já que o processo derevelaçãoé bemrápido. Agora sim aslâminasficarão decor amarelo-pardacenta, acastanhada. • Após a revelação, descartar a solução reveladora e lavar as lâminas com o restante da água tamponada que também estava na estufa. • Desidratar, clarificar e montar. • Depois de montadas, manter as lâminas em local escuro (dentro de uma gaveta ou entre bandejas), ao abrigo da luz. Resultados Espiroquetas: negras. Fundo: amarelo-canela. Warthin Starry Solução de água tamponada de pH 3,6 Solução A Solução B Água destilada 3 ml / 1,5 ml 37 ml / 18,5 ml 960 ml / 480 ml Para um tubete, até três lâminas, preparar 500 ml desta solução. 3.indd 61 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 62 Nitrato de prata 1 e 2% Pesar 0,68 g de nitrato de prata. Acrescentar 34 ml de água tamponada. Retirar 9 ml dessa solução e reservar. Esta será a prata 2% que será utilizada. O restante da prata que ficou no béquer (2%) terá seu volume dobrado com 25 ml de água tamponada e passará a ser a prata 1% utilizada na reação. Gelatina Gelatina Água tamponada 2,5 ml 45 ml Hidroquinona Hidroquinona Água destilada 0,3 g 3 ml Figura 24 - Corte de pulmão. Estruturas espiraladas, alongadas e negras (espiroquetas). Warthin Starry, 1000x. 3.indd 62 11/08/12 20:30
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    63 6 Coloração parasistema nervoso 3.indd 63 11/08/12 20:30
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    65 6.1 Fibras nervosas Procedimento •Desparafinar e hidratar as lâminas até a água. • Pesar 5 g de AgNO3 e diluir em 25 ml de água destilada. Esta será nossa solução de prata 20% - solução A. • Separar 13 ml desta solução, aquecer no micro-ondas na potência mínima (20%) por aproximadamente 48 segundos. Colocar o termômetro e verificar se a prata atingiu a temperatura desejada de 56º C. Esta solução tem que ser preparada na hora do uso. • Caso a temperatura esteja adequada, colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente 5 minutos. •Retirarotubetedaestufa56ºCepassarparaaestufa37ºCpordezminutos,semretiraropapel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução B. • Lavar em água destilada morna (aquecida em tubete por 15 segundos em potência máxima no micro-ondas). • Os 12 ml de AgNO3 que restaram irão receber gotas de hidróxido de amônia. Logo na primeira gota, a solução irá ficar pardacenta. A partir da segunda gota, iremos pingando amônia para clarear a solução novamente (para este volume de prata, serão aproximadamente de 50 a 60 gotas). Essa prata deverá ser aquecida da mesma forma que a anterior antes de ser utilizada. Esta será nossa solução B. • Com a temperatura adequada (56º C), colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente cinco minutos. Retirar o tubete da estufa 56º C e passar para a estufa 37º C por dez minutos, sem retirar o papel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução reveladora, que será nossa solução C. • Preparar a solução reveladora de trabalho e a solução uso adicionando-se oito gotas de amônia concentrada e oito gotas da solução C a 50 ml de água destilada. Esta solução também deve ser preparada na hora do uso. • Retirar as lâminas da estufa, lavá-las em água destilada morna e colocá-las na solução reveladora uso até que as fibras nervosas (axônios) fiquem de cor negra, quando observados sobre um fundo amarelo. O tempo esperado para esta mudança pode estar entre um e cinco minutos, dependendo da região a ser corada (geralmente o tempo é de um a dois minutos). • Checar a lâmina ao microscópio para verificar se a impregnação está correta. •Lavaralâminaemáguaamoniacalfresca(oitogotasdeamôniapara50mldeáguaDestilada). • Lavar as lâminas em água destilada por um minuto. • Desidratar, clarificar e montar. Resultados Axônios: negros. Background: amarelo-acastanhado. Placas neuríticas e tangles: negros. Placas e amiloide vascular: castanhas/castanho-escuras. 6 Coloração Para Sistema Nervoso • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Bielschowsky 3.indd 65 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 66 Preparo de soluções Solução reveladora - estoque - solução C Ácido cítrico Formaldeído PA Ácido nítrico Água destilada 0,5 g / 0,25 g / 1 g 20 ml / 10 ml / 40 ml 2 gotas / 1 gota / 4 gotas 100 ml / 50 ml / 200 ml Figura 25 - Trama fibrilar de aspecto escurecido em processos axionais do encéfalo (Bielschowsky, 400x). Solução reveladora - uso - solução C Solução C – estoque Amônia Água destilada 8 gotas 8 gotas 50 ml Esta quantidade de solução uso é suficiente para se corar de cinco a dez lâminas. 3.indd 66 11/08/12 20:30
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    69 7.1 Conceitos Básicos O termo surgiu das palavras imunologia, histologia e química. • Imunologia: estuda o sistema imunológico. • Histologia: estuda tecidos e órgãos com auxílio do microscópio. • Química: estuda os elementos da natureza e a maneira pela qual se ligam e reagem entre si. O processo de identificar antígenos nos tecidos com anticorpos através de cortes histológicos co- rados é chamado imuno-histoquímica. A coleta e os passos seguintes do material a ser estudado obedecem os mesmos passos do material colhido para diagnóstico de rotina Hematoxilina & Eosina (HE), ou seja, coleta, fixação, macroscopia, processamento histológico (desidratação, diafanização e inclusão), microtomia e pesca, sendo que, após esta fase, as lâminas com os cortes devem secar preferencialmente ao ar livre, ser escorridas em estufa, desparafinizadas e assim serem submetidas à técnica imuno-histoquímica, conforme protocolo básico abaixo. 7.2 Protocolo para reação de imuno-histoquímica 1. Cortes de 2 µm e 3 µm em lâminas silanizadas. 2. Secar bem as lâminas e escorrer a 60º C na estufa. 3. Desparafinizar em xilol. 4. RE hidratar em álcoois decrescentes 5. Lavar em água corrente e água destilada. 6. Proceder à recuperação antigênica conforme a orientação da bula. • Micro-ondas • Panela de pressão • Steamer – Panela a vapor – 96º C • Banho sorológico – 96º C a 98º C Tampões de recuperação antigênica • Citrato pH 6,0 • EDTA pH 8,0 • Tris EDTA pH 9,0 Independentemente do procedimento utilizado na recuperação antigênica, deve-se deixar esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente ou em água corrente. 7. Lavar as lâminas em tampão de lavagem (PBS ou TBS). 8. Bloquear a peroxidase endógena por meio do peróxido de hidrogênio/metanol a 0,5 /v/v durante dez minutos. 9. Lavar em lâminas em TBS por três minutos. 10. Incubar em soro bloqueador (bloqueio da proteína) durante dez minutos. 11. Incubar no anticorpo primário. 7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 69 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 70 Preparação das lâminas para imuno-histoquímica •OAPTS(silano)étóxicoecausaqueimadurasnapele,portantoomesmodeverásermanipulado com cuidado, utilizando luva. • Colocar as lâminas em berço de alumínio. • Preparar três cubas de vidro na capela de exaustão. - Cuba 1: solução de APTS a 6% em acetona. - Cuba 2: água destilada. - Cuba 3: água destilada. • Colocar a rede metálica com as lâminas na solução de APTS a 6% (cuba 1) por três minutos. Escorrer o excesso. • Colocar em água destilada (cuba 2) por três minutos. Escorrer o excesso. • Colocar em água destilada (cuba 3), imergir quatro vezes, escorrer o excesso e acondicionar as redes com as lâminas em bandeja forrada com papel filtro ou compressa cirúrgica, sendo que as lâminas devem ficar com a extremidade fosca voltada para cima. • Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite protegidas de poeira. • Guardar em caixas. Silano (silanização) • Colocar as lâminas em solução de Poly-L-lysina (1:10). Utilizar recipientes plásticos. • Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite. • Guardar as lâminas em caixas para evitar contaminação e poeira. Poly-L-Lysina 12. Lavar em TBS durante três minutos. 13. Incubar as lâminas no anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos. 14. Lavar em tampão TBS durante três minutos. 15. Incubar as lâminas em ABC – HRP por 30 minutos. 16. Lavar em TBS por três minutos. 17. Incubar as lâminas em DAB por cinco minutos. 18. Lavar as lâminas em TBS por três minutos. 19. Lavar em água destilada. 20. Corar na hematoxilina. 21. Lavar em água corrente. 22. Azular em água amoniacal. 23. Desidratar, diafanizar e montar em meio de montagem. Atécnica de imuno-histoquímica é um processo sensível de detecção molecular (antígenos), sendo de grande valor nos diagnóstico anatomopatológicos. O mecanismo básico é o reconhecimento do antíge- no por um anticorpo primário associado a diversos tipos de visualização 3.indd 70 11/08/12 20:30
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    71     a   b   d c Figura 26 - Positividade marrom em células malignas da mama, em pâncreas e linfonodo. a - Positividade em membrana (C-erb, 100x). b - Positividade nuclear (RE, 100x). c - Positividade citoplasmática. (CK-7, 100x). d - Positividade em membrana de linfócitos (CD3, 100x). 7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 71 11/08/12 20:30
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    75 Tecidos ósseosou qualquer outro tecido contendo sais de cálcio requerem a remoção destes sais para posteriormente serem submetidos à técnica histológica. Esses fragmentos, após recorte com serra, são colocados em contato com as soluções descalcificadoras para a retirada dos sais de cálcio. Durante muito tempo, o ácido nítrico a 7,5% em solução aquosa foi considerado como uma boa solução descalcificadora. Esta solução tem o inconveniente de demorar a retirar o cálcio do material (dois, três, quatro ou mais dias), o que acaba destruindo o tecido mole adjacente. Hoje utiliza-se solução descalcificadora à base de EDTA, que permite maior rapidez, além de preservar o tecido adjacente. Para descalcificar biópsia de medula óssea, que contém espículas ósseas, ainda utiliza-se o ácido nítrico, porém a 2%. As biópsias já fixadas são colocadas na solução descalcificadora, onde permanecem durante o período das 7 horas até 16 horas, quando são retiradas da solução, lavadas por cinco minutos em água corrente e, então, são submetidas a processamento histológico. 8 Descalcificação • • • • • • • • • • • • • Solução descalcificadora com EDTA EDTA, tetrassódio Tartarato de sódio e potássio Tartarato de sódio Ácido clorídrico PA Água destilada 0,7 g 8,0 g 0,14 g 120 ml 900 ml 2 ml 98 ml Ácido nítrico PA Água destilada Solução ácido nítrico 2% (medula óssea) Ácido nítrico PA Água destilada 7,5 ml 92,5 ml Solução ácido nítrico 7,5% (tecido ósseo) 3.indd 75 11/08/12 20:30
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    79 A amostrarecebida deve ser medida, embrulhada e acondicionada em cassete plástico para seguir processamento histológico: O fragmento deve ser incluído e cortado, sendo que devem ser obtidas dez lâminas sequenciais com dois cortes de 2 micras em cada lâmina. • As lâminas de números 1 e 10 são coradas por HE. • As lâminas de números 2,5 e 9 são coradas pelo tricrômico de Masson. • As lâminas de números 3, 6 e 8 são coradas pela técnica de prata metenamina – PAMS. Ver téc- nica a seguir. • As lâminas de números 4 e 7 são coradas pela técnica de PAS. • Nos casos de transplante renal, deve-se cortar mais duas lâminas para imuno-histoquímica. A avaliação de alguns tecidos requer uma rotina diferenciada, quer seja na fixação, processamen- to, espessura de corte e colorações específicas. Duas dessas situações são descritas abaixo: biópsia renal e de medula óssea. 9.1 Biópsia renal A amostra a ser examinada normalmente é obtida através de punção com agulha fina, resultando numa amostra de fragmento filiforme e delgado, que deve ser fixada em solução de Bouin alcoólico: Álcool 80% Ácido pícrico Formol PA 40% Ácido acético Solução de Bouin 300 ml 2 g 120 ml 30 ml Conservar a mistura em geladeira. Solução 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 30 min 30 min Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100° Xilol Xilol Parafina 1 (56° C - 58° C) na estufa Parafina 2 (56° C - 58° C) na estufa 9 Protocolos Especiais • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 79 11/08/12 20:30
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 80 Preparo de soluções Solução de ácido periódico 0,5% Ácido periódico Água destilada 0,5 g 100 ml Solução de ácido crômico 5% Ácido crômico Água destilada 0,5 g 100 ml Solução de bissulfito de sódio 1% Bissufito de sódio Água destilada 1 g 100 ml Procedimento • Antes de iniciar a coloração, preparar a solução impregnadora de prata metanamina. • Colocar esta solução na estufa a 56° C para que, na hora do uso, ela esteja quente. • Desparafinar e hidratar as lâminas até a água corrente. • Colocar o ácido periódico a 1% sobre a lâmina por 15 minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Imergir as lâminas em ácido crômico 5% por cinco minutos. • Lavar rapidamente em água corrente. • Colocar bissulfito de sódio 1% sobre a lâmina por cinco minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Passar por 6 trocas de água destilada. • Impregnar na solução previamente preparada (item 1) por aproximadamente 30 minutos. Os cortes devem ficar impregnados com coloração acastanhada. • Lavar em água destilada. • Imergir em solução de cloreto de ouro 0,1% por três a cinco minutos. • Lavar em água destilada. • Imergir em solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos. • Lavar em água destilada. • Corar em hematoxilina de Harris por um minuto. • Lavar em água corrente. • Corar com eosina por um minuto. • Desidratar, diafanizar e montar. Obs.: A coloração pela hematoxilina e eosina é opcional. Resultados Membranas de túbulos e glomérulos corados em negro. Método do ácido periódico prata metenamina de Gomori (PAMS) Solução de metanamina 3% Hexametyleno tetramina Água destilada 3 g 100 ml 3.indd 80 11/08/12 20:31
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    81 Solução de Bórax5% Bórax ou ácido bórico Água destilada 5 g 100 ml Solução de nitrato de prata 5% Nitrato de prata Água destilada 5 g 100 ml Solução de cloreto de ouro 0,1% Cloreto de ouro Água destilada 0,1 g 100 ml Solução de tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato de sódio Água destilada 2 g 100 ml Figura 27 - Colorações básicas na rotina de pato- logia renal. a - Córtex renal corado pela HE (100x). b - Córtex renal corado pelo tricrômico de Mas- son (100x). c - Glomérulos e túbulos renais impregnados com prata (400x). d - Imuno-histoquímica positiva em capilares pe- ritubulares e glomérulos. (C4d,100x). Solução de prata impregnadora Solução de metanamina 3% Solução de nitrato de prata 50 ml 2,5 ml Misturar e jogar fora 2,5 ml desta solução. Acrescentar 6 ml de solução de bórax 5%.   a b d c 9 Protocolos Especiais • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 81 11/08/12 20:31
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 82 Medula óssea As biópsias de medula óssea obtidas por punção, após fixadas, sofrem processo de descalcificação utilizando acido nítrico a 2% por oito horas. Seguem para o processamento histológico como biópsia pe- quena. Após inclusão, obtêm-se cortes para HE com espessura de 2 micras e lâminas para colorações de Perl’s e retículo com espessura de 4 micras. 3.indd 82 11/08/12 20:31
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    85 Este cadernoprioriza as técnicas histológicas, porém não pode deixar de mencionar noções bási- cas de citologia, as quais estão descritas com detalhes nos Cadernos de Referência 1 e 2, específicos da citologia. 10.1 Processamento de Líquidos e Secreções O material a ser submetido a estudo citológico deve ser enviado ao laboratório imediatamente após a coleta, sem fixador ou conservante, devidamente identificado e acompanhado de uma requisição contendo a história clínica do paciente. Estas amostras a serem processadas podem ser: lavados vesicais, brônquicos, líquidos ascítico e pleural, escarro, urina e outros. 10.1.1 Escarro A parte mais representativa (área espessa, sanguinolenta etc.) é colocada sobre uma lâmina de vidro e em seguida coberta com outra lâmina, que, após compressão e desligamento, transforma-se em esfregaços, que devem ser imediatamente fixados em álcool comercial (95%). Caso a amostra seja abun- dante, deverá ser fixada, submetida a processamento histológico, o qual poderá ser utilizado para proce- dimentos especiais (colorações especiais, imunoperoxidase, biologia molecular). Esses esfregaços devem ser corados pelos métodos de HE e H. Shorr. 10.1.2 Líquidos (lavados brônquico, vesical, urina, líquor, líquidos ascíticos e da cavidade toráxica) Estes líquidos são submetidos à centrífuga convencional para que haja concentração de elementos celulares (dez minutos/1.500 rpm), em seguida despreza-se o sobrenadante, e o sedimento é utilizado para confecção de esfregaço, que após fixação imediata é submetido à coloração. 10.2 Processamento deesfregaços/punções aspirativas por agulha fina (PAAF) Estes materiais são resultantes de PAAF de mama, tireoide e outros órgãos sólidos. As amostras são recebidas fixadas ou a seco (sem fixador). Os fixadores mais usados são o álcool 95° e o spray. Obs.: Lâminas fixadas em álcool ou spray podem ser coradas por HE ou H. Shorr. Para a coloração de Giemsa, o esfregaço deve ser seco ao ar livre antes de ser submetido à coloração. Fixação em citologia • Fixadores de spray - Que fixam e formam película protetora, a exemplo do polietilenoglicol dissolvido em álcool. • Fixadores líquidos - O álcool comercial (92% a 95%) é considerado fixador citológico uni- versal. Quanto mais curto for o período em segundos entre a confecção do esfregaço e a fixação, melhor será a qualidade deste. 10 Técnicas Citológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3.indd 85 11/08/12 20:31
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 86 Técnica de coloração diferencial de Shorr As lâminas fixadas em spray devem ser mergulhadas por dez minutos em álcool 80° para a reti- rada do fixador. Agora estas lâminas, juntamente com as recebidas em álcool 95°, passam pelo seguinte processo de coloração: Álcool 80° Álcool 70° Água corrente Corar pela hematoxilina Lavar em água corrente Álcool 95° Corante Shorr Álcool 95° 1º álcool 100° 2º álcool 100° 3º álcool 100° 4º álcool 100° 1º xilol 2º xilol Montar 10 mergulhadas 10 mergulhadas 10 mergulhadas 1 min 10 min 3 min 6 min Para retirar o excesso 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min - montar com resina e lamínula Lâminas fixadas em álcool 95° Álcool 80° Álcool 70° Lavar em água corrente Corar pela hematoxilina de Harris Lavar em água corrente Álcool 95° Eosinafloxina Álcool 95° 1º álcool absoluto 2º álcool absoluto 3º álcool absoluto 4º álcool absoluto 1º xilol 2º xilol Montar com resína e lamínula 1 min 1 min 1 min 10 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Técnica Coloração de H.E. (punções e líquidos) + - + - + - 3.indd 86 11/08/12 20:31
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    87 Caso seprefira uma coloração mais intensa, aumenta-se a concentração dos corantes, conforme abaixo. Giemsa Quando solicitado pelo patologista ou quando o laboratório recebe esfregaços secos sem fixação, o ideal é recorrer à coloração de Giemsa, que é específica para esfregaços secos, como segue abaixo: • As lâminas recebidas a seco são fixadas em álcool metílico por três minutos. • Preparar solução uso: diluir a solução-mãe de Giemsa na proporção de 2 ml do corante para 30 ml de água destilada. • Cobrir os esfregaços com solução uso do corante Giemsa e deixar corando por 30 minutos. • Lavar em água corrente por dez minutos. • Secar as lâminas ao ar livre ou estufa 60 °C. • Após secas, passar as lâminas discretamente no xilol. • Montar com resina e lamínula. Corante Shorr O corante Shorr é encontrado à venda pronto para uso, porém muitos serviços dão a opção de pre- parar seu corante, de acordo com a receita abaixo. 10 Técnicas Citológicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Solução tricrômico de Shorr 0,3 g 0,075 g 0,075 g 0,025 g 0,25 g 0,25 g 100 ml 1 ml Biebrich Scarlat Azul de anilina Orange G Fast Green FCF Ácido fosfotúngstico Ácido fosfomolíbdico Álcool 50° C Ácido Acético Glacial Solução 1 g 0,25 g 0,075 g 0,1 g 0,5 g 0,5 g 100 ml 2 ml Biebrich Scarlat Orange G Fast Green FCC Azul de anilina Ácido fosfotúngstico Ácido fosfomolíbdico Álcool 50º C Ácido acético glacial 3.indd 87 11/08/12 20:31
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    Caderno de Referência3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 88 Preparo do corante giemsa 5 g 330 ml 330 ml Corante Giemsa Glicerina (não pode ser bidestilada) Álcool metílico (Metanol) Solução estoque • Deixar o corante Giemsa dissolver na glicerina em estufa a 60° C por 12 horas. • Esfriar em temperatura ambiente. • Deixar descansar por uma semana e mexer com bastão de vidro todos os dias. • Adicionar o álcool metílico após uma semana de descanso. • Filtrar (o processo de filtragem é demorado devido à viscosidade da glicerina). • Armazenar em frasco escuro. 3.indd 88 11/08/12 20:31
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    89 Referências MICHALANY J. TécnicaHistológica em Anatomia Patológica. 3. ed. São Paulo: Editora Michalany, 1998. PROPHET, E. B.; Mills B. et al. Laboratory Methods In Histotechno-Armed Forces, Institute of Pathology. Washington, Estados Unidos: American Registry of Pathology, 1992. BANCROFT J. D.; STEVENS A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4. ed. Nova York, Estados Unidos: Churchill Livingstone, 1996. 89 3.indd 89 11/08/12 20:31
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    93 Perfil dos autores AbelDorigan Neto Biólogo; diretor técnico da Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (HCFMRP); diretor técnico do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMRP-USP). Gyl Eanes Barros Silva Médico, doutor em patologia pela Universidade de São Paulo (USP-SP); professor doutor da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMUSP-RP). 3.indd 93 11/08/12 20:31
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