ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
Campus Experimental de Sorocaba
Bruna Raquel Ferreira
ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS
CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)
Sorocaba
2013

Trabalho de Conclusão de Curso,
apresentado como parte dos pré-requisitos
para a obtenção do título de Engenheira
Ambiental à Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”, sob orientação do
Prof. Dr. André Henrique Rosa e coorientação
da Prof.a
Dr.a
Renata Fracácio.
Sorocaba, novembro de 2013

Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado
como parte dos pré-requisitos para a obtenção do
título de Engenheira Ambiental à Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
Professor Doutor André Henrique Rosa
Presidente da Banca – Orientador
Professora Doutora Renata Fracácio
Membro da Banca – Coorientadora
Professora Doutora Viviane Moschini Carlos
Membro da Banca
Professor Doutor Leonardo Fernardes Fraceto
Membro da Banca
Sorocaba, novembro de 2013

Bruna Raquel Ferreira – Trabalho de Graduação – UNESP Sorocaba
Dedico este trabalho à minha mãe,
a minha maior incentivadora em
todos os sentidos da vida e a
pessoa a qual me ensinou a
importância do saber.

iv
Agradecimentos
Agradeço aos meus pais, Raquel e Naelcio, por se guiarem sempre por seus
valores morais e por terem ensinado o mesmo a mim e meus irmãos; por
considerarem que educação é o bem mais precioso que poderiam passar a seus filhos
e se sacrificarem a cada dia para que pudéssemos frequentar os melhores colégios
e universidades; e pelo amor incondicional que nem por um só minuto deixaram de
demonstrar. Todas as conquistas que alcanço na vida são fruto da dedicação e do
amor de vocês.
Agradeço aos meus irmãos, Alessandra, Anderson – meu irmão de coração – e
Renato pelo companheirismo e por serem sempre meu porto seguro juntamente com
meus amados sobrinhos.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. André H. Rosa, pela oportunidade de
trabalhar num grupo de pesquisas tão conceituado e por todo impacto, imensamente
positivo, que isso causou em minha vida acadêmica e profissional.
Agradeço à minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Renata Fracácio, por ser sempre tão
presente e dedicada. Obrigada por todos os ensinamentos e por todo o tempo que
desempenhou para a minha pesquisa.
Agradeço ainda ao CNPq e à FAPESP pelo apoio direto e indireto.
Agradeço às meninas do Laboratório de Biologia da UNESP, que dedicam a maior
parte dos seus dias à nossa pesquisa, incluindo finais de semana, férias e feriados.
Obrigada por toda a ajuda com os testes e a cultura de organismos. Em especial à
Cláudia, Vivian e Andressa, sem vocês eu não teria conseguido.
Agradeço às melhores amigas com as quais sempre pude contar: Gabriela, Thais
e Mariana, pela compreensão pelos fins de semana que não voltava pra casa, e pela
parceria que perdura há mais de dez anos.
E, por fim, agradeço àqueles que se tornaram minha segunda família e fizeram
com que minha estadia em Sorocaba se tornasse não só suportável como fizeram
desses cinco anos e meio os melhores da minha vida, em especial Ana, Cecília,
Thalita e Rafael, além dos meus queridos da 5.bola e de todos os agregados desse
time, além de, não menos importante, à minha amada trombateria e todos que a
compõem. Obrigada pela parceria, pelas noites em claro estudando cálculo, pelas
festas e INTERUNESPs, pelos ombros amigos nos momentos difíceis e por me
fazerem passar a chamar essa cidade de casa. Espero que nossos caminhos
continuem a se cruzar no futuro.

v
Resumo
O controle da poluição das águas é essencial à proteção da vida e em todo o
mundo os metais pesados têm sido a classe de contaminantes químicos aquáticos
mais estudada nos últimos tempos – devido principalmente à alta toxicidade dos
mesmos, tanto aos humanos, quanto à biota aquática. A Substância Húmica tem
como característica mais relevante sua capacidade em formar complexos estáveis
após a reação com íons metálicos, possibilitando o controle da biodisponibilidade
desses metais nos corpos hídricos. A análise química dessas reações não é em si só
uma novidade, entretanto, como forma de entender mais profundamente o impacto
gerado por um tratamento dessa espécie no ambiente real, esse trabalho estudou a
diferença entre os efeitos tóxicos de águas contaminadas pelos metais Cromo e
Cádmio na presença e na ausência de substâncias húmicas aquáticas através de
testes ecotoxicológicos utilizando-se a espécie Ceriodaphnia dubia. Os resultados
para o metal Cádmio foram inconclusivos – na análise estatística de Kruskal-Wallis
obteve-se P > 0,05 para os resultados de toxicidade aguda e crônica –, enquanto que
para o Cromo, além de ser provada a diminuição da toxicidade crônica pelas
substâncias húmicas – nesse caso, no último dos três testes realizados, observou-se
diferença significativa entre a geração de filhotes para a mesma concentração do
metal na presença e na ausência de SHA –, foi observado ainda a existência de efeito
tóxico mesmo em concentração permitida pelo órgão ambiental responsável.

vi
Abstract
The water pollution control is essential to the life protection and, all over the world,
the heavy metals are being the most studied chemical contaminants class for water in
the last years – due its high toxicity, both for humans and aquatic beings. The humic
substance’s most relevant property is the capacity of create stable complexes in
reaction with metallic ions, enabling the bioavailability control of those metals at the
hydric system. Although the chemical analyses for these reactions are not an
innovation by itself, in a way to get more understanding from the impact that these
kind of treatment creates in a real environment, this essay is about the study of the
difference between the toxic effects in contaminated water by the elements Chrome
and Cadmium with and without the use of Aquatic Humic Substances, by using
ecotoxicological tests with the species Ceriodaphnia dubia. The results for the metal
Cadmium got inconclusive – the Kruskal-Wallis statistical analyses showed P > 0,05
both for acute and chronic toxicity. For the metal Chrome, the decrease of chronic
toxicity was proved, indeed, by the use of humic substances – in this case, in the last
one of three tests, significant variation could be noticed between the number of births
in the same concentration of metal on the absence and on the presence of humic
substances – and moreover, toxic effect (without the humic substance) could be
noticed even while using the metal concentration allowed by the environmental organ.

vii
Sumário
Agradecimentos ...................................................................................................iv
Resumo................................................................................................................ v
Abstract ................................................................................................................vi
Lista de Figuras....................................................................................................ix
Lista de Tabelas...................................................................................................xi
Lista de abreviações e siglas .............................................................................xiii
1. Introdução ................................................................................................... 14
2. Revisão bibliográfica................................................................................... 15
2.1. Poluição das águas .............................................................................. 15
2.2. Metais pesados .................................................................................... 18
2.2.1. Espécies metálicas de interesse ao estudo ................................... 22
2.3. Substâncias húmicas aquáticas ........................................................... 24
2.3.1. Interações entre SHA e espécies metálicas................................... 26
2.4. Análises ecotoxicológicas..................................................................... 28
2.4.1. O organismo teste.......................................................................... 28
3. Objetivos ..................................................................................................... 30
3.1. Objetivos gerais.................................................................................... 30
3.2. Objetivos específicos............................................................................ 30
4. Metodologia................................................................................................. 31
4.1. Amostragem e tratamento da SHA....................................................... 31
4.2. Cultivo do organismo-teste................................................................... 32
4.2.1. Água de cultivo e de diluição ......................................................... 32
4.2.2. Meio de cultivo ............................................................................... 33
4.2.3. Divisão dos lotes............................................................................ 33
4.2.4. Alimentação ................................................................................... 34

viii
4.2.5. Testes de sensibilidade.................................................................. 36
4.3. Cuidados com a vidraria e outros materiais.......................................... 37
4.4. Testes de ecotoxicidade....................................................................... 37
4.4.1. Mudanças nos testes ..................................................................... 40
4.5. Análises................................................................................................ 40
5. Resultados e discussão .............................................................................. 41
5.1. Cromo................................................................................................... 41
5.1.1. Primeiro teste................................................................................. 41
5.1.2. Segundo teste................................................................................ 44
5.1.3. Terceiro teste ................................................................................. 47
5.2. Cádmio ................................................................................................. 51
6. Conclusões ................................................................................................. 54
6.1. Quanto aos limites impostos pelo órgão ambiental .............................. 54
6.2. Quanto aos testes com o metal Cádmio............................................... 54
6.3. Quanto ao efeito da SHA em relação a diminuição da toxicidade de águas
contaminadas pelo metal Cromo .......................................................................... 55
7. Referências bibliográficas ........................................................................... 57
Anexo 1 – Dados complementares ao 1º teste com Cromo............................... 65
Anexo 4 – Dados complementares ao teste com Cádmio.................................. 69

ix
Lista de Figuras
Figura 1: Fatores e indicadores ambientais que interferem na qualidade das águas
(BRITO et al., 2007) ................................................................................................. 16
Figura 2: Indicação dos metais (exceto os transurânicos) em função de sua massa
especifica: ................................................................................................................ 19
Figura 3: Estágios simplificados da decomposição da Matéria Orgânica do Solo
(SILVA FILHO & SILVA, 2002)................................................................................. 25
Figura 4: Modelo estrutural proposto para SH (KLEINHEMPEL, 1970) ............. 25
Figura 5: (A) Modelo estrutural de complexo de esfera externa (adsorção
eletrostática, exemplificado para Cd2+) e (B) Esfera interna (ligação covalente,
exemplificada para Ca2+) (Sparks, 1999). ................................................................ 27
Figura 6: Localização, em relação ao mapa do Brasil, da cidade de Bertioga – de
onde foram retiradas as amostras de substância húmica aquática utilizadas nesse
trabalho. ................................................................................................................... 31
Figura 7: Aquários de armazenamento de água de cultivo ................................ 32
Figura 8: Incubadora utilizada no cultivo e nos testes de ecotoxicidade. ........... 33
Figura 9: Caixa de luz. ....................................................................................... 34
Figura 10: Alimentação da cultura...................................................................... 34
Figura 11: Recipientes com substância teste e garrafas de armazenamento das
substâncias ao fundo. .............................................................................................. 39
Figura 12: Substância metálica contendo SHA sendo filtrada a vácuo. ............. 40
Figura 13: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade aguda
para o primeiro teste com cromo.............................................................................. 43
Figura 14: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade crônica
para o primeiro teste com cromo.............................................................................. 44

x
para o segundo teste com cromo............................................................................. 46
para o segundo teste com cromo............................................................................. 47
para o terceiro teste com cromo............................................................................... 49
para o terceiro teste com cromo............................................................................... 50
para o teste com cádmio.......................................................................................... 53
para o teste com cádmio.......................................................................................... 53

xi
Lista de Tabelas
TABELA 1: Valores máximos para metais pesados em águas doces de classe 1
(baseado na resolução CONAMA 357, 2005) .......................................................... 21
TABELA 2: Agenda dos testes de toxicidade..................................................... 39
TABELA 3: Composição das substâncias utilizadas nos testes com cromo. ..... 41
TABELA 4: Contagem de óbitos e geração de filhotes para o primeiro teste com
cromo. ...................................................................................................................... 42
TABELA 5: Total geral por solução da quantia de adultos e filhotes ao final do
primeiro teste ........................................................................................................... 42
TABELA 6: Contagem de óbitos e geração de filhotes para o teste 2 de cromo.
................................................................................................................................. 45
segundo teste........................................................................................................... 45
................................................................................................................................. 48
terceiro teste. ........................................................................................................... 48
TABELA 10: Composição das substâncias utilizadas nos testes com cádmio... 51
TABELA 11: Contagem de óbitos e geração de filhotes para o teste com cádmio.
................................................................................................................................. 52
teste com cádmio. .................................................................................................... 52
TABELA 13: Medições de concentração de Cromo durante o primeiro teste. ... 65
TABELA 14: Medidas de pH e dureza das soluções teste – primeiro teste com
Cromo. ..................................................................................................................... 65

xii
TABELA 15: Medidas de pH e dureza das soluções teste – segundo teste com
Cromo. ..................................................................................................................... 66
TABELA 16: Medições de concentração de Cromo durante o terceiro teste. .... 67
TABELA 17: Medidas de pH e dureza das soluções teste – terceiro teste com
Cromo. ..................................................................................................................... 68
TABELA 18: Medições de concentração de Cádmio durante o teste................. 69
TABELA 19: Medidas de pH e dureza das soluções teste – teste com Cádmio 69

xiii
Lista de abreviações e siglas
 C – carbono.
 C. dubia – Ceriodaphnia dubia.
 CaCO3 – carbonato de cálcio.
 CLim – concentração limite (de um contaminante, dada pelo órgão
competente).
 CO2 – dióxido de carbono.
 HCl – ácido clorídrico.
 ICP – Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer.
 Meio-teste – meio de cultivo utilizado durantes os testes, contaminado com
o elemento a ser testado.
 MON – matéria orgânica natural.
 NaOH – hidróxido de sódio.
 P. subcaptata – Pseudokirchneriella subcaptata.
 t1/2 – tempo de meia vida de um elemento ou substância.
 u – unidade de massa atômica (10-18 microgramas).
 UGRHIs – unidades de gerenciamento de recursos hídricos.

14
1. Introdução
O controle da poluição das águas é essencial à proteção da vida (CONAMA 357,
2005) e cada vez mais a qualidade das águas ganha importância não só no meio
acadêmico como para a comunidade em geral. Por consequência, os órgãos
ambientais vêm se tornando mais rígidos com as normas para o lançamento de
efluentes líquidos nos corpos hídricos e com os parâmetros de classificação das
águas quanto ao uso.
Segundo Alvez et. al. (2010), em todo o mundo os metais pesados têm sido a
classe de contaminantes químicos aquáticos mais estudada nos últimos tempos,
devido principalmente à alta toxicidade dos mesmos, tanto aos humanos, quanto à
biota aquática. A importância dessa toxicidade está no fato de que estes não podem
ser decompostos pelos organismos, gerando a bioacumulação dos mesmos na
cadeia trófica. Desse modo, todas as formas de vida podem ser afetadas pela
presença de metais no meio, dependendo da dose e forma química. Há ainda metais
que são essenciais à vida, porém são requeridos em doses muito pequenas e também
se tornam tóxicos quando a concentração é aumentada (NAKANO & AVILA-
CAMPOS, 2009).
A substância húmica é um material natural, principal componente proveniente da
decomposição da matéria orgânica e vem sendo estudada há mais de duzentos anos.
Sua característica mais relevante está em sua capacidade em formar complexos
estáveis após a reação com íons metálicos, possibilitando o controle da
biodisponibilidade desses metais nos corpos hídricos (ABATE, 1998). Estima-se que
em solos minerais, mais de 50% dos elementos traços estão ligados à matéria
orgânica (KABATA-PENDIAS & PENDIAS, 1985).
Dessa forma, estudos sobre a adsorção de metais por substância húmica não são
em si novidade. Entretanto, segundo MAGALHÃES & FERRÃO FILHO, 2008, os
resultados das análises químicas não conseguem abranger todo o impacto ambiental
causado em certo local pelo fato de que não retratam os efeitos das reações sobre o
ecossistema em questão. A única forma de esses efeitos serem demonstrados é se
utilizando literalmente o ecossistema, ou de parte dele – nesse caso, os organismos
biológicos, ou organismos indicadores, que devido às suas características de alta

15
sensibilidade à agentes contaminantes, apresentam algum tipo de alteração
(fisiológica, morfológica ou comportamental) quando expostos aos mesmos.
Finalmente, por suas características multidisciplinares, trabalhos como o aqui
disposto poderão ser utilizados como bases científicas na implantação de sistemas
de tratamento de água que se utilizem da substância húmica para a sua purificação,
ao exporem não só a eficácia química desse tipo de tratamento, como também a
reação do ecossistema relacionado.
2. Revisão bibliográfica
2.1. Poluição das águas
A água é um recurso natural indispensável para o planeta. Sem ela a vida, em
qualquer uma de suas formas – animal, vegetal, bactérias, fungos, etc. –, não poderia
existir. Entretanto, mesmo essa informação sendo amplamente conhecida, o
desperdício e a falta de zelo, que faz com que ocorra constante poluição, arriscam a
disponibilidade e a qualidade da mesma (MOTA, 2010).
De acordo com Prado (2006), a quantidade de água no planeta, em todas as suas
fases físicas, é basicamente a mesma desde que a Terra chegou à sua forma
definitiva. Toda essa água constitui o que chamamos de Hidrosfera, da qual fazem
parte os oceanos, os continentes e a atmosfera. Há uma movimentação ininterrupta
entre esses reservatórios, intitulada de ciclo hidrológico (CORREIA, 2010).
Apesar da abundância indiscutível de água no planeta, que tem 70% da superfície
composta pela substância, a quantidade disponível ao ser humano é relativamente
pequena (PRADO, 2006). Apenas 3% dessa água é doce, sendo que três quartos
desse volume encontra-se em calotas glaciais e geleiras e, com isso, apenas 0,01%
da água presente na Terra está em rios, lagos e aquíferos, disponível ao homem e às
outras formas de vida que necessitam da mesma (MOTA, 2010).
Além disso, a distribuição da água disponível ao homem não é geograficamente
regular, Tundisi (1999) observou que, no Brasil, quase 80% do total da água doce

16
encontra-se na região amazônica, a qual abriga apenas 5% da população brasileira.
O cenário global é tão grave quanto, 9 países têm 60% da água doce de fácil acesso
em seus territórios e, no extremo inverso, 80 outros enfrentam escassez do bem
(LORENTZ & MENDES, 2008).
Não basta, ainda, que uma população disponha de água em quantidade: é
necessário que essa água se caracterize por um determinado padrão mínimo de
qualidade (AZEVEDO; et. al., 2006).
A qualidade das águas deriva dos ambientes naturais e/ou antrópicos onde as
quais têm sua origem, percolam, circulam ou ficam estocadas. Os problemas de
escassez de água que ameaçam a sobrevivência das populações e do ambiente
favoráveis à vida na Terra, segundo alguns, são originados pelo crescimento
desordenado das demandas e, sobretudo, pelos processos de degradação da sua
qualidade (REBOUÇAS, 2006), a qual se mantém em níveis superiores à recuperação
do recurso, de forma a reduzir os níveis de resiliência do ambiente quanto à questão
da água.
Fatores que se relacionam à qualidade são, de acordo com VEGA et al. (1998),
os processos naturais da região (chuvas, intemperismo, vegetação, etc.) e ações
antrópicas (agricultura, agropecuária, urbanismo, industrias, etc.). A Figura 1
demonstra, em um fluxograma, as ligações entre esses fatores e a qualidade da agua.
Figura 1: Fatores e indicadores ambientais que interferem na qualidade das águas (BRITO et al.,
2007)

17
A determinação dos parâmetros físico-químicos serve como base para identificar
os impactos ocorrentes no reservatório, além de determinar as alterações da
qualidade de água. A resolução CONAMA 357 indica valores limites de concentrações
de metais, ânions, parâmetros biológicos e físico-químicos, classificando os corpos
d’água em classes, de acordo com as concentrações desses parâmetros. São elas:
1. Classe especial: águas destinadas ao abastecimento para consumo
humano, com desinfecção; à preservação do equilíbrio natural das
comunidades aquáticas; e à preservação dos ambientes aquáticos
em unidades de conservação de proteção integral;
2. Classe 1: águas que podem ser destinadas ao abastecimento para
consumo humano, após tratamento simplificado; à proteção das
comunidades aquáticas; à recreação de contato primário, tais como
natação, esqui aquático e mergulho, conforme Resolução CONAMA
no 274, de 2000; à irrigação de hortaliças que são consumidas cruas
e de frutas que se desenvolvam rentes ao solo e que sejam ingeridas
cruas sem remoção de película; e à proteção das comunidades
aquáticas em Terras Indígenas.
consumo humano, após tratamento convencional; à proteção das
comunidades aquáticas à recreação de contato primário, tais como
natação, esqui aquático e mergulho, conforme Resolução CONAMA
no 274, de 2000; à irrigação de hortaliças, plantas frutíferas e de
parques, jardins, campos de esporte e lazer, com os quais o público
possa vir a ter contato direto; e à aquicultura e à atividade de pesca.
consumo humano, após tratamento convencional ou avançado; à
irrigação de culturas arbóreas, cerealíferas e forrageiras; à pesca
amadora; à recreação de contato secundário; e à dessedentação de
animais.
5. Classe 4: águas que podem ser destinadas à navegação; e à
harmonia paisagística.

18
Nesse contexto sobre a qualidade da água, Manoel Filho (1997) dispõe sobre
água poluída e água contaminada. Enquanto que poluição deve ser entendida como
a alteração não natural das características físico químicas da água superando limites
ou padrões estabelecidos, a contaminação diz respeito à inserção de organismos
patogênicos, substâncias tóxicas e/ou radioativas em teores prejudiciais à saúde do
homem. De forma que toda água contaminada é poluída, mas nem toda água poluída
é contaminada (BRITO et al., 2007).
De acordo ainda com Brito et al. (2007), poluentes podem ser gases, partículas e
substâncias dissolvidas na própria água que, de alguma forma, modificam os
indicadores de qualidades das águas, gerando efeitos negativos no ambiente.
2.2. Metais pesados
De acordo com Baccan (2004), Metais são elementos químicos que formam fortes
ligações entre seus átomos (ligação metálica) e têm três características físicas
fundamentais: conduzem eletricidade, têm brilho e são maleáveis e flexíveis. O
mesmo autor diz que o que dá à essa classe tais características é o arranjo regular
em que se encontram os cátions, cercados por um grande número de elétrons, cuja
mobilidade, por exemplo, confere brilho ao metal.
Lima & Merçon (2011), em uma conceitualização sobre metais pesados, enumera
algumas características que fazem com que possamos classificar um metal desta
forma. São elas:
 Densidade: o adjetivo “pesado” diz respeito literalmente à massa especifica
desses materiais, que deve ser maior que um mínimo que, por divergências
entre autores, varia entre 3,5 g/cm3 e 7,0 g/cm3;
 Massa atômica: maior que 23 u (massa atômica do sódio – referência);
 Número atômico: maior que 20 (número atômico do cálcio – referência);
 Formação de sulfetos e hidróxidos insolúveis;
 Formação de sais que geram soluções aquosas coloridas e complexos
coloridos.

19
Dessa forma, dependendo do autor, alguns metais podem ou não serem
classificados como pesados (Lima & Merçon, 2011). A Figura 2 demonstra as
diferentes classificações.
Figura 2: Indicação dos metais (exceto os transurânicos) em função de sua massa especifica:
Elementos não metálicos;
n ≤ 3,5 g/cm3
;
n > 3,5 g/cm3
;
n > 7,0 g/cm3
;
n > 10,0 g/cm3
;
n > 20 g/cm3
.
Os termos “metais pesados”, “metais tóxicos”, “metais traço”, “elementos traço” e
ainda “constituintes traço” são comumente utilizados como sinônimos na literatura,
referindo-se a elementos (nem sempre metais) nos sistemas aquáticos, de alto
potencial toxicológico e associados à poluição (ANZECC/ARMCANZ, 2000). Por outro
lado, Hillert (1997) defende que o termo “metal pesado” teria surgido como uma
conveniência para os legisladores para referir-se a metais com potencial tóxico.
Cádmio, mercúrio, chumbo e bismuto têm sido frequentemente mencionados -
principalmente porque a atividade humana aumentou a sua concentração no
ambiente.
Segundo Neves (1980), a atividade de substâncias tóxicas no organismo depende
mais da sua concentração do que de seu mecanismo de intoxicação. Há metais
essenciais à manutenção do metabolismo, e que participam dos processos de um
organismo, contudo, a maioria dos metais pesados se ingeridos em concentrações

20
maiores do que as necessárias para o bom funcionamento metabólico são venenos
acumulativos para este ser. Diferente do que comumente se pensa, então, nem todos
os metais causam danos à saúde humana e animal e não são nocivos se estiverem
em formas não disponíveis biologicamente e se a dieta do organismo que o ingeriu
não contiver determinados elementos que se complexam com os metais, tendo como
produto final um metal sob uma forma então tóxica (THORNTON, 1995).
A biodisponibilidade de um elemento químico depende do quão acessível o
mesmo está no sentido de poder ser absorvido pelos seres vivos presentes no mesmo
meio que o elemento (GUIMARÃES & SÍGOLO, 2008). A biodisponibilidade depende
não somente da concentração do elemento químico no ambiente, como também da
forma química em que ele se apresenta, ou seja, a espécie do elemento químico.
Diferentes espécies apresentam diferentes biodisponibilidades em concentrações
semelhantes (LIMA & MERÇON, 2011).
A forma mais tóxica de um metal não é a livre, mas quando este se encontra
como cátion ou ligado a cadeias carbônicas. O efeito denominado Amplificação
Biológica (RUPP, 1996) sugere que cátions de metais pesados absorvidos por tecidos
de organismos tenham sua concentração potencializada, pois não integram o ciclo
metabólico desses seres. Neste caso, mesmo se esses compostos forem lançados
em concentrações reduzidas em corpos d’água, ao atingirem estuários seu efeito
sobre a cadeia local é extraordinariamente ampliado, e o impacto sobre aquele
ecossistema toma medidas ainda maiores.
Atualmente, os maiores responsáveis pelas contaminações por metais pesados
são as indústrias geradores de efluentes contendo metais pesados e a agricultura que
se utiliza de fertilizantes químicos. Em muitos casos de solos contaminados por
metais pesados, seria possível diminuir o risco apenas parando de produzir alimentos
com esse tipo de fertilizante (CARVALHO, 2006).
A Política Nacional do Meio Ambiente, prevendo a contenção das fontes
poluidoras por metais pesados, através das resoluções CONAMA, criou parâmetros
visando limites máximos de concentrações de metais nos corpos hídricos – baseados
em testes toxicológicos, são elas:

21
 Resolução CONAMA 357/2005: indica valores limites de concentrações de
metais, ânions, parâmetros biológicos e físico-químicos, classificando os
corpos d’água em classes, de acordo com as concentrações desses
parâmetros. (CONAMA 357, 2005);
 Resolução CONAMA 430/2011: dispõe sobre as condições e padrões de
lançamento de efluentes especificando o lançamento de um determinado
efluente em seu corpo receptor diante da ausência de toxicidade para a
comunidade local (CONAMA 430, 2011).
A resolução CONAMA 357 (2005) diz que as águas classificadas como classe 1,
por regra, não poderão demonstrar efeito tóxico crônico a organismos, de acordo com
os critérios estabelecidos pelos órgãos ambientais competentes ou por instituições
nacionais ou internacionais renomadas, comprovados por realização de ensaios
ecotoxicológicos padronizados ou outro método cientificamente reconhecido.
A mesma resolução dá ainda valores máximos permitidos de metais pesados para
águas doces de classe 1, representados na
TABELA 1 a seguir:
TABELA 1: Valores máximos para metais pesados em águas doces de classe 1 (baseado na
resolução CONAMA 357, 2005)
Elemento Valor máximo
Cromo total 0,05 mg/L Cr
Manganês total 0,1 mg/L Mn
Ferro dissolvido 0,3 mg/L Fe
Cobre dissolvido 0,009 mg/L Cu
Cobalto total 0,05 mg/L Co
Níquel total 0,025 mg/L Ni
Zinco total 0,18 mg/L Zn
Prata total 0,01 mg/L Ag
Cádmio total 0,001 mg/L Cd
Mercúrio total 0,0002 mg/L Hg
Chumbo total 0,01 mg/L Pb
Uranio total 0,02 mg/L U

22
2.2.1. Espécies metálicas de interesse ao estudo
2.2.1.1. Cromo
O elemento de número atômico 24 e densidade 7,19 g/cm3 (20º C), é um metal
branco prateado, cristalino e resistente à corrosão, sendo que estado de oxidação
pode variar de +1 a +6 (SILVA & PEDROSO, 2001; CASTRO, 2006).
O cromo é um elemento traço essencial à nutrição humana, mas raramente
encontrado em águas naturais (SAMPAIO, 2003). O elemento é naturalmente
encontrado em solo, animais, plantas, poeiras e névoas vulcânicas, sendo quase
sempre no estado trivalente, já que o estado hexavalente existe praticamente apenas
devido a atividades humanas (ATSDR, 2001; SILVA & PEDROSO, 2001).
As principais fontes antropogênicas que liberam o cromo e seus compostos no
meio ambiente são: emissões decorrentes da fabricação do cimento e resíduos do
mesmo, construção civil, soldagem de ligas metálicas, fundições, manufatura do aço
e ligas, indústria de galvanoplastia – onde a cromação é um dos revestimentos de
peças mais comuns –, papel, borracha, lâmpadas, minas, lixos urbano e industrial,
incineração de lixo, cinzas de carvão, curtumes, preservativos de madeiras,
fertilizantes e circulação de águas de refrigeração, onde é utilizado para o controle da
corrosão. (ATSDR, 2001; SILVA & PEDROSO, 2001; CASTRO, 2006).
Segundo Castro (2006), o cromo afeta toxicologicamente os seres aquáticos
causando corrosão das mucosas, problemas respiratórios e modificações
hematológicas. Para os humanos, segundo Sampaio (2003), os efeitos são, de certa
forma, semelhantes podendo causar alergias, dores e úlceras estomacais, problemas
respiratórios, enfraquecimento do sistema imunológico, danos aos rins e fígado,
alterações genéticas, câncer de pulmão e morte.
A intoxicação por cromo se dá por ingestão e contato com a pele (SAMPAIO,
2003).
O valor máximo de concentração permitido por lei em águas consideradas não
contaminadas é de 0,05 mg/L (CONAMA, 2005)

23
2.2.1.2. Cádmio
É o elemento de número atômico 48 e densidade 8,7 g/cm3, quando a 20° C
(CASTRO, 2006). É um metal branco, brilhante, bastante maleável, ocorrendo
amplamente na natureza como sulfeto, ou cádmio combinado, geralmente corre em
teores de até 1% em muitos minérios de zinco e é obtido, principalmente, como
subproduto da extração e refinação do zinco (CARDOSO & CHASIN, 2001; SAMPAIO
2003).
Esse metal pode ter sua fonte da queima de combustíveis fósseis ou da produção
de pigmentos, baterias, soldas, equipamentos eletrônicos, lubrificantes e acessórios
fotográficos (produtos que utilizam zinco) (CASTRO, 2006). Além dos sais de cádmio,
que são muitas vezes empregados como inseticidas e anti-helmínticos (SAMPAIO,
2003).
O Cd tem mais mobilidade em ambientes aquáticos do que a maioria dos outros
metais. É bioacumulativo e persistente no meio ambiente (t1/2 de 10-30 anos).
Enquanto as formas solúveis podem migrar na água, o cádmio em complexos solúveis
ou adsorvidos em sedimentos é relativamente imóvel. Quando presente em uma
forma biodisponível, sabe-se que tanto organismos aquáticos quanto terrestres
bioacumulam o cádmio. O Cd não apresenta função biológica essencial, sendo
altamente tóxico para plantas e animais (COTTA, 2003).
Segundo SAMPAIO (2003), o cádmio causa alterações fisiológicas semelhantes
em humanos, outros animais e também em organismos aquáticos. O elemento tende
a se concentrar no fígados, nos rins, no pâncreas e na tireoide e uma vez que se
encontra no organismo, não mais é excretado, sendo que em muitos tecidos animais
e vegetais há a presença de Cd, ainda que nunca se comprovou algum efeito benéfico
do elemento a qualquer ser vivo.
Ainda de acordo com o mesmo autor, Cd pode ocasionar tumores nos testículos,
disfunção renal, hipertensão, asteriosclerose, doenças crônicas de envelhecimento e
cânceres, além de paralisia respiratória, colapso cardíaco e osteomalência
(afinamento dos ossos). Em mulheres grávidas, o feto pode ser contaminado, uma
vez que a placenta não é uma barreira efetiva ao elemento.

24
2.3. Substâncias húmicas aquáticas
Uma das fases do ciclo do carbono no ambiente constitui-se da decomposição de
material orgânico (restos de animais e plantas) e posterior recirculação do elemento
em forma de CO2 – que, em associação com outros elementos como nitrogênio e
fósforo, forma compostos essenciais a muitos organismos (GONTIJO, 2012). Nesse
processo, parte do C é assimilada pela vida microbiana e parte é convertida em
material húmico (húmus) estável (Stevenson, 1994).
A expressão matéria orgânica natural (MON) é empregada para designar toda
matéria orgânica existente nos ecossistemas naturais, sendo diferente da matéria
orgânica viva e dos compostos de origem antropogênica (OLIVEIRA, 2007). O húmus,
já citado, corresponde a 80% da MON, chamada nesse caso de matéria orgânica
detritiva (RODRIGUES, 2007). Schnitzer (1969) vai além, e diz que 70% da MON é
constituída por SH, sendo o restante distribuído entre substâncias lipídicas,
compostos azotados e hidratos de carbono.
De acordo com Silva Filho & Silva (2002), os solos são formados por quatro
componentes principais que interagem entre si. São eles de característica minerais,
orgânicas, líquidas e/ou gasosas. Malavolta (1980), diz que nos solos minerais – o
tipo de solo mais comum – as partículas minerais estão sempre ligadas à matéria
orgânica.
A matéria orgânica encontrada no ambiente é provinda de partículas maiores de
material orgânico que sofrem degradação química e biológica (Figura 3) e passam a
se agregar, por exemplo, ao solo. Algumas estruturas são de fácil assimilação e
permanecem pouco tempo no ambiente, enquanto que as SH, por apresentarem
estruturas imensamente complexas e estáveis – apresentando níveis de carbono
mais altos que nos seres vivos –, decorrentes da decomposição incompleta de tecidos
orgânicos, permanecem um tempo médio de centenas de milhares de anos nos
ecossistemas (SILVA FILHO & SILVA, 2002; ALLISON & PERDUE, 1994; BUFFLE,
1988).

25
Figura 3: Estágios simplificados da decomposição da Matéria Orgânica do Solo (SILVA FILHO &
SILVA, 2002).
As substâncias húmicas aquáticas (SHA) são formadas pela decomposição
biológica e enzimática de resíduos vegetais e animais presentes no solo
(STEVENSON, 1982), sendo transportadas às águas naturais por processos de
lixiviação. Elas podem também ser formadas diretamente no meio aquático por
decomposição de plantas e organismos aquáticos, sendo então derivadas dos
constituintes celulares e da degradação de organismos aquáticos nativos (ROCHA &
ROSA, 2003)
A estrutura da SH (HAYES,
et al. 1989) e seu
comportamento químico
(SCHNITZER & KAHN,1972;
AIKEN, et al., 1985; LACORTE,
et al. 1995) têm sido objeto de
estudo nos últimos anos.
Entretanto, pelo fato de a
substância húmica prover de
diversas diferentes fontes
orgânicas de forma a originar-se
heterogeneamente e complexamente, ocorre que a mesma tem a sua estrutura
química impossível de ser nomeada, sabendo-se apenas que ela apresenta uma
grande quantidade de grupos funcionais como carboxilas, hidroxilas fenólicas e
carbonilas (ROSA et al, 2000). No ambiente, as SH são de especial relevância devido
Figura 4: Modelo estrutural proposto para SH
(KLEINHEMPEL, 1970)

26
à variedade de trocas que são capazes de fazer com traços orgânicos e inorgânicos
(CARTER et al. 1982; ROSA et al. 2002).
Em geral, as SHA possuem cerca de 45% de oxigênio e 1-2 % de nitrogênio e
enxofre em suas estruturas. O oxigênio nas SH encontra-se predominantemente na
forma de grupos carboxílicos e fenólicos, cujas concentrações são aproximadamente
5-10 e 1-3 mmol/g, respectivamente (FISH & MOREL, 1985; ROCHA & ROSA, 2003;
OLIVEIRA et al., 2007). Esses grupamentos, doadores de elétrons, são os principais
responsáveis pelas características das SH relativas às suas interações com traços
orgânicos e inorgânicos presentes no ambiente (SANTOS et al., 1998; BUFFLE,
1984; ROSA et al., 2005).
2.3.1. Interações entre SHA e espécies metálicas
As SH interagem com compostos orgânicos xenobióticos, por exemplo, pesticidas
e herbicidas por efeitos de adsorção, solubilização, hidrólise, processos
microbiológicos e fotossensibilizantes. O efeito solubilizante das SH sobre compostos
orgânicos exerce importante função na dispersão, mobilidade e transporte dessas
substâncias no ambiente aquático e terrestre (MARTIN-NETO et al., 1994; SANTOS
et al., 1998; STEINBERG, 2003).
Além disto, em sistemas aquáticos compostos orgânicos e SHA apresentam
variadas ligações e os compostos orgânicos podem distribuir-se em complexas trocas
entre solução e fase sólida. Transporte, armazenamento e ação de compostos
xenobióticos no ambiente dependem também da estabilidade do complexo formado.
A estabilidade dos complexos xenobiótico-SHA é determinada por uma série de
fatores, incluindo o número de átomos que formam a ligação, a natureza e a
concentração do xenobiótico, concentração/estrutura da SHA, pH, tempo etc.
(ROCHA & ROSA, 2003; NASCIMENTO et al., 2004).
Entretanto, a capacidade de interação das substâncias húmicas com íons
metálicos é uma de suas características mais relevantes. Ela forma compostos
organometálicos e quelatos de forma a controlar a disponibilidade aos organismos de
elementos nutrientes e/ou tóxicos (Kabata-Pendias& Pendias, 1985).

27
Esse tipo de substância é rico em grupos funcionais de carga negativa, como
ácidos carboxílicos e hidroxílas fenólicas e alcoólicas, os quais são justamente os
pontos aos quais os metais em solução são adsorvidos pela molécula (PETRONI et
al, 2000). De acordo com Sparks (1999), os principais sítios de complexação são os
grupamentos carboxílicos efenólicos, sendo que a reação teria a forma de adsorção
catiônica via atração eletrostática (esfera externa, mantendo acamada de hidratação),
como as partículas entre os grupamentos carboxílicos carregados negativamente
(dissociados) e um cátion monovalente, ou interações mais complexas em que
ligações de coordenação (esfera interna, perdendo a camada de hidratação e
estabelecendo ligação covalente diretamente com a superfície do ligante) com os
ligantes orgânicos são formadas (Figura 5).
Figura 5: (A) Modelo estrutural de complexo de esfera externa (adsorção eletrostática,
exemplificado para Cd2+
) e (B) Esfera interna (ligação covalente, exemplificada para Ca2+
) (Sparks,
1999).
O processo de complexação por adsorção é uma das maneiras pelas quais ocorre
as reações por afinidade entre as SH e espécies metálicas. De acordo com Xu et al.
(2002), num sistema líquido-sólido a adsorção é um processo de transferência
envolvendo uma fase líquida em contato direto com uma sólida composta por
partículas de pequenas dimensões sendo que tal fase sólida deverá ter a
característica de reter uma ou mais espécies da fase líquida em sua superfície.
Oliveira (2007) indica que esta característica de certos materiais – em adsorver
espécies contidas em meios líquidos – é utilizada em inúmeros processos de
tratamento de efluentes, sendo um dos métodos mais importantes conhecidos na
atualidade.

28
2.4. Análises ecotoxicológicas
Os primeiros relatos de estudos que procurassem saber sobre as respostas de
organismos frente a diferentes estresses no ambiente datam de séculos antes de
Cristo, quando Aristóteles (384-322 a.C.) testou a reação de peixes de água doce
quando inseridos em água marinha. Sendo que o primeiro teste de toxicidade
propriamente dito, utilizando-se organismos aquáticos, foi registrado em 1816,
utilizando-se de insetos aquáticos (BUIKEMA & VOSHELL, 1993)
Truhaut (1977) foi o primeiro a se utilizar do termo “ecotoxicologia”, definindo-o
como a ciência que estuda os efeitos das substancias naturais ou sintéticas sobre os
organismos vivos, populações e comunidades, animais ou vegetais, terrestres ou
aquáticos, que constituem a biosfera, incluindo assim, de forma integrada, a interação
das substâncias com o meio em que vivem os organismos (CAIRNS &
NIEDERLEHNER, 1995).
Magalhães & Ferrão Filho (2008) dizem em seu trabalho que a ecotoxicologia
nasceu como ferramenta de monitoramento ambiental, baseada principalmente na
resposta de organismos individuais a estressores químicos de forma a entender os
mecanismos de contaminação das substâncias afim de impedir e/ou prevenir que o
mesmo ocorra, ou criar formas de interrupção, reversão ou remediação a intoxicação.
Nesse contexto, para que haja uma completa caracterização físico-química de
corpos hídricos contaminados, com correta avaliação de potencial de riscos e
estabelecimento de limites de permissividade de tais contaminantes, os testes de
toxicidade aguda e crônica com organismos aquáticos constituem-se em uma
ferramenta fundamental (BERTOLETTI & ZAGATTO, 2006).
2.4.1. O organismo teste
O uso de organismos zooplanctônicos é comum em testes de toxicidade para
água doce por serem bioindicadores sensíveis (FRACÁCIO et al., 2000) e pelo papel
que desempenham na cadeia alimentar, pois fazem parte do processo de
bioacumulação, uma vez que se alimentam de algas e servem de alimento para
predadores (BERTOLETTI & ZAGATTO, 2006). Além disso, de acordo com Pereira

29
et al. (2008), mudanças no comportamento e/ou quantidade desses indivíduos no
meio podem gerar decorrências em outros níveis tróficos do ecossistema.
De acordo com a NBR 13373, 2010, o organismo “Ceriodaphnia dubia Richard,
1894 (Crustacea, Cladocera), é um microcrustáceo zooplanctônico de 0,8 mm a 0,9
mm de comprimento, de corpo ovalado e com 8 a 10 espinhos anais, que atua como
consumidor primário na cadeia alimentar aquática e se alimenta por filtração de
material orgânico particulado. Estes organismos, vulgarmente conhecidos como
pulgas-d’água, são encontrados na Europa e na América do Norte”. Ainda de acordo
com a mesma norma, a espécie é utilizada para a avaliação da toxicidade crônica de
efluentes líquidos e substâncias químicas solúveis ou dispersas em água.
Por fim, de acordo com FRANÇA, 2009, o fato desses organismos terem sua
reprodução dada por partenogênese favorece a produção de lotes uniformes
geneticamente, com grande número de indivíduos e com características homogêneas
entre si.

30
3. Objetivos
3.1. Objetivos gerais
O presente trabalho teve como principal objetivo o de testar a eficácia do
tratamento de águas contaminadas pelos metais cromo e cádmio utilizando-se de
substância húmica aquática através de testes ecotoxicológicos com organismos da
espécie Ceriodaphnia dubia.
3.2. Objetivos específicos
 Reavaliação dos limites de concentração dos metais estudados
denominados na resolução CONAMA 237, levando-se em consideração a
toxicidade sobre a vida aquática de forma aguda e crônica;
 Avaliar a ecotoxicidade da água contendo metais com e sem tratamento de
adsorção com matéria orgânica, utilizando-se como organismo-teste o
microcustráceo Ceriodaphnia dubia;
 Avaliar a viabilidade da utilização da matéria orgânica na adsorção dos
metais considerando-se a ecotoxicidade de ambos sobre o meio aquático;
 Gerar bases científicas para novas metodologias de tratamento de águas
contendo metais que sejam eficientes a ponto de reduzir os riscos
toxicológicos para a biota aquática.

31
4. Metodologia
4.1. Amostragem e tratamento da SHA
As amostras de SHA utilizadas são provenientes do projeto de pós-doutorado da
Professora Doutora Renata Fracácio – coorientadora do trabalho em questão –,
realizado neste mesmo campus entre os anos de 2010 e 2011 (FRACÁCIO, 2011).
As amostras foram coletadas em janeiro e julho de 2010 no rio Itapanhau no
Parque Estadual da Serra do Mar (Latitude: 23°50'23"S e Longitude: 46°08'21"W) o
qual situa-se na 7ª Unidade de Gerenciamento de Recursos Hídricos (UGRHIs) -
Baixada Santista, município de Bertioga-SP – Figura 6 – (FRACÁCIO, 2011).
Figura 6: Localização, em relação ao mapa do Brasil, da cidade de Bertioga – de onde foram
retiradas as amostras de substância húmica aquática utilizadas nesse trabalho.
As substâncias húmicas aquáticas foram extraídas das amostras de águas após
filtração em membranas de 0,45 µm, acidificadas em pH 2,0 com HCl 0,5 mol L-1 e
extraídas por resina XAD-8, seguindo recomendações de Aiken (1985). Após eluição
com NaOH 0,1 mol L-1, as SHA concentradas foram acidificadas a pH 5,0 com solução
de HCl 0,1 mol L-1 HCl, evaporado a vácuo e seco em estufa de circulação de ar a 55º
C (ROSA et al., 2006).
A SHA foi mantida em frasco embalado em papel laminado devido a
fotoreatividade da mesma e, anteriormente a cada utilização, os montantes de SHA
a serem utilizados foram ainda submetidos a secagem em estufa a uma temperatura
de 30º C durante o período de 24 horas.

32
4.2. Cultivo do organismo-teste
Os organismos da espécie Ceriodaphnia dubia utilizados nos testes desse
trabalho provém inicialmente de um lote concebido pelo laboratório de pesquisas da
Bioagri Laboratórios, localizado na cidade de Piracicaba – SP, em outubro de 2011.
A partir de então, os organismos vêm sendo cultivados no laboratório de biologia do
campus de Sorocaba da UNESP pelos alunos envolvidos com as pesquisas
ecotoxicológicas orientadas pela Prof.ª Dr.ª Renata Fracácio.
Com pequenas variações durante o período da pesquisa, o cultivo foi realizado
de acordo com a NBR 13373, 2010, com algumas adaptações por conta de espaço e
recursos disponíveis ao grupo de pesquisa, consistindo ao final em:
4.2.1. Água de cultivo e de diluição
Utilizou-se água destilada reconstituída, sendo mantida sempre com o pH entre
7,0 e 7,6 e dureza total entre 40 e 48 mg de CaCO3/L. Tais águas eram mantidas em
aquários (Figura 7) cobertos e com aeração sempre ativa, os quais eram submetidos
a uma rotina de limpeza com esvaziamento e lavagem a cada duas semanas;
Figura 7: Aquários de armazenamento de água de cultivo

33
4.2.2. Meio de cultivo
Foram utilizados recipientes comuns em
vidro com volume aproximado de 300 mL
contendo água de cultivo, cobertos por plástico
filme transparente não vedado e mantidos em
ambiente climatizado, utilizando-se para isso de
uma incubadora à temperatura de 24º C com
sistema de iluminação frontal mantida com
funcionamento de fotoperíodo controlado (12
horas de luz e 12 horas sem luz durante o dia).
O meio de cultivo era trocado entre duas e
três vezes por semana com o auxílio de pipetas
vítreas, passando os indivíduos dos recipientes
de cultivo em que estavam para novos
recipientes com água de cultivo nos padrões
estabelecidos, retirada dos aquários.
4.2.3. Divisão dos lotes
Cada recipiente de cultivo mantinha aproximadamente a quantia de 70 adultos.
Na primeira troca de meio de cultivo da semana, era realizada a separação de filhotes
e a demarcação das idades dos adultos presentes. Portanto, a divisão e demarcação
de lotes era realizada por idade dos adultos contidos em cada meio, com quatro
denominações:
 Indivíduos entre 0 e 1 semana;
 Indivíduos entre 1 e 2 semanas;
 Indivíduos entre 2 e 3 semanas; e
 Indivíduos entre 3 e 4 semanas.
Os filhotes de cada recipiente de cultivo eram mantidos juntos com o recipiente
no qual nasceram durante a primeira semana, sendo separados para um novo
recipiente (ou descartados) apenas na primeira troca da semana seguinte, destinada
a renovação dos lotes.
Figura 8: Incubadora utilizada no cultivo e
nos testes de ecotoxicidade.

34
Os indivíduos escolhidos para preencher os recipientes de cultivo de lote “0 a 1
semana” de vida eram filhotes retirados prioritariamente dos lotes de idade entre 1 e
3 semanas de vida, provindo dos demais lotes somente quando necessário por conta
da baixa produção de filhotes na semana, retirada de muitos filhotes para testes,
perca de lotes, etc. Os demais filhotes eram descartados.
O lote de idade entre 3 e 4 semanas era mantido por simples motivo de segurança,
no caso de algum problema com a reprodução de novos lotes. Ao final da semana,
esse lote era completamente descartado.
O descarte de indivíduos era realizado após a adição de detergente biológico, o
qual provoca a morte dos indivíduos.
Para auxiliar a visão dos organismos, já
que se trata de uma espécie que apresenta
indivíduos de tamanho realmente reduzido,
uma “caixa de luz” (Figura 9) era utilizada
sob os recipientes de cultivo durante as
trocas. A luz vinda de baixo faz com que os
microcrustáceos sejam mais facilmente
enxergados a olho nu.
4.2.4. Alimentação
Para a alimentação da cultura, utilizava-se dois tipos de alimento: algas
clorofíceas e alimento composto.
Figura 10: Alimentação da cultura
Figura 9: Caixa de luz.

35
4.2.4.1. Clorofíceas
Cultivada no próprio laboratório de biologia da UNESP Sorocaba, a espécie
Pseudokirchneriella subcaptata foi a escolhida para a alimentação da cultura de C.
dubia pela boa receptibilidade e aceitação dos organismos cultivados para com ela e
por recomendações de normas nacionais e internacionais. A cepa axênica da referida
espécie foi obtida no Laboratório de Fisiologia Vegetal da UFSCar – São Carlos, sob
responsabilidade do Prof. Dr. Armando Augusto Vieira, e passou a ser cultivada no
Laboratório de Biologia da UNESP a partir de 2011.
O cultivo de alga foi sempre realizado de acordo com as normas ABNT (NBR
13373, 2010), utilizando-se os reagentes e meios de cultura adequados.
A alimentação com alga era realizada diariamente, exceto aos finais de semana,
fornecendo-se 5 mL de meio liquido com alga por recipiente de cultivo (por conta das
limitações por tamanho da equipe, a centrifugação, concentração e separação da alga
do meio liquido não era realizada durante o cultivo).
4.2.4.2. Alimento composto
Também chamado de alimento complementar, é uma solução a base de alimento
para peixe e fermento biológico. No cultivo dos indivíduos utilizados no trabalho
descrito, esse alimento era obtido da seguinte forma:
A partir da água de cultivo, um litro de solução de 5 g/L de ração para peixe
(Tetramin®) – o qual contém 95% de proteína – era mantida sob aeração por sete
dias;
 Ao final desse período, a solução era então filtrada em filtro de papel
comum para café e congelada. O congelamento era feito em pequenos
recipientes, com cerca de 30 a 50 mL de solução em cada, para que fosse
possível o descongelamento apenas do que se fizesse necessário em cada
ocasião. O congelamento mantinha-se por, no máximo, um mês.
 No momento da utilização do alimento, a solução citada era então unida,
numa proporção de 50% em volume, à solução de fermento biológico. Tal
solução era obtida da mistura de 0,5 g de fermento biológico em pó com
100 mL de água de cultivo, também filtrada em filtro de papel para café.

36
 A solução final poderia ser mantida, sob refrigeração, até o período máximo
de uma semana, não utilizando-se de congelamento.
O alimento composto era doado às culturas nos dias de troca do meio de cultura,
adicionando-se 7 mL de alimento por recipiente de cultivo.
4.2.5. Testes de sensibilidade
De acordo com a norma da ABNT para ensaios com a espécie C. dubia (NBR
13373, 2010), a cultura de organismos teste deve ser submetida a testes de
sensibilidade regularmente, a fim de garantir a confiabilidade dos lotes quanto a sua
sensibilidade aos contaminantes. Uma vez que os organismos dessa cultura se
mostrarem dentro de uma sensibilidade padrão – nem mais sensíveis nem mais
resistentes do que o esperado –, os dados obtidos nos testes futuros podem ser
considerados tendo valores confiáveis.
Desta forma, para uma substância de toxicidade conhecida, faz-se o teste com
concentrações acima e abaixo do valor limite e avalia-se número de mortes e
nascimentos. Os resultados não devem demonstrar alterações significativas para
concentrações abaixo da concentração limite, nem resistência dos indivíduos nas
concentrações acima do limite (ABNT 2007).
Nesse laboratório, foram sempre utilizadas soluções de Cloreto de Sódio (NaCl)
em diferentes concentrações – 0 g/L, 0,1 g/L, 0,2 g/L, 0,4 g/L, 0,8 g/L e 1,6 g/L. Os
testes eram rodados de acordo com a norma da ABNT citada e os resultados
comparados com os resultados esperados, demarcados na mesma norma.
Testes de toxicidade com os outros contaminantes só eram realizados quando os
resultados obtidos e esperados nos testes de sensibilidade eram compatíveis, sendo
que tais testes eram realizados numa frequência aproximada de 2 vezes a cada 3
meses.

37
4.3. Cuidados com a vidraria e outros materiais
Toda a vidraria utilizada para o cultivo de C. dubia era mantida sob certos
cuidados de limpeza que visavam garantir a não contaminação da mesma.
Primeiramente, materiais utilizados para essa espécie eram exclusivos, desde pipetas
e recipientes de cultivo, até béqueres utilizados no preparo de alimento e as buchas
utilizadas para a lavagem dos mesmos.
Os materiais em vidro (principalmente pipetas) eram autoclavados de tempos em
tempos (o tempo variava de acordo com o material), a fim de garantir que não
houvesse contaminação biológica na cultura. Antes da destinação de qualquer
material novo para utilização na cultura, o mesmo deveria passar não só pela
autoclavagem, como por 24 horas de banho ácido (HCl em concentração de 10%)
para garantir a descontaminação em caso dos mesmos terem estado em contato com
metais anteriormente.
Para a realização de testes de toxicidade com metais, eram utilizados recipientes
plásticos, os quais eram reutilizados durantes os testes, sempre sendo levados a
banho ácido entre as trocas / novos testes. As buchas utilizadas durante os testes
eram exclusivas a eles, para que não trouxessem contaminação de outros usos, nem
levassem contaminação por metais à cultura. Soluções com diferentes concentrações
de reagentes recebiam diferentes materiais, para que não houvesse contaminação
cruzada.
4.4. Testes de ecotoxicidade
Os testes de ecotoxicidade foram realizados para dois metais, separadamente,
sendo eles o Cromo e o Cádmio, segundo as recomendações da ABNT 13373, 2010.
As concentrações utilizadas nos testes foram definidas tendo como base as
concentrações limites dadas pela resolução CONAMA 357 (2005) para cada metal.
Utilizou-se a CLim (concentração limite) dada pela resolução e solução de
concentração cinco vezes mais alta que esta, além do branco, sem adição de metais.
As soluções metálicas foram obtidas através da diluição de uma solução padrão, com
concentração cem vezes maior que a maior concentração utilizada nos testes.

38
Como o objetivo do trabalho foi o de avaliar a atuação da Substância Húmica
Aquática na diminuição da toxicidade dos metais – e, portanto, a biodisponibilidade
dos mesmos – montou-se testes com as mesmas concentrações de metais descritas,
adicionando-se a SHA. Definido por Fracácio (2011), utilizou-se uma concentração
de 20mg/L de substância húmica. Diferentemente do caso dos metais, a SHA foi
pesada buscando-se a massa exata indicada, adicionando-a diretamente às soluções
finais, sem a produção de uma solução padrão.
Todas as soluções foram mantidas sob agitação pelo período de uma hora a partir
de sua montagem e colocadas em garrafas plásticas, sendo que as garrafas
destinadas a soluções com SHA foram embaladas com papel laminado para evitar a
fotoreatividade da mesma. Todas as garrafas com soluções foram mantidas em
geladeira durante o período de utilização, retirando-se sempre com antecedência de
cerca de 1,5 hora anteriormente ao uso para que os organismos não sofressem com
choque térmico
Foram realizadas 10 réplicas para cada concentração, sendo que cada teste foi
montado em um pequeno recipiente plástico, previamente disposto em banho ácido,
adicionando-se 15 mL de solução teste e um único organismo – um neonato com
idade entre zero e 24 horas.
Para garantir a idade dos organismos selecionados, no dia anterior à montagem
do teste, eram separados cerca de 100 adultos (dos lotes 1 a 2 semanas ou 2 a 3
semanas), num recipiente em que a ausência de filhotes fosse garantida. No dia
seguinte, então, qualquer filhote encontrado naquele recipiente de cultivo teria a idade
inferior a de 24 horas.
Como definido pela NBR 13373, 2010, os testes são finalizados com o mínimo de
7 dias ou quando forem observados o mínimo de 16 filhotes pelo menos 60% das
réplicas do controle, sendo que os testes realizados tiveram duração máxima de 10
dias. Os meios teste eram trocados a cada três dias (TABELA 2) e a contagem de
filhotes era realizada durante as trocas.

39
TABELA 2: Agenda dos testes de toxicidade.
Dia Ação
Primeiro Montagem
Segundo Apenas alimentação
Terceiro Apenas alimentação
Quarto Troca
Quinto Apenas alimentação
Sexto Apenas alimentação
Sétimo Troca
Oitavo Apenas alimentação
Nono Apenas alimentação
Décimo Desmontagem
A alimentação foi realizada com P. Subcaptata e com alimento composto assim
como no cultivo e nos testes de sensibilidade. A alga foi concentrada, esperando até
que a mesma estivesse visivelmente precipitada e retirando-se o meio liquido com o
auxílio de pipeta. A alimentação era feita com 1 mL de alimento composto no dia da
montagem do teste e nos dias de troca e com duas gotas de alga diariamente.
A Figura 11 demonstra a montagem dos testes e a as garrafas de armazenamento
das soluções.
Figura 11: Recipientes com substância teste e garrafas de armazenamento das substâncias ao
fundo.
Assim como no cultivo, os testes foram mantidos em incubadora à temperatura
de 24º C e fotoperíodo de 12 horas diárias durante todo o tempo, evitando-se deixá-
los por muito tempo em ambiente aberto (o que ocorreu apenas durante as trocas de
meio-teste).

40
Alíquotas de solução-teste foram separadas para leitura em ICP na montagem
dos testes e nas trocas de meio-teste. Também foi medido pH e dureza das soluções.
4.4.1. Mudanças nos testes
Observando-se os resultados brutos dos primeiros testes, decidiu-se realizar
algumas mudanças nos testes quanto a concentração de substância húmica afim de
aumentar a taxa de quelação do metal, buscando atingir os objetivos do trabalho.
A concentração de 20 mg/L foi dobrada e passou-se a usar 40 mg/L, deixando as
soluções sob agitação pelo período de 24 horas e, para evitar que a coloração da
água por conta da adição de SHA agisse de forma negativa no desenvolvimento dos
organismos, as soluções contendo-a foram filtradas após o período de agitação,
utilizando-se de filtração a vácuo, com auxílio de bomba de vácuo, Kitassato e filtro
de papel de gramatura 80 g/m3 e poros de 14 µm, como observado na Figura 12.
Figura 12: Substância metálica contendo SHA sendo filtrada a vácuo.
4.5. Análises
Para a conferência dos dados obtidos nos testes realizados, de forma a garantir
que os resultados observados tenham validade científica, utilizou-se o software
BioEstat 5.3 com analises de variância Kruskal-Wallis (AYRES et al., 2000).

41
As análises foram feitas em duas etapas: primeiramente foram analisados os
dados de mortalidade, para observação dos efeitos tóxicos agudos das soluções teste
utilizadas. Em segundo lugar foram analisados os números referentes à geração de
filhotes, a fim de obter conclusões sobre os efeitos tóxicos crônicos dessas mesmas
sustâncias.
Nas análises estatísticas considerou-se que o teste apresentou diferenças
significativas entre os resultados para cada concentração quando o P obtido foi menor
que 0,05.
5. Resultados e discussão
5.1. Cromo
Os testes foram realizados através da montagem de dez repetições de seis
diferentes soluções à base de cromo, descritas na TABELA 3, a seguir.
TABELA 3: Composição das substâncias utilizadas nos testes com cromo.
Nome da Solução
Concentração de
Cromo (mg/L)
Presença de
SHA1
Branco 0,00 X
CONAMA 0,05 X
C Maior 0,25 X
Controle SHA 0,00 ✓
CONAMA + SHA 0,05 ✓
C Maior + SHA 0,25 ✓
“C maior” refere-se a concentração maior, ou seja, a concentração cinco vezes maior que a concentração limite
dada pelo CONAMA, chamada aqui simplesmente de “CONAMA”.
Serão analisados nesse trabalho os resultados de três testes, realizados em
períodos diferentes e com pequenas, mas significativas, alterações entre si.
5.1.1. Primeiro teste
Nos primeiros testes realizados, diferente do disposto nos métodos relacionados
a esse trabalho, as soluções utilizadas como meio de cultivo durante os testes eram
1 A concentração de SHA utilizada foi de 20 mg/L nos primeiros dois testes e 40 mg/L no último.

42
fabricadas em quantidade suficiente apenas para uma única troca, descartando-se o
sobressalente, de forma que em cada troca fosse necessária a fabricação de mais
solução teste. As soluções também não passavam por um período de agitação
mecanizada, sendo apenas homogeneizadas em balão volumétrico, manualmente.
Nessa fase, o controle que analisa a interferência da presença de substância
húmica no meio do ciclo de vida dos organismos não ocorreu, não sendo montados
testes com a solução “controle SHA”.
Os resultados referentes ao teste realizado da maneira descrita nos dois últimos
parágrafos estão dispostos nas tabelas a seguir.
TABELA 4: Contagem de óbitos e geração de filhotes para o primeiro teste com cromo.
Branco CONAMA C maior CONAMA + SHA C maior + SHA
Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes
1 0 0 0 0 0 0 1 17 0 0
2 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
3 1 18 1 0 0 0 1 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 1 15 0 0 0 0 1 16 0 0
6 0 0 1 21 0 0 1 9 0 0
7 1 21 0 0 0 0 0 0 0 0
8 1 40 0 0 0 0 1 0 0 0
9 1 41 1 0 0 0 0 0 0 0
10 1 16 1 0 0 0 1 0 0 0
TABELA 5: Total geral por solução da quantia de adultos e filhotes ao final do primeiro teste
Solução Total de adultos Total de filhotes
Branco 6 151
CONAMA 5 21
C maior 0 0
CONAMA + SHA 7 42
C maior + SHA 0 0
Analisando os dados brutos do teste nomeado dados pela TABELA 4 e resumidos
na TABELA 5, visualiza-se a possibilidade de confirmação do efeito tóxico do metal
sobre os organismos de forma aguda quando em alta concentração (alta mortalidade
de indivíduos). Para a toxicidade crônica – quando em concentração permitida pelo
órgão CONAMA (baixa geração de filhotes quando comparado com o branco) – nota-
se certa diferença nos valores para solução branco e soluções contaminadas por

43
metais (nesse caso, nota-se, ainda, certa diferença entre os testes sem e com adição
de SHA, aumentando a geração de filhotes do primeiro para o segundo tipo).
Para, então, testar a validade dessas observações e afirmar resultados quando à
utilização da SHA utilizou-se a análise de Kruskal-Wallis, através do software de
estatísticas BioEstat 5.3.
Primeiramente, os dados de toxicidade aguda foram apurados:
Figura 13: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade aguda para o primeiro
teste com cromo
As comparações entre a mortalidade do Branco e da concentração “CONAMA” –
com ou sem SHA – mostraram-se não significativas (P > 0,05), explicitando o fato de
não observar-se toxicidade aguda nessa concentração de cromo.
Por sua vez, as comparações entre Branco e a as concentrações “C maior”, em
ambos os casos (com e sem SHA), obteve-se P < 0,05, de forma que a SHA não foi
capaz de eliminar a toxicidade nesse caso. A comparação entre “C maior” e “C maior
+ SHA” também gerou P > 0,05, confirmando tal fato.

44
Figura 14: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade crônica para o primeiro
teste com cromo.
Uma vez que os indivíduos expostos à concentração metálica mais alta (C maior)
foram vítimas de toxicidade aguda, a toxicidade crônica é estudada observando-se
apenas os dados para a concentração limite de cromo – “CONAMA”.
Os resultados de toxicidade crônica – geração de filhotes – não apresentaram
diferenças significativas entre as concentrações testadas, de forma que não se
confirma a ocorrência de efeito crônico nesses casos. Consequentemente, também
não se nota diferença de toxicidade entre os testes com e sem SHA.
O Anexo 1 – Dados complementares ao 1º teste com Cromo – neste trabalho,
apresenta as concentrações reais de Cromo nas soluções teste, medidas através de
alíquotas retiradas dos descartes nas ocasiões de troca de meio teste e finalização
dos testes. Observa-se naqueles dados, que a concentração de cromo esteve sempre
abaixo da esperada em teoria.
5.1.2. Segundo teste
Nessa segunda fase de testes, passou-se a montar repetições para a
concentração “controle SHA”, que visa checar se a concentração de substância
húmica aquática das soluções que simulam o tratamento de água pode gerar algum
tipo de interferência no ciclo de vida dos microcrustáceos – o que poderia ocorrer
principalmente pela coloração e turbidez da água na presença da substância.

45
Outra mudança foi a fabricação do volume total de substâncias teste no dia da
montagem, mantendo-as em garrafas plásticas em refrigerador. Dessa forma,
esperava-se diminuir o erro nas concentrações de cromo e SHA e evitar que a
concentração de cromo nas substâncias contendo o metal e SHA voltasse ao valor
inicial, uma vez que se espera que este valor diminua ao longo do tempo, em resposta
ao tratamento testado.
Branco CONAMA C maior Controle SHA CONAMA + SHA C maior + SHA
Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes
1 1 15 1 0 0 0 1 25 1 19 0 0
2 1 0 1 19 0 0 1 17 1 1 0 0
3 1 18 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0
4 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0
5 1 16 1 0 0 0 1 26 1 0 0 0
6 1 2 1 6 0 0 1 0 0 0 0 0
7 1 21 1 13 0 0 1 27 1 23 0 0
8 1 0 1 0 0 0 1 26 1 30 0 0
9 1 21 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0
10 1 17 1 14 0 0 1 18 1 26 0 0
TABELA 7: Total geral por solução da quantia de adultos e filhotes ao final do segundo teste.
Branco 10 110
CONAMA 10 52
C maior 0 0
Controle SHA 9 139
CONAMA + SHA 9 99
C maior + SHA 0 0
Neste segundo teste com o metal cromo, os resultados brutos se mostraram
similares aos obtidos na primeira etapa com observada menor mortalidade nas
concentrações em que não há a presença de toxicidade (branco, CONAMA, controle
SHA e CONAMA + SHA) o que sugere que o armazenamento das substâncias teste
gerou melhores condições para os organismos.

46
Figura 15: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade aguda para o segundo
teste com cromo.
Como esperado após a análise dos dados brutos, os resultados estatísticos foram
semelhantes aos do primeiro teste. As comparações entres os dados de mortalidade
explicitaram diferença significativa (P < 0,05) para, e somente para, os testes de
concentração “C maior”, com e sem SHA.
A comparação do número de mortes para os controles dos testes – ou seja, as
substâncias em que não há a interferência de metais – demonstra que a presença de
SHA não confere toxicidade aguda à solução teste, uma vez que não se observa
diferenças significativas entre os resultados do branco e do controle SHA.

47
Figura 16: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade crônica para o
segundo teste com cromo.
De forma análoga aos resultados de toxicidade aguda, o segundo teste demonstra
resultados semelhantes ao primeiro teste no que diz respeito à toxicidade crônica de
forma a não salientar a existência real de toxicidade crônica nas concentrações
CONAMA com e sem substância húmica, além de não haver diferenças significativas
para a geração de filhotes entre as duas concentrações citadas.
Na comparação entre “Branco” e “Controle SHA” também obteve-se P > 0,05,
demonstrando que a concentração de SHA utilizada não é suficiente para surtir efeitos
de toxicidade crônica nos organismos estudados.
5.1.3. Terceiro teste
Na terceira fase de testes, as mudanças descritas no item “4.4.1. Mudanças nos
testes” na página 40 desse trabalho foram incorporadas.
Considerando-se que os resultados dos testes anteriores ficaram abaixo do
esperado por conta da baixa concentração de SHA nas soluções, foi decidido dobra-
la, usando então 40 mg/L de substância húmica aquática nas soluções metálicas, a
fim de observar a adsorção de uma maior porcentagem do Cromo contido na água.
Entretanto, essa ação iria de encontro com o observado no trabalho de
FRACÁCIO, 2011, no qual observou-se que tal concentração de SHA afeta

48
negativamente o ciclo de vida da espécie C. dubia. Como essas reações negativas
advêm do fato de que a concentração nominada de SHA dá à água uma coloração
amarronzada, com grande aumento da turbidez, resolveu-se implementar a filtração
das soluções teste.
Para garantir a ocorrência da quelação do metal anteriormente à filtração, as
substâncias teste contendo SHA foram mantidas sob agitação pelo período de 24
horas em recipientes (os balões volumétricos em que foram produzidas) envoltos em
papel laminado, a fim de protegê-las da luz, por conta da fotoreatividade da SHA. As
soluções metálicas sem presença de SHA foram mantidas sob agitação pelo período
de uma hora, apenas para que a homogeneização da solução fosse garantida.
Branco CONAMA C maior Controle SHA CONAMA + SHA C maior + SHA
Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes
1 1 27 0 0 0 0 1 22 0 0 0 0
2 1 17 1 0 0 0 1 0 1 15 0 0
3 1 19 1 1 0 0 1 38 1 28 0 0
4 1 0 1 0 0 0 1 0 1 27 0 0
5 1 28 1 0 0 0 1 28 1 0 0 0
6 1 18 1 0 0 0 1 0 1 17 0 0
7 1 0 1 0 0 0 1 41 1 15 0 0
8 1 34 1 0 0 0 1 18 1 22 0 0
9 1 24 0 0 0 0 1 22 1 0 0 0
10 1 20 1 0 0 0 1 38 1 22 0 0
TABELA 9: Total geral por solução da quantia de adultos e filhotes ao final do terceiro teste.
Branco 10 187
CONAMA 8 1
C maior 0 0
Controle SHA 10 207
CONAMA + SHA 9 146
C maior + SHA 0 0
Os resultados brutos para o terceiro teste, por sua vez, demonstram bastante
diferença entre os valores quando comparado aos primeiros dois testes, indicando
maior diferença na geração de filhotes entre os controles e CONAMA e entre
CONAMA e CONAMA + SHA. A análise estatística dos resultados está representada
a seguir:

49
Figura 17: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade aguda para o terceiro
teste com cromo.
Quanto à toxicidade aguda, os resultados continuaram semelhantes aos outros
testes, de forma que não há evidências da ocorrência da mesma na concentração
permitida pelo CONAMA (P > 0,05 na comparação entre CONAMA, com e sem SHA,
e Branco).
O aumento da concentração de SHA nas soluções teste não foi suficiente para
gerar diferenciação na toxicidade aguda na concentração de 0,25 mg/L, de forma que
a substância teste com essa concentração continuou a ser letal aos organismos teste
mesmo na presença das substâncias húmicas aquáticas, apresentando P > 0,05 na
comparação entre “C Maior” e “C Maior + SHA”.

50
Figura 18: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade crônica para o terceiro
teste com cromo.
Em se tratando de toxicidade crônica, os resultados demonstraram que:
 O P < 0,05 na comparação entre as concentrações “CONAMA” e
“CONAMA + SHA” indica que o aumento da concentração de SHA foi eficaz
na diminuição da toxicidade da água. Além disso, quando comparadas as
concentrações “Branco” e “CONAMA + SHA” não se obtém diferença
significativa (P > 0,05), indicando que nessa solução não se nota efeitos de
toxicidade crônica para os organismos, de forma que a eficácia do
tratamento foi tamanha a ponto de eliminar completamente a toxicidade da
água nestas condições;
 O P < 0,05 na comparação entre as concentrações “Branco” e “CONAMA”
indica que a concentração limite descrita pelo órgão ambiental pode
apresentar efeitos tóxicos crônicos em seres vivos.
Dispostos no Anexo 3 – Dados complementares ao 3º teste com Cromo – deste
trabalho, encontram-se os as concentrações reais de Cromo nas substâncias teste,
medidas através de alíquotas retiradas tanto dos descartes de meio teste, quanto das
garrafas de armazenamento de solução teste. Nesses dados, nota-se que as
concentrações de cromo, apesar de diferirem da esperada, são mais próximas à ela
do que as observadas no primeiro teste. Essa observação tem sua importância no
fato de no primeiro teste não ter sido observado efeitos tóxicos crônicos na

51
concentração “CONAMA”, diferente do ocorrido no teste em questão. Uma vez que,
muito provavelmente por conta da metodologia aplicada na fabricação das soluções
teste, o erro humano da primeira vez foi maior.
A observação de toxicidade na concentração limite indicada pelo órgão CONAMA
fica, desta forma, reforçada, uma vez que ainda que com erro de cerca de 20%, tendo
sido a concentração observada mais baixa que a indicada, nota-se efeito toxico
crônico considerável nos organismos teste.
5.2. Cádmio
Os testes com o elemento cádmio foram realizados na mesma época do primeiro
teste com o elemento cromo e, portanto, com a mesma metodologia descrita no item
“5.1.1. Primeiro teste” na página 41 deste trabalho.
Os testes foram realizados através da montagem de dez repetições de cinco
diferentes soluções à base de cádmio, descritas na TABELA 10, a seguir.
TABELA 10: Composição das substâncias utilizadas nos testes com cádmio.
Nome da Solução
Concentração de
Cádmio (mg/L)
Presença de SHA1
Branco 0,000 X
CONAMA 0,001 X
C Maior 0,005 X
CONAMA + SHA 0,001 ✓
C Maior + SHA 0,005 ✓
“C maior” refere-se a concentração maior, ou seja, a concentração cinco vezes maior que a concentração limite
dada pelo CONAMA, chamada aqui simplesmente de “CONAMA”.
1 A concentração de SHA utilizada foi de 20 mg/L.

52
TABELA 11: Contagem de óbitos e geração de filhotes para o teste com cádmio.
Branco 1 (CONAMA) 2 (C maior) 3 (CONAMA + SH) 4 (C maior + SH)
Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes Adultos Filhotes
1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0
2 1 19 1 0 1 18 1 0 1 21
3 1 0 1 21 1 0 1 20 0 0
4 1 25 1 0 1 0 1 13 1 0
5 1 0 1 13 1 4 1 0 1 0
6 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0
7 1 31 1 0 1 0 1 0 1 0
8 1 23 1 7 1 0 1 0 0 0
9 1 16 1 0 1 0 1 0 1 0
10 1 16 1 24 1 0 0 0 1 0
TABELA 12: Total geral por solução da quantia de adultos e filhotes ao final do teste com cádmio.
Solução
Total de
adultos
Total de
filhotes
Branco 10 130
Conama 10 65
C maior 10 22
CONAMA + SHA 9 33
C maior + SHA 8 21
Ao analisar os números obtidos ao fim do teste com o elemento cádmio, nota-se
que apenas a concentração “branco” teve alguma diferença significante – e somente
em se tratando de geração de filhotes – quando comparando as concentrações umas
com as outras.
Assim como o esperado já pela análise dos dados brutos, as análises estatísticas
não trouxeram validade para o teste quanto à toxicidade aguda nem quanto à
toxicidade crônica. Em ambos os casos, o teste de Kruskal-Wallis apresentou P >
0,05, não havendo diferenciação significante entre nenhuma das concentrações
utilizadas. Dessa forma, uma vez que não se observou qualquer indício de toxicidade
nos testes, não coube avaliar o efeito das substâncias húmicas aquáticas sobre a
diminuição dessa teórica toxicidade em águas contaminadas por Cádmio.

53
Figura 19: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade aguda para o teste
com cádmio.
Figura 20: Representação gráfica das análises estatísticas para toxicidade crônica para o teste
com cádmio.
O Anexo 4 – Dados complementares ao teste com Cádmio – disponível ao final
deste trabalho, indica os valores reais de concentração do metal Cádmio nas soluções
teste ao longo das trocas de meio teste. Observa-se na TABELA 18 que os valores
não correspondem à teoria em nenhum dos casos, com erros tanto para mais quanto
para menos. Os erros nesse caso podem ter sido consequência de:
 Falha humana: a metodologia utilizada na fabricação das soluções, com
concentrações extremamente baixas do metal, pode ter sido

54
insuficientemente rigorosa. Além disso, assim como no primeiro teste com
Cromo, a repetição do processo de fabricação de soluções teste à cada
troca, aumenta a possibilidade do erro;
 Falha na medição: o equipamento de medição pode não ter sido adequado
à faixa de concentrações esperada, de forma que os dados da TABELA 18
não sejam confiáveis.
6. Conclusões
6.1. Quanto aos limites impostos pelo órgão ambiental
O trabalho aqui descrito detectou evidências da ocorrência de efeitos de
toxicidade crônica nos organismos estudados em concentração igual ou inferior à
concentração limite descrita na legislação (CONAMA 357, 2005) para o metal Cromo
no terceiro teste com o elemento através dos testes estatísticos – além da evidência
numérica, porém sem constatações estatísticas, nos demais testes.
Uma vez que os testes foram realizadas de forma semelhantes aos descritos na
legislação, o aprofundamento dessa questão em futuros trabalhos de pesquisa se
mostra imensamente conveniente e pertinente.
6.2. Quanto aos testes com o metal Cádmio
A inconclusividade dos resultados para o metal Cádmio pode ter sido gerada pelos
seguintes motivos:
 Por se tratar de uma concentração extremamente baixa, o erro humano
gerado na fabricação das soluções teste de Cádmio levaram a
impossibilidade da avaliação de seus resultados;
 A alimentação deveria ter sido realizada com alga precipitada de seu meio
de cultivo por centrifugação, a fim de reduzir ao máximo a diluição da
solução teste utilizada;

55
 O aparelho de medição utilizado não foi o melhor indicado para a faixa de
concentração esperada nas alíquotas – leitura feita por forno de grafite
seria, nesse caso, melhor indicada.
O cenário mais provável é de que os erros descritos tenham ocorrido
concomitantemente, de forma que tenham sido propagados e intensificados.
A falta da evidência de toxicidade em quaisquer concentrações utilizadas
inviabilizou, por fim, a análise de resultados sobre o tratamento de águas
contaminadas com Cádmio pelo o uso de SHA, objetivo referido desse trabalho.
6.3. Quanto ao efeito da SHA em relação a diminuição da
toxicidade de águas contaminadas pelo metal Cromo
Conforme o objetivo previsto neste trabalho, observou-se através da análise dos
resultados numéricos dos três testes, mas, principalmente pela evidência estatística
no último desses, a decorrência da diminuição da toxicidade crônica da água
contaminada pelo elemento Cromo em concentração similar à CLim indicada pelo
órgão ambiental (CONAMA 357, 2005).
Salienta-se, ainda, que tal diminuição de toxicidade ocorreu com tamanha efiência
que se observou a similaridade estatística entre os testes desenvolvidos em solução
branco, sem a presença de metais, e a solução CONAMA + SHA, aquela com a
presença de Cromo e com a SHA agindo em tratamento da água, podendo-se
considerar que a toxicidade crônica nessa situação foi totalmente eliminada.
O fato do resultado favorável ter sido notado apenas no último dos testes, quando
a concentração de SHA foi aumentada para 150% da inicial, adicionando-se o fato de
não ter sido possível notar a diminuição da toxicidade aguda nos testes montados em
solução com concentração 5 vezes mais alta que a CLim indicada, demonstra que
para o tratamento de sistemas reais seria necessário a utilização de concentrações
ainda maiores de substância húmica, dependendo, é claro, da concentração do
contaminante. Nesse caso, a filtração da água após o tratamento com SHA seria
extremamente necessário, uma vez que a coloração constitui um dos parâmetros de
qualidade da mesma.

56
Finalmente, o objetivo principal do trabalho foi então assim atingido com a
observação da diminuição da toxicidade de águas contaminadas por metais através
do uso de tratamento químico com substâncias húmicas aquáticas.

57
7. Referências bibliográficas
ABATE, G. Isolamento, Purificação e Estudos de Complexação de
Substâncias Húmicas. 14 Dez 1998. 119 f. Dissertação – Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998.
ABNT (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS) NBR 13373:2010:
Ecotoxicologia Aquática, Toxicidade Crônica, Método de Ensaio com Ceriodaphnia
spp (Crustacea, Cladrocera). Rio de Janeiro ABNT: 2010.
ABNT (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS) NBR 15470:2007,
Ecotoxicologia Aquática, Toxicidade em sedimento, método de ensaios com Hyalella
spp (Amphipoda). Rio de Janeiro. ABNT: 2007.
AIKEN, G. R. Humic substances in soil, sediment, and water: geochemistry,
isolation, and characterization. New York: EdWiley, 1985.
ALLISON, J. D.; PERDUE, E. M. Modeling metal-Humic Interections With
MINTQA2. In SENESI, N.; MILANO, T. M. Humic Substances in the Global
Environment. Elsevier, Amsterdam (Netherlands). 1994.
ANZECC/ARMCANZ - Australian Guidelines for Water Quality Monitoring and
Reporting. October, 2000. Disponível em:
<http://www.ea.gov.au/water/quality/nwqms/#monitor>.
ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry), 2001. ToxFAQs™
for Chromium. Disponivel em: <http://www.atsdr.cdc.gov/tfacts7.html> e
<http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/ tp7.html> Acesso em: 8 dez. 2011.
AYRES, M.; AYRES-JR., M.; AYRES, D.L.; SANTOS, A.S. BioEstat
2.0 Aplicações estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. 2000.
Sociedade Civil Mamirauá, Belém.
AZEVEDO, S. M. F. O.; BRANCO, S. M.; TUNDISI, J. G. Água e saúde humana.
In: BRAGA, B. REBOUÇAS, A. C.; TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: Capital
ecológico, uso, conservação. 3. ed. São Paulo: Escrituras editora, 2006. Pág. 241-
267.

58
BACCAN, N. Metais Pesados: Significado e Uso da Terminologia. In: ANAIS IX
ENCONTRO NACIONAL SOBRE CONTAMINANTES INORGÂNICOS, IPEN, São
Paulo, 2004
BERTOLETTI, E.; ZAGATTO, P. A. Ecotoxicologia Aquática – Princípios e
Aplicações. Ed. Rima. São Paulo, 2006.
BRITO, L. T. de L.; MOURA, M. S. B. de; GAMA, G. F. B. (Ed.). Potencialidades
da água de chuva no semi-árido brasileiro. Petrolina: Embrapa Semi-Árido, 2007.
cap. 1, p. 13-32.
BUFFLE, E. H. Complexation reactions in aquatic systems: an analitytical
approach. Chichester: Horwood, 1988. 692 p.
BUFFLE, J.; STAUB, C. Measurement of complexation properties of metal-ions in
natural conditions by ultrafiltration - measurement of equilibrium-constants for
complexation of zinc by synthetic and natural ligands. Analytical Chemistry, v. 56, n.
14, p. 2837-2842, 1984.
BUIKEMA, A. L. & VOSHELL, J. R., 1993. Toxicity studies using freshwater
benthic macroinvertebrates. In: Freshwater Biomonitoring and Benthic
Macroinvertebrates (D. M. Rosenberg & V. H. Resh, ed.), pp. 344-398, New York:
Chappman & Hall.
CAIRNS, J. Jr.; NIEDERLEHNER, B. R. Ecological Toxicity Testing. Lewis
Publishers, Boca Raton, USA. 1995. Pág 228.
CARDOSO, L. M. N.; CHASIN, A. A. M. Ecotoxicologia do Cádmio e seus
compostos. Caderno de Referencia Ambiental (CRA) vol. 6, Salvador, BA. 2001.
CARTER, C. W. & SUFFET, I. M.; Binding of DDT to dissolved humic materials.
Environmental Science Technology, v.16, p. 735-740 ,1982.
CARVALHO, T. V. Biomateriais à Base de Quitosana de Camarão e Bactérias
para Remoção de Metais Traços e Petróleo. 2006. 98 f. Dissertação (Pós-
Graduação em Ciências Marinhas Tropicais) – Instituto de Ciências do Mar,
Universidade Federal do Ceará, Ceará. 2006.

59
CASTRO, S. V. Efeitos de Metais Pesados Presentes na Água Sobre a
Estrutura das Comunidades Bentônicas do Alto do Rio das Velhas – MG.
Universidade de Minas Gerais. Programa de Pós-Graduação em Saneamento, Meio
Ambiente e Recursos Hídricos. Belo Horizonte, 2006. Disponível em: <
http://www.smarh.eng.ufmg.br/defesas/220M.PDF>. Acesso em: setembro de 2013.
CONAMA (CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE). RESOLUÇÃO No.
357 2005. Ministério do Meio Ambiente. Disponível em:
<http://www.mma.gov.br/port/conama/res/res05/res35705.pdf>. Acesso em: 10 Jun.
2012.
CONAMA (CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE). RESOLUÇÃO No.
430 2011. Ministério do Meio Ambiente. Disponível em:
<http://www.mma.gov.br/port/conama/legiabre.cfm?codlegi=646>. Acesso em: 10
Jun. 2012.
CORREIA, P. R. B. L. Águas de Abastecimento Público na Ilha do Fogo –
Concelho de São Filipe. Instituto Superior de Educação, Departamento de Ciências
e Tecnologia. 2008. Portal do Conhecimento de Cabo Verde. Disponível em: <
http://portaldoconhecimento.gov.cv/handle/10961/1732>. Acesso em: setembro de
2013.
COTTA, J. A. O. Diagnóstico Ambiental do solo e sedimento do Parque
Estadual Turístico do Alto Ribeira (PETAR). Universidade São Paulo – Instituto de
Química de São Carlos. Dissertação apresentada para obtenção de título de mestre
em Ciências - Química Analítica. São Carlos, 2003.
FISH, W.; MOREL, F. M. M. Propagation of error in fulvic acid titration data: A
comparison of three analytical methods. Canadian. J. Chemistry. 1985.
FRACÁCIO, R. Avaliação do Potencial Ecotoxicológico de Interferentes
Endócrinos em Amostras de Água e Sedimento na Presença de Substâncias
Húmicas: Formulação e Aplicação de Sedimentos Artificiais em Testes
Ecotoxicológicos. Relatório Científico para Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo, Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus
Experimental de Sorocaba, 2011.

60
FRACÁCIO, R.; RODGHER, S.; ESPINDOLA, E. L. G.; PASCHOAL, C. M. R. B.;
LIMA, D.; NASCIMENTO, A. P.; RODRIGUES, M. H. Abordagem Ecotoxicológica. Págs.
131-144. In: ESPINDOLA, E. L. G.; SILVA, J. S. V.; MARINELLI, C. E.; ABSON, M. M. A
Bacia Hidrográfica do Rio Manjolinho. Rima, São Carlos – SP, 2000.
GONTIJO, E. S. J. Interação Entre Substâncias Húmicas Aquáticas e
Elementos Metálicos na Porção Leste do Quadrilátero Ferrífero – MG.
Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto – MG, 2012. Disponível em: <
http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789
/2984/1/DISSERTA%C3%87%C3%83O_Intera%C3%A7%C3%A3oSubst%C3%A2n
ciasH%C3%BAmicas.pdf>. Acesso em: outubro de 2013.
GUIMARÃES, V.; SÍGOLO, J.B. Detecção de contaminantes em espécie
bioindicadora (Corbicula fluminea) – Rio Ribeira de Iguape – SP. Química Nova,
v. 15, n. 3, p. 254-261, 1992.
HAYES, M. H. B., et al. (Ed.) Humic substances II: in search of structure. New
York: John Wiley & Sons, 1989. 747p.
HILLERT, M. ICME (INTERNATIONAL COUNCIL ON METALS AND THE
ENVIRONMENT). Newsletter, Vol. 5, No. 4. Ottawa, Canada. 1997. Disponível em:
<http://www.icmm.com/industry_questdetail.php?rcd=4. Acesso em 16/03/2005>.
KABATA-PENDIAS, A.; PENDIAS, H. Trace Elements in Soils and Plants. 3.
ed. Boca Raton: CRC, 1985. 315 p.
KLEINHEMPEL, D. Belziehungen einiger Huminstoffkennzahlen zum Ertrag
auf Schwarzerdestandorten. Albrecht-Thaer-Archiv. 1970.
LACORTE, S.; BARCELÓ, D. Rapid degradation of fenitrothion in estuarine
waters. In: Environ. Sci. Technol, 1995. v. 28, p.1159-1163.
LIMA, V. F.; MERÇON, F. Metais Pesados no Ensino da Química. Revista
Química Nova na Escola. Vol. 33, nº 4. Novembro de 2011. Págs. 199 a 205.
LORENTZ, J. F.; MENDES, P. A. B. A Água e sua Distribuição Espacial.
GTÁguas: a Revista das Águas. Ano 2, número 6. Junho de 2008.

ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)

ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Semelhante a ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)

Semelhante a ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II) (20)

Último

Último (7)

ANÁLISE SOBRE O USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS AQUÁTICAS PARA A REDUÇÃO DA TOXICIDADE EM ÁGUAS CONTAMINADAS POR METAIS UTILIZANDO Cr(III) E Cd(II)