Protocolo PCR em tempo real

1. EXPRESSÃO GÊNICA
Extração de RNA
1) Macerar 50-100 mg de tecido vegetal em cadinhos com nitrogênio líquido.
2) Adicionar 1 mL TRIzol® Reagent.
2) Incubar e homogeneizar a amostra por 5 minutos a temperatura ambiente sob agitação
lenta.
3) Adicionar 0.2 mL of clorofórmio por cada 1 mL of TRIzol® Reagent usado para
homogeneização. Feche bem o tubo durante o processo.
4) Verter o tubo constatemente por 2 min a temperatura ambiente.
6) Centrifugar a amostra a 12,000 × g for 15 minutos at 4°C.
Nota: A mistura se separa em uma fase mais inferior escura (fenol-clorofórmio) e uma fase
superior aquosa incolor. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. A fase superior
é ~50% do volume total.
7) Remova a fase aquosa da amostra promovendo uma inclinação de 45° no tubo e
pipetando a solução. Evite sugar qualquer resquício da interface ou da fase orgânica
durante a remoção da fase aquosa.
8) Transfira a fase aquosa para um tubo novo e proceda a etapa de isolamento do RNA.
9) Adicione 0.5 mL de 100% isopropanol a fase aquosa, per 1 mL of TRIzol® Reagent usado
na homogeneização.
10) Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
11) Centrifugar a 12,000 × g for 10 minutos a 4°C.
Nota: O RNA geralmente é invisível antes da centrifugação e forma um preciptado
gelatinoso no fundo do tubo.
12) Remova o sobrenadante do tubo, deixando somente o pellet de RNA.
13) Lave o precipitado de RNA, com 1 mLde etanol 75% por 1 mL of TRIzol® Reagent
usado na homogeneização.
Nota: O RNA pode ser estocado em 75% etanol por pelo menos 1 ano a –20°C, ou uma
semana a 4°C.
14) Centrifugar o tubo a 9500 × g por 5 minutos a 4°C. Descarte o sobrenadante.
15) Secar o pellet de RNA por 5–10 minutos.
Nota: Não deixar o RNA secar completamente, porque o pellet pode perder sua
solubilidade. RNA parcialmente dissolvido tem uma razão A260/280 <1.6.
16) Ressuspender o pellet de RNA em água DEPC RNase-free (20–50 μL).
17) Realizar a corrida eletroforética para verificar a integridade do RNA extraído em gel de
agarose 1% com tampão NBC.

2. Quantificação do RNA purificado
A quantificação do RNA será feita utilizando um espectrofotômetro, nesse caso
especificamente o aparelhoTeCam.
Avaliação da qualidade do RNA
Após a quantificação, a qualidade será avaliada pela razão de absorção em 260/280,
as concentrações padronizadas entre 3000 a 4000 ng em 8 µl totais completados com água
DEPC, é feito o tratamento com DNase para proceder com a síntese do cDNA.
*Usar a formula CiVi=CfVf para padronização da concentração de RNA total.
Tratamento com RNase
Preparar o mix de enzima para o número de amostras a serem tratadas.
1) Adicionar 0,5 a 1 µl (verificar no gel a presença de DNA para saber o quanto de enzima
será utilizado) de DNase para 3000 a 4000 ng de RNA, 1 µl do tampão 10 X.
2) Incubar em termociclador por 15 min.
3) Adicionar 1 µl de EDTA, e inativar a reação incubando por 10 min a 65 °C.
4) Correr 2 µl da amostra para verificar o se o tratamento foi efetivo e checar a integridade
do RNA. Nesse passo correr também uma amostra não tratada a titulo de comparação.
Síntese de cDNA a partir do RNA purificado usando o protocolo MMLV (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase M-MLV RT) (Invitrogem)
A partir do RNA tratado, realizar a síntese do RNA segundo o protocolo do fabricante:
1. Use um volume de reação de 20 μL para 1 ng–5 μg de RNA total ou 1–500 ng de mRNA.
2. Adicione os seguintes componentes à um tubo de microcentrífuga sem nuclease:
3. Aqueça a mistura a 65°C por 5 minutos, depois resfrie rapidamente no gelo. Recolher o
conteúdo do tubo por breve centrifugação e adicionar os seguintes componentes:
Completar com água para 20 µl.

3. 4. Misture suavemente o conteúdo do tubo e depois incube a 37°C durante 2 minutos.
5. Adicione 1 μL (200 unidades) de M-MLV RT e, em seguida, misture pipetando
suavemente para cima e para baixo. Se estiver usando primers aleatórios, incubar o tubo
por 10 minutos a 25°C.
Observação: Se for usado menos de 1 ng de RNA, reduza a quantidade de M-MLV RT na
reação para 0,25 μL (50 unidades) e adicione a água destilada estéril até um volume final
de 20 μL.
6. Aqueça a reação a 70°C por 15 minutos para inativar a enzima.
Diluição de do cDNA
Diluir o cDNA na proporção de 1:5 em água mili-q autoclavada.
Montagem da placa para análise da expressão gênica
Mapa da placa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1. Para cada amostra deve ser feita 3 replicadas técnicas, sendo recomendado fazer três
replicadas biológicas por tratamento e amostra.
2. Diluir os primers forward e reverse para ficar na concentração final no poço de 400 a
600 nM.
Na reação de RT-qPCR, são adicionados os seguintes componentes em cada poço
de uma placa específica para a técnica:
 2 µl de cDNA já diluído;
 3 µl dos primers Fwd e Rrs já diluídos;
 5 µl de Sybr Green;
3. Fazer o mix do cDNA com o sybr, levando em consideração os primers e as replicadas
técnicas.
4. Pipetar os primers Fwd e Rvs na placa.
5. Centrifugar os mixes de cDNA e Sybr e pipetar 7 µl por poço.
Análise dos dados do RT-qPCR,
1. Normalizar os valores de Ct utilizando genes de referência (housekeeping genes)
que não variam significativamente entre as condições experimentais.
2. Calcular as diferenças de expressão relativa entre as amostras, usando a fórmula
.