Aula Diagnóstico virológico

1. Diagnóstico em Virologia
Da cultura celular às técnicas moleculares
Prof. dr. Edison Luiz Durigon
Professor Titular
Departamento de Microbiologia
ICB - USP
BMM 0125 – Microbiologia Básica
Curso de Medicina Veterinária

2. Métodos Diagnósticos
Diagnóstico
Cultivo viral
Microscopia eletrônica
Detecção Antígenos
Detecção ácidos
nucléicos
Sorologia

3. NPR-ICB/USP
Envio de Material para o Laboratório
 Ficha Epidemiológica
Todo material deve ser acompanhado de
ficha epidemiológica completa:
- nome e endereço do solicitante
- espécie do animal e histórico do caso
- existência ou não de vítima
- se houve observação do animal doente
- qual o período
- se o animal foi sacrificado ou morreu naturalmente.

4. NPR-ICB/USP
SUBSTÂNCIAS INFECCIOSAS
 são aquelas conhecidas ou sobre as quais se
tenha uma “suspeita” razoável de conter
patógenos (vírus prions, bactérias fungos
parasitas, toxinas, etc )
 embalagens contendo essas substâncias
devem usar o símbolo de risco biológico
NORMAS DA O.M.S. PARA TRANSPORTE
DE SUBSTÂNCIAS INFECCIOSAS

5. NPR-ICB/USP
TRANSPORTE DE AMOSTRAS
•Cuidados que assegurem integridade,
conservação e inviolabilidade
Foto CCZ-PMSP
Foto CCZ-PMSP

6. NPR-ICB/USP
ACONDICIONAMENTO DE SUBSTÂNCIA
INFECCIOSA PARA TRANSPORTE
RECIPIENTE PRIMÁRIO
TAMPA ROSQUEADA
MATERIAL ABSORVENTE
EMBALAGEM SECUNDÁRIA
IDENTIFICAÇÃO DO
MATERIAL
TAMPA DE ROSCA
SÍMBOLO DE RISCO BIOLÓGICO
EMBALAGEM EXTERNA
DADOS DO REMETENTE
Fonte: Laboratory biosafety manual, second edition,WHO1993.

7. Métodos de Isolamento e
Cultivo viral
-Permite a produção e isolamento viral
-Possível em:
1. Organismos (larvas de inseto, ratos, coelhos)
2. Ovos embrionados
3. Cultura de células animais
- In vivo
- In vivo
- In vitro

8. NPR-ICB/USP
TESTE DE INOCULAÇÃO EM
CAMUNDONGOS
Foto-CCZ-SPFoto-CCZ-SP
FotoCCZ-SPFotoCCZ-SP
Foto CCZ - SPFoto CCZ - SP
Foto CCZ - SPFoto CCZ - SP

9. NPR-ICB/USP
TESTE DE INOCULAÇÃO EM
CAMUNDONGOS
Período de Observação
 21 dias para cães , gatos e humanos
 30 dias para outras espécies
Camundongo albino suíço
apresentando sintomas de
infecção com vírus rábico
(Foto: CCZ-SP)
(Foto: CCZ-SP)

10. Inoculação em Ovo Embrionado
Descoberta de forma independente em
1941 por HIRST e McCLELLAND
Hirst GK 1941. Agglutination of red cells by allantoic fluid of chick
embryos infected with influenza virus. Science 94: 22-23.
McClelland L, Hare R 1941. The adsorption of influenza virus by red cells and a new

11. Inoculação em Ovo Embrionado
A capacidade de certos vírus de se replicar
em células de ovo embrionado.
Os vírus da influenza e NewCastle são
inoculados na cavidade alantóica.
 Técnica “Padrão Ouro”

12. Inoculação em Ovos
Embrionados

13. Marcação do Ovo

14. Seringas - antibiótico

15. Seringas e agulhas

16. Perfuração da casca do OVO

17. Inoculação das amostras

18. Utilização da Parafina

19. Teste de Esterilidade

20. Cultivo em células animais
- Método altamente desenvolvido para células humanas e animais
- Células são cultivadas em meios de cultura contendo nutrientes essenciais

21. Cultivo em células animais
Efeito citopático
- Diagnóstico baseado na presença de alterações na cultura celular
- Diferentes efeitos citopáticos são observados para diferentes vírus
C-: 400x
C+ Herpes:
400x

22. Cultivo em células animais
- Nem todos os vírus são cultiváveis
- Resultado demorado p/ alguns
tipos virais
Desvantagens adicionais
- Depende de vírus viáveis
- Nem todos os vírus produzem efeito
característico

23. NPR-ICB/USP
Fotos:
LabZooVis
 Neuroblastoma de camundongos (N2a)
 Vírus da raiva
Isolamento em cultura de células

24. NPR-ICB/USP
Foto: Instituto PasteurFoto: Instituto Pasteur
 sensibilidade
 especificidade
hTempo reduzido para obtenção
de resultados ( 2 a 3 dias)
 BHK-21
 Vírus da raiva
Isolamento em cultura de células

25. Cultivo em células animais
- Utilizado para vírus hemaglutinantes que não geram efeito citopático
Ex: Influenza e Parainfluenza
- Testes de aderência de hemácias em células infectadas ou vírions
HEMADSORÇÃO

26. Reação de Hemaglutinação
- Utilizado para vírus hemaglutinantes
. Ligação viral a hemácias animais
. Gera agrupamentos visíveis a olho nú
- + - + -

27. NPR-ICB/USP
Foto-CCZ-SPFoto-CCZ-SP
Foto-CCZ-SPFoto-CCZ-SP
Foto-CCZ-SPFoto-CCZ-SP

28. Histopatológico
Ex: Raiva (Método Histopatológico de Sellers)
Fotos: www.patologiaveterinaria.com
Corpúsculos de Negri

29. NPR-ICB/USP
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Imunofluorescência Direta - IFD (foto).
As setas indicam inclusões em tecido nervoso típicas de
infecção rábica.
Foto: CCZ-SP

30. Sorologia
- Diagnóstico de infecções virais por medição de resposta de anticorpos
- Diagnóstico importante para viroses que:
1. não podem ser prontamente cultivadas
2. cultivadas lentamente (demora na liberação dos resultados)
3. vírus não cultiváveis
- 2 tipos de anticorpos envolvidos: IgM e IgG
-Evidências sorológicas de infecções agudas
1. Soroconversão
2. Aum/Dimunição títulos Anticorpos
3. Presença de IgM
- Verificação da [ ] anticorpos em diferentes
fases da infecção
- aumento em 4x na [ ] indica infecção

31. NPR-ICB/USP
Soroneutralização em cultura de células BHK21
(SMITH et al.,1973 / FAVORETTO et al., 1992 / OIE desde 2006)
Fotos:
LabZooVis
Células Infectadas com vírus da
raiva submetidas a IFDFoto CCZ-PMSPFoto CCZ-PMSP
Foto CCZ-PMSPFoto CCZ-PMSP
Foto CCZ-PMSPFoto CCZ-PMSP

32. Sorologia
Ensaios indiretos
- imobilização de antígenos virais em meio sólido
- anticorpos específicos do soro de pacientes ou animais se aderem ao antígeno
- anticorpos são detectados por anticorpo anti-anticorpo ligado a uma enzima

33. NPR-ICB/USP
Sorologia
• realizada como pesquisa
em espécimes silvestres ou
domésticas para detecção de
anticorpos contra o vírus
• Prevalência de anticorpos
encontrada em uma
população
Foto CCZ-PMSPFoto CCZ-PMSP

34. Detecção de Antígenos
Virais
Vantagens:
- técnica de resultado rápido
- não requer a presença de vírus viáveis (maior flexibilidade de transporte)
Limitações
- não aplicáveis para todos os vírus
. Ex: Rhinovírus (grupo com 90 sorotipos) e com reação cruzada de anticorpos
. Ex2: presença de substâncias naturais da amostra que interferem na
metodologia

35. Microscopia Eletrônica
. Única técnica viável para visualização direta de vírus
. Útil p/ amostras com alta quantidade de partículas virais
- Vantagens
1. Comum p/ todos os vírus
2. Detecção de vírus não cultiváveis
3. Técnica barata qto aos insumos
- Desvantagens
1. Alta capacidade técnica (profissional bem treinado)
2. Baixa sensibilidade (106
partícluas/ml)
Ex: exame de fezes de pacientes com
gastroenterites por rotavírus

36. Diagnósticos Moleculares
- Detecção de ácidos nucléicos específicos virais
. Vantagens
1. Possível detecção de ácidos nucléicos virais de vírus não cultiváveis
2. Grande estabilidade de ácidos nucléicos
3. Alta especificidade
- 2 categorias principais
. Hibridização direta
. Amplificação de um alvo específico

37. Ensaio de Hibridização
- Detecção direta de ácidos
nucléicos virais sem fases de
amplificação
- Baseada na
complementariedade de sondas
(moléculas DNA marcado)
- Detecção de sequências virais

38. Ensaio de Hibridização
Resultado -
Resultado +

39. Extração de ácidos nucléicos
- Isolamento do DNA ou RNA total de uma amostra
Ex: DNA humano + DNA viral + DNA bacteriano
- Existem diferentes metodologias para extração

40. PCR
-Kary Mullis em 1983 (Nobel Medicina1993)
- Método mais importante no diagnóstico virológico desde o desenvolvimento
da cultura celular
- Vantagens
-1. Alta sensibilidade (detecta de 1-10 moléculas DNA)
-2. Altamente versátil (pode detectar tanto DNA qto RNA)
-3. Promove informação qualitativa e quantitativa
-4. Permite análise altamente detalhada de porções amplificadas
-Ex: detecção de resistência a drogas virais
-Ex2: Análise taxonômica
-Ex3: Descoberta de novos agentes virais

41. PCR
PCR - Componentes principais
-Enzima polimerase termoestável (Thermus aquaticus)
-DNA alvo
-Primers (oligonucleotídeos)
-Nucleotídeos
-Máquina com alto controle de temperatura
Ciclos consecutivos de denaturação, anelamento e
extensão resultam no acúmulo exponencial do DNA alvo
RT-PCR *

42. PCR
Reação em Cadeia pela Polimerase
Polimerase Chain Reaction

43. PCR

44. PCR

45. Corrida em gel de agarose
Detecção do produto
- O produto da PCR tem tamanho
conhecido, podendo ser detectado
de gel agarose através da
comparação com marcador de peso
molecular

46. Corrida em gel de agarose

47. PCR – Exemplo Resultado
PCR RSV
Valor esperado: 380pb
A1 A2 A3 A4 C+1 C+2 C-1 PM C-2
100pb
200pb
400pb380pb

48. PCR – Problemas
- PCR é altamente susceptível a falsos positivos e negativos
- Falsos Positivos (contaminação):
1. Produtos amplificados em reações anteriores
2. Plasmídeos contendo sequência alvo
3. Amostras clínicas positivas
- Falsos Negativos ou redução da sensibilidade
1. Extração inadequada ou ineficiente de ácidos nucléicos
2. Presença de fatores inibitórios na amostra

49. PCR - Falso Positivo
- Contaminação do ambiente laboratorial, materiais, reagentes, ou mesmo
do trabalhador
- Relacionado com aspectos da própria PCR
1. Método altamente sensível
Detecção da presença de um número muito pequeno de moléculas
2. O produto final da PCR é um grande número de cópias da mesma
sequência que a PCR é projetada para detectar
- Perigo! = Disseminação do produto da PCR pelo laboratório
-Formas de contaminação
1. Erros práticos de manuseio
2. Geração de aerosóios de liquídos da PCR

50. PCR Contaminação
- Precauções – minimizam o risco de contaminação
1. Separação física de áreas do laboratório
. Área para processamento inicial de amostras
. Área para análise do produto de PCR
2. Utilização de pipetas específicas
3. Presença de radiação UV nos reagentes da PCR
4. Utilização de pequenas alícotas dos reagentes
5. Limpeza regular dos equipamentos com 10% alvejante
6. Utilização de componentes especiais de PCR
UNG: uracil-N-glicosilase – cliva moléculas contendo Uracila
dUTP, deoxyuridina trifosfato, no lugar da dTTP, deoxytimidina

51. PCR – Espaço Físico
Organização Física laboratorial
- 4 áreas separadas devem estar presente em um laboratório molecular
1. Área de preparação de reagentes
2. Área p/ extração de ácidos nucléicos
3. Área para reação de amplificação
4. Área para análise dos produtos de PCR

52. PCR – Controles internos
- Controles Negativos
1. Controle de Extração
. controle de contaminação durante a extração
. H2O exposto a toda reação ou cultura celular livre de vírus
2. Controle de reagentes
. controle da contaminação de reagentes da PCR (H2O + reagentes)
- Controles positivos
1. Controle da extração (amostras clínicas positivas)
2. Controle genômico (controle da eficiência da PCR)

53. PCR Multiplex
-Utilização de 2 ou mais pares de primers, simultaneamente, com
alvos de DNA de diferentes vírus
- Permite a detecção de mais de 2 agentes, simultaneamente, na
mesma amostra e reação
- Requerimentos
1. Cada par de primers requer condições ótimas específicas, sendo
necessário que estas condições sejam próximas no multiplex
2. Produtos gerados devem ter tamanhos diferenciados
3. Não deve ocorrer associações entre os diferentes pares de primers

54. PCR Multiplex

55. Nested PCR
-Realização de 2 PCRs utilizando 2 pares de primers
- Segundo par de primers é complementar a sequências internas do produto
ampificado
- Método altamente sensitivo e específico

56. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Reconhecem seqüências específicas de DNA e clivam a dupla
fita (rompem a ligação fosfodiéster)
• São normalmente produzidas por batérias para as protegerem
contra invasão de DNAs estranhos

57. RFLP
Restriction Fragment Length Polymorfism

58. RFLP

59. Southern Blot

60. PCR Quantitativo
- Permite estimar a quantidade de DNA inicial e final da PCR
- Métodos simples ou sofisticados
- Simples
Comparação direta com padrão de concentração
-Utilização de uma séria de padrões de concentração
(DNA com concentração conhecida)
- Comparação da intensidade de bandas do padrão com a amostra
300ng 150ng 75ng 25ng

61. PCR Quantitativo – Real Time
PCR REAL TIME

62. Técnicas Moleculares x
Uso Clínico
Uso clínico de técnicas de amplificação molecular
•Diagnósticos de infecções
•Predisposição a doenças/fase da infecção
•Monitoramento de terapia antiviral
•Confirmação de eventos de transmissão
•Epidemiologia da infecção

63. Técnicas Moleculares x
Uso Clínico
•Diagnóstico de infecções
- Infecção é definida pela presença de vírus em amostras clínicas
- A infecção pode ser assintomática ou sintomática (doença)
2. Diagnóstico de doença
•Predisposição a doenças / fase da infecção
-A relação entre quantidade de RNA de HIV no plasma sanguíneo e o risco
de progressão da doença
- Melhor prognóstico quando comparado ao obtido com a contagem de
células CD4
- Permite a escolha do início de terapias antivirais
•Monitoramento de terapias antivirais
- A atividade da doença reflete a razão de replicação viral
- O objetivo virológico da terapia de HIV é reduzir a quantidade de RNA
viral p/níveis não detectáveis

64. •Confirmação de eventos de transmissão
-Sequenciamento do genoma viral é o método padrão para estabelecimento
de eventos de transmissão
- Este método utiliza a relação genética entre os vírus e leva em
consideração sua variação natural
-Relacionada a geração das relações filogenéticas
- Utilizam genes conservados, como os codificadores de enzimas ou
proteínas estruturais
• Verificação de resistência a drogas antivirais
- Detecção de mutações (RFLP) e sequenciamento

65. Conclusões
. Análises moleculares qualitativos e quantitativos de infecções
virais humanas tem promovido novas descobertas na história
natural de infecções virais humanas
Exs:
1. Natureza de vírus persistentes e latência
2. Replicação viral
3. Entendimento da resposta a terapias antivirais
- O desenvolvimento de métodos baseados em ensaios moleculares de
detecção, identificação e caracterização de viroses deve aumentar nos
próximos anos