Archaea - V4 (última).pptx

-ARCHAEA-
Disciplina: Microbiologia Ambiental
Professora: Juliane A. G. Goulart
Mestrandas: Daniele B. Gehrke, Fabiane Gartz e Natália Salamoni
UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU - FURB
CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS - CCT
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA AMBIENTAL – PPGEA

Foram detectados primeiramente em ambientes extremos, tais como em
fontes hidrotermais.
2
Fonte: Educação Pública., 2021

Introdução
O domínio Archaea é formado principalmente por organismos extremofílicos, isto é,
microrganismos que não apenas toleram, mas crescem otimamente em ambientes
normalmente considerados inóspitos para a vida, como fontes termais, águas
extremamente salgadas, temperaturas baixas e condições extremas de pH. São
Procariontes.
Pode-se dizer que certas espécies de arqueas definem claramente os limites de
tolerância biológica nos extremos físicos e químicos da vida. O estudo dos
microrganismos provenientes desses ambientes extremos pode nos fornecer
informações valiosas acerca da origem da vida na Terra, bem como das estratégias
adaptativas aos ambientes onde esta prosperou (Woese, 1998).
3

A adaptação de organismos a esses ambientes obrigou-os a desenvolver
componentes celulares e estratégias bioquímicas para sua sobrevivência. Por outro lado,
devido às características “exóticas” que têm, e às suas propriedades únicas, esses
microrganismos geram bioprodutos que podem ser empregados em condições drásticas,
que frequentemente ocorrem em processos industriais.
Os componentes moleculares, deles retirados, possuem muitas vezes propriedades
que os tornam especialmente adequados para serem utilizados nesses processos.
4
Introdução

Nesse contexto, hoje é geralmente aceito que esses microrganismos constituem um
precioso repositório de moléculas de interesse industrial e um excelente recurso para o
desenvolvimento de novas aplicações biotecnológicas.
Os benefícios científicos esperados de um conhecimento maior da biologia das
arqueas incluem, entre outros, a compreensão das funções exercidas por esses
organismos nos ambientes aquáticos e terrestres, bem como suas interações com outros
componentes da biodiversidade.
5
Introdução

Os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de
microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos para
obtenção de agentes terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros
para aplicações industriais e tecnológicas, biorremediação e biolixiviação de poluentes e
recuperação de minérios.
Outros benefícios incluem a otimização da capacidade microbiana para
processamento de alimentos, tratamento e/ou remediação de resíduos (esgoto
doméstico e lixo).
6
Introdução

Características:
• Podem ser autótrofos ou heterótrofos,
anaeróbios ou aeróbios;
• Apresentam forma esférica, de bastão,
espiralada, achatada ou irregular;
• Podem se reproduzir de forma assexuada e
sexuada;
• Vivem em ambientes extremos.
7
Archaea
Fonte: life of point, 2021.

A evolução é um processo que envolve o
surgimento de novas espécies de
organismos; é um tema da área de
estudo conhecida como filogenia. Uma
importante ferramenta que é utilizada
na determinação das relações evolutivas
são os RNAs ribossomais (RNAr),
justamente por comporem os
ribossomos que estão presentes em
todas as células (WOESE et al., 1990).
8
Filogenia
Fonte: Educação Pública, 2021.

O pioneiro no uso do RNAr foi Carl Woese, um
microbiologista norte-americano que revolucionou
o entendimento da evolução celular. As sequências
de alinhamentos base por base nitrogenada
realizadas com o auxílio de um computador
permitem distinguir, com base na variação da
sequência do RNAr entre dois organismos, a sua
divergência evolutiva. Com base nisso, é possível
determinar também quais são os ancestrais
comuns recentes de um grupo de indivíduos.
9
Filogenia
Carl Woese (1928 – 2012)
Fonte: News Medical, 2021.

Há cerca de vinte anos, Carl Woese e colaboradores sugeriram que os organismos
vivos fossem classificados em três grupos principais:
Archaea, Bacteria e Eukarya
Esses grupos são chamados de domínios e acredita-se que surgiram através de vias
evolutivas distintas a partir de um ancestral comum.
A diversidade e a biologia das arqueas representam uma enorme contribuição à
compreensão da Ecologia Microbiana (WOESE et al., 1990).
10
Filogenia e Fisiologia

11
Fonte: Woese, Kandler, Wheelis, 1990.

O domínio Archaea consiste de três divisões:
• Crenarchaeota, que contém as arqueas hipertermofílicas redutoras de enxofre;
• Euryarchaeota, que compreende uma grande diversidade de organismos, incluídas as
espécies metanogênicas, as halofílicas extremas e algumas espécies termoacidófilas;
• Korarchaeota, uma divisão descrita mais recentemente, que engloba organismos
hipertermofílicos pouco conhecidos, identificados a partir de sequências do gene 16S
do rRNA isolados de fontes termais terrestres, porém ainda não cultivados em
laboratório.
12

Após serem divididos os três grandes domínios a partir do sequenciamento do 16S
rRNA, estudos subsequentes mostraram que cada domínio está associado a uma série de
fenótipos. Alguns desses fenótipos são únicos de cada domínio, enquanto outros são
compartilhados entre dois ou até entre todos os três domínios, como pode ser
observado na Tabela 1.
13
Fonte: Educação Pública, 2021.

14
Fonte: Revista Biotecnologia ciência e desenvolvimento, 2003.

São os únicos organismos descobertos até o presente momento que podem
sobreviver a temperaturas acima de 95ºC, e o fenótipo hipertermofílico só é encontrado
nesse domínio da vida.
O metabolismo metanogênico: não se conhecem eubactérias nem eucariotos
capazes de produzir metano como resíduo de seu metabolismo.
O hábitat das arqueas halofílicas extremas é hipersalino e as espécies em cultivo
laboratorial requerem uma quantidade significativa de cloreto de sódio (NaCl) para o
crescimento, o que significa um ambiente com cerca de 10 vezes a salinidade encontrada
na água do mar.
15
Características do Domínio Archaea

As metanogênicas são organismos obrigatoriamente anaeróbios e liberam gás
metano (CH4) como resíduo metabólico.
São encontradas em ambientes com ausência de oxigênio e abundância de matéria
orgânica, como pântanos, açudes, lagos, sedimentos marinhos e rúmen de bovinos.
Elas retiram hidrogênio e gás carbônico desses ambientes e os utilizam em seu
metabolismo.
Vivem como simbiontes de uma grande variedade de protozoários também
anaeróbicos, convertendo produtos finais de fermentação em gás metano.
16

São de grande importância ao ambiente em que vivem pela alta eficiência de sua
enzima hidrogenase que, mantendo uma baixa pressão parcial de H2 para que a
metanogênese ocorra, permite que os demais organismos fermentadores façam
reoxidação do NADH (Nicotinamida-Adenina-Dinucleotídio/Coenzima 1), o que
corresponde a um maior rendimento de ATP(trifosfato de adenosina/nucleotídio) e um
aumento da biomassa (BROCK et al., 1994).
As arqueas termoacidófilas compõem um grupo heterogêneo, definido pela
capacidade dos organismos de crescerem em altas temperaturas que vão de 55ºC a
85ºC, com pH que varia de 1,0 até 6,0.
17

Dentre as enzimas de arqueas de grande potencial para a aplicação biotecnológica,
destacam-se as hipertermofílicas, psicrofílicas, alcalofílicas, halofílicas e barofílicas.
Entre as enzimas de arqueas que têm recebido maior atenção, estão as termozimas,
sendo que os principais processos de potencial utilização dessas enzimas são o
beneficiamento do amido, a manufatura e o branqueamento da polpa para produção de
papel e a bem estabelecida prática laboratorial da reação em cadeia da polimerase (PCR),
entre outras (EICHLER, 2001).
18
Aplicações Biotecnológicas

Estudos que envolvem o domínio Archaea vêm confirmando as duas hipóteses
iniciais de Woese e Fox (1977), isto é, que as arqueas exibem uma diversidade
fenotípica no mínimo comparavél àquela apresentada pelo domínio Bacteria e que os
organismos do domínio Archaea serão caracterizados por aspectos únicos em âmbito
molecular.
Outrossim, o fato de Archaea exibir um mosaico contendo características dos dois
outros domínios continua a estimular discussões entre os evolucionistas (FORTERRE et
al, 2002).
19
Considerações finais

Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham
funções únicas e decisivas na manutenção de ecossistemas, como componentes
fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos (KASHE; LOVLEY, 2003).
É importante ressaltar que grande parte dos avanços da biotecnologia moderna e da
agricultura é derivada das descobertas recentes nas áreas de genética, fisiologia e
metabolismo de microrganismos.
20

Estamos em plena era biotecnológica, quando os processos bioquímicos são cada vez
mais utilizados para a produção de agentes terapêuticos, produtos químicos e
biocatalisadores. O grande desafio será incorporar a informação decorrente do estudo
desses organismos extremofílicos em novas tecnologias, utilizando o enorme potencial
de suas enzimas e biomoléculas.
21

22
The more important role of archaea than bacteria in nitrification of
wastewater treatment plants in cold season despite their
numerical relationships
Kai-Ling Pan, Jing-Feng Gao, Xiao-Yan Fan, Ding-
Chang Li, Hui-Hui Dai
Fonte: Pan et al., 2018
O papel mais importante das arquea do que bactérias no
nitrificação de estações de tratamento de águas residuais
na estação fria, apesar de suas relações numéricas

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Nitrificação
INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO
O processo de nitrificãção ocorre em duas etapas:
• Oxidação da amônia em nitrito pelas arqueas oxidantes de amônia (AOA) e bactérias
oxidantes de amônia (AOB);
• Oxidação do nitrito em nitrato pelas bactérias oxidantes de nitrito (NOB).
Ainda, as bactérias de oxidação completa de amônia (comammox) convertem diretamente
a amônia em nitrato.

24
Metodologia
• qPCR em tempo real em 23 estações de tratamento de águas rediduais (ETARs);
• Incubação de DNA-SIP em 3 ETARs com diferentes relações numéricas de oxidantes de
amônia:
AOA<AOB – ETAR: W1.OD
AOA=AOB – ETAR: W8.SBR
AOA>AOB – ETAR: W23.OD
• Sequenciamento de alto rendimento e análise de rede.

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Coleta de amostra
• Lodo ativado retirado das 23 ETARs;
• Diferentes posições do tanque de aeração;
• Transporte para laboratório;
• Parte do material foi liofilizado e o restante
armazenado em 4°C até análises posteriores.
Fonte: Labconco, 2021.
Liofilizador

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Incubação DNA-SIP
• 3 ETARs com diferentes relações numéricas de oxidantes de amônia;
• Lodo ativado foi submetido a pré-incubação;
• No laboratório foram preservadas as condições in situ;
• A incubação foi feita a fim de rotular os oxidantes de amônia ativos;
• Concentrações de amônio, nitrito e nitrato;
• Monitoramento a cada 30 minutos, até o amônio ser completamente degradado;
• Microssomos são colhidos e liofilizados.

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Extração de DNA
Fonte: PR Labor, 2021.
Kit Fast DNA SPIN for soil
Fonte: GMI, 2021.
Espectrofotômetro

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Centrifugação e fracionamento gradiente
Fonte: Beckman Coulter, 2021.
Centrífuga isopícnica
Fonte: Direct Industry, 2021.
Refratômetro digital

29
Ensaio qPCR
Fonte: Agilent, 2021.
Termociclador
• Quantifica os oxidantes de amônio da
amostra;
• Detecção da fluorescência emitida por uma
molécula que aumenta à medida que a
reação avança;
• Os genes alvo de cada um dos três oxidantes
de amônia (AOA, AOB e comammox) foram
selecionados e utilizados nas reações.

30
Sequenciamento de alto rendimento
Fonte: QUIAGEN, 2021.
Kit de extração de gel
Fonte: Promega, 2021.
Fluorímetro
Fonte: Illumina, 2021.
Sequenciador

31
Fonte: Pan et al., 2018.
Ensaio qPCR: quantificação dos oxidantes de amônia
Arquea oxidante de
amônia
Bactéria oxidante de
amônia
Bactéria oxidante de amônia
completa - comammox

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Atividade de nitrificação de microssomos DNA-SIP

33
Quantificação de comunidades nitrificantes

34
Composição da comunidade de microrganismos nitrificantes ativos

35
Composição da comunidade de microrganismos nitrificantes ativos

36
Potenciais interações entre comunidades nitrificantes ativas

37
• A co-ocorrência de AOA, AOB e comammox foi confirmada em todas as ETARs na
estação fria.
• O valor de pH foi relatado como o impulsionador mais importante da estrutura da
comunidade AOA,;
• Ampla distribuição do comammox em ETARs na estação fria;
• Referente à incubação de DNA-SIP das três ETARs, o ensaio demonstrou que AOA foram
os oxidantes de amônia ativos dominantes, mesmo com a taxa de crescimento de AOA
sendo menor que AOB;
• A estação fria pode afetar as comunidades de AOA e AOB;
• A temperatura pode regular a atividade de nitrificação de
AOA e AOB, mas não sua abundância.
Conclusão

38
Melhora na produção de metano a partir da vinhaça de cana-de-açúcar com torta de
filtro em reatores UASB termofílicos, com predominância
de Methanothermobacter e Methanosarcina archaea e bactérias Thermotogae.

39
Estudo: utilizar os domínios bactérias e archaea na produção de metano, a partir da
vinhaça da cana-de-açúcar.
Objetivo: avaliar a conversão anaeróbia termofílica da vinhaça e a diversidade e
quantidade de bactérias e archaeas em reatores de manta de lodo anaeróbio
ascendente (UASB), em dois estágios, com alto ROL para obter alta produção de
metano. Realizada através da suplementação de alcalinidade e nutrientes através da
torta de filtro e recirculação do efluente.

40
Produção de bioetanol a partir da cana-de-açucar no Brasil (2015):
→ 30,2 bilhões de litros, ou 30,6% da produção mundial (Seyboth et al., 2016 , UNICA,
2016 );
1L bioetanol de cana-de-açúcar destilado →gera 10–14L de vinhaça (Ortegón et al.,
2016 );
Vinhaça da cana-de-açucar →é o resíduo pastoso e malcheiroso que resta após a
destilação fracionada do caldo de cana-de-açúcar fermentado, para a obtenção do
bioetanol (Marques, 2013);
Alto teor de matéria orgânica alto potencial energético

41
Matéria orgânica
(Vinhaça)
Bactérias
Archaeas
Fermentação
(anaeróbia)
Biogás
Metano
Dióxido de carbono
Fonte: Moraes et al., 2014.

42
• Reatores UASB alimentados pela vinhaça da cana-de-açúcar (afluente) proveniente da
destilação do etanol hidratado, coletado mensalmente de coluna de destilação;
• Torta de filtro (subproduto do processamento da cana-de-açúcar) coletado
mensalmente. Ambos coletados em Usina em Ribeirão Preto(SP);
• Lodo do inóculo (microorganismos em concentração adequada) de reator termofílico
UASB de tratamento da vinhaça de cana-de-açúcar (Usina São Martinho) localizada na
cidade de Pradopólis, estado de São Paulo;
Archaeas e Bactérias

43
• Reatores UASB em série (R1 e R2), com volumes de 12,1L (R1) e 5,6L (R2), em uma câmara
climática com tanques de armazenamento para afluente e efluente, bomba de diafragma
e gasômetros de fibra de vidro;
• Reatores de tubos de PVC, separando as fases em forma de Y, em ângulo de 45°;
• As temperaturas dos reatores afluente e UASB foram mantidas na faixa termofílica (54-56° C)
com sistema de aquecimento e controle de temperatura (equipado com termopar) instalado
em câmara climática;

44
Estimulação da atividade dos
consórcios
(bactérias e archaeas)
Suplementação da vinhaça com torta de
filtro.
Aumentou as concentrações de macro
e micronutrientes, principalmente N, P, Fe e Zn.

45
Representação esquemática
Fonte: Barros et al., 2017.

46
Coleta das amostras:
TESTES FREQUÊNCIA MÉTODO REFERÊNCIAS
Nitrogênio Kjeldhal (NK) e amoniacal (N-am) semanalmente destilação a vapor APHA (2005)
Fósforo total (P total ), K, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn e Zn semanalmente espectofotômentro de absorção atômica APHA (2005)
Sólidos totais (ST) e voláteis (VS) mensalmente Ignição a 550˚C APHA (2005)
Produção de biogás diariamente gasômetros Método 2540E
Composição do biogás quinzenalmente cromatógrafo de gás APHA (2005)

47
 PCR quantitativa (qPCR) em 340 dias →com amostras de DNA isoladas do lodo coletado de cada reator:
→ 3 amostras de R1 Pontos de coleta (P1, P2, P3 e P4)
→ 3 amostras de R2
Extrações de DNA genômico
- 0,37 mg de lodo
- armazenado a −20 ° C
Qualidade do DNA genômico
Espectrofotômetro
Nanodrop ND-1000
PowerSoil® DNA Isolation Kit
Fonte: Mobio Laboratories, 2021.
Quantidade do DNA genômico
kit Qubit® dsDNA HS Assay
Fonte:Thermo Fisher Scientific Inc., 2021.

48
Principais microrganismos identificados (Método Ion Torrent) no Lodo Gerado:
 9 filos bacterianos → os mais abundantes foram Thermotogae, Firmicutes e
Bacteroidetes.

49
Principais microrganismos identificados (Método Ion Torrent) no Lodo Gerado:
 2 filos archeas → Euryarchaeota (dominante em ambos os reatores) e Crenarchaeota.
Classe dominante → Methanobacteria → Methanothermobacter

50
Arquitetura genômica e potencial de codificação
responsável pela redução do CO2 à metano
(metanogênese a partir de H2 e CO2 ).
Methanothermobacter

51
 Razões propionato / acetato foram baixas
(0,28 - R1 e 0,25 - R2 ).
 Operação estável;
 ↑ eficiência na digestão anaeróbia;
 Aceleração da degradação do acetato e propionato
para a produção do metano.
 Nutrientes adicionados aumentaram a
atividade microbiana específica das archaeas
metanogênicas envolvidas na degradação do
propionato.

52
Quantificação dos domínios: Quantificação do domínio Archaea:
 PCR quantitativa (qPCR):

53
• A quantificação dos microrganismos indicou um equilíbrio entre os domínios Archaea e Bactéria,
favorecendo a funcionalidade dos reatores. O desequilíbrio na proporção de bactérias para
archaeas poderia afetar todo o sistema levando a uma redução na quantidade de metano
produzida (Akuzawa et al., 2011);
• A presença das bacterias Thermotogae, Firmicutes e Bacteroidetes (principais responsáveis pela
degradação de compostos orgânicos complexos), contribuíram para o consórcio entre bactéria e
archaea promovendo a estabilidade do sistema com alta produção de metano;
• As maiores concentrações de metano no biogás foram de 73% em R1 e 83% em R2 e,
consideradas satisfatórias.

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56
Referências

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