O documento descreve os principais métodos e técnicas utilizadas em microscopia de luz, incluindo a preparação de amostras biológicas para análise, como cortes seriados, coloração e montagem permanente de lâminas para observação microscópica.

1. UNIP
AULAS PRÁTICAS
BIOLOGIA semipresencial
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca
se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”.
Leonardo da Vinci

2. INTRODUÇÃO
 Apresentar o contexto no qual serão discutidas as experiências realizadas em
aula. A abordagem deverá descrever os aspectos gerais, indicando o contexto
que será trabalhado.
 Clareza, precisão de linguagem.
 Citação de referências.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Descrever os resultados por roteiros, indicando as informações relacionadas aos
aspectos analisados.
 Relacionar os achados à teoria, referenciando-os.
 Reflexão, raciocínio.
 Citação de referências.
REFERÊNCIAS
 Listagem, em ordem alfabética ou por citação no texto, das obras utilizadas.
 Seguir determinação das normas da ABNT.
ITENS RELATÓRIOAULAS PRÁTICAS

3. • NECESSIDADE DE AUMENTAR CERTOS OBJETOS - 721 A.C.
• ZACHARIAS JANSEN E SEU PAI, HANS – INSERIRAM LENTES EM UM TUBO E CONSTATARAM QUE AO OBSERVAR
UM OBJETO AO FIM DO APARATO ERA POSSÍVEL VÊ-LO DE FORMA MUITO MAIS AMPLIADA QUE EM UMA LUPA.
• ROBERT HOOKE (1665) - PULGAS E CORTIÇA – CÉLULA.
• LEEUWENHOEK (1675) – PRODUZIU SUAS LENTES - MICROSCÓPIO COM MAIOR PODER DE AMPLIAÇÃO
DESCREVER BACTÉRIAS E CÉLULAS SANGUÍNEAS (AMPLIAÇÃO DE ATÉ 280X)
• JOSEPH JACKSON LISTER (1830) - LENTES ERAM ARRANJADAS COM UMA DISTÂNCIA ADEQUADA ENTRE ELAS
ERA POSSÍVEL PROPORCIONAR UMA AMPLIAÇÃO EFICIENTE SEM DESFOCAR A IMAGEM OBTIDA.
• 1880, A RESOLUÇÃO DOS MICROSCÓPIOS CHEGOU 0,2 MICRÔMETROS
• RICHARD ZSIGMONDY (1903) -, DESENVOLVEU UM MICROSCÓPIO CAPAZ DE OBSERVAR OBJETOS ABAIXO DO
COMPRIMENTO DE ONDA DA LUZ (COM BASE NA TEORIA QUE CORRELACIONAVA A RESOLUÇÃO COM O
COMPRIMENTO DE ONDA)
• FRITS ZERNIKE (1932) - MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE - ESTUDO DE MATERIAIS TRANSPARENTES.
• ERA NECESSÁRIO NOVAS DESCOBERTAS PARA AMPLIAÇÕES MUITO MAIS ELEVADAS.
• ERNST RUSKA(1933) - PRIMEIRO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO - RESOLUÇÃO MUITO
SUPERIOR AO MICROSCÓPIO DE LUZ - UTILIZAÇÃO DE FEIXES DE ELÉTRONS E LENTES ELETROMAGNÉTICAS,
O QUE POSSIBILITAA AMPLIAÇÃO EM ATÉ UM MILHÃO DE VEZES DO OBJETO ANALISADO.
• M. KNOLL (1935) - MICROSCÓPIO DE VARREDURA
• VON ARDENNE (1938) - PRIMEIRO MICROSCÓPIO DE VARREDURA FOI CONSTRUÍDO POR QUE POSSIBILITOU A
VISUALIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS OBJETOS ANALISADOS.
• ATUALMENTE: COMPOSTOS POR DUAS OU MAIS LENTES E POSSUEM AMPLIAÇÃO DE 100 ATÉ A 1000 VEZES.
HISTÓRICO MICROSCÓPIO

4. O MICROSCÓPIO FOTÔNICO (ou ÓPTICO ou COMPOSTO)
A observação da célula ao microscópio óptico, mais corretamente denominado de
microscópio fotônico (por utilizar-se da luz como fonte de formação de imagens) ou
microscópio composto (pode ser constituído por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva
e a ocular) é feita por luz transmitida, possibilitando assim que detalhes estruturais internos
possam ser evidenciados. Contudo esta observação por transmissão de luz exige que o objeto a
ser estudado responda a certas condições. Para que a luz possa atravessá-lo, o objeto deve ser
suficientemente fino. No caso da célula, para se ter uma imagem conveniente sem grande
sobreposição de estruturas, essa espessura deve ser da ordem de 5 micrômetros (m). Como
raramente uma célula apresenta uma espessura tão pequena, faz-se fatias ou cortes da célula
para atingir a espessura desejada.
Por serem estruturas microscópicas, as células e suas estruturas são medidas com as seguintes
unidades:
• Micrômetro, que é a milésima parte do milímetro, cuja abreviatura é μm. 1m = 0,001 ou 10-3 milímetro
• Nanômetro, a milésima parte do micrômetro, abreviado por nm. 1nm = 0,000.001 ou 10-6 milímetro
• Angström, a décima parte do nanômetro, abreviado por Å.
Para exprimir dimensões celulares usamos habitualmente três unidades: micrômetro, nanômetro e angström
que aparecem no quadro a seguir:
UNIDADE SÍMBOLO VALOR USO EM CITOLOGIA
Milímetro mm 0,001 m Domínio macroscópico (vista desarmada). Células grandes
Micrômetro μm 0,001 mm Microscopia óptica. Maioria das células e organelas maiores.
Nanômetro nm 0,001 μm
Microscopia eletrônica. Organelas menores, as maiores
macromoléculas.
Angströn Å 0,1 nm Microscopia eletrônica. Moléculas e átomos.

5. TÉCNICAS PARA MICROSCOPIA DE LUZ (ÓPTICO)
Existem diversas técnicas para preparar lâminas; a escolha de uma delas depende
tanto do tipo de material que se quer estudar como o tipo de estudo que se quer fazer.
1. Esfregaço se o material que queremos estudar é constituído por células isoladas,
como é o caso do sangue, podemos simplesmente espalhar uma gota do material sobre
a lâmina de vidro. Após secar, as células são coradas. Ex. sangue e mucosa bucal
2. Esmagamento caso as células que queremos estudar serem frouxamente
associadas, como é o caso da raiz de cebola, podemos dispô-las em uma camada
única por meio do esmagamento. O material a ser estudado é previamente fixado,
corado, colocado entre uma lâmina e uma lamínula de vidro e esmagado pela pressão
do dedo polegar. Ex raiz da cebola para visualizar MITOSE.
3. Cortes quando o material que se quer estudar tem células firmemente aderidas entre
si, é necessário cortá-lo em fatias finas antes da observação microscópica. É
necessário submeter os tecidos a um tratamento que torne as células rígida o suficiente
para serem cortadas em fatias de espessura regular, finas o suficiente para uma boa
observação. Esse tratamento consiste em mergulhar o material biológico em uma
substância líquida que posteriormente endurece, servindo de suporte para o corte do
material em fatias finas (inclusão). Entre os meios ou massas de inclusão destacam-se
a parafina, as resinas plásticas, celoidina, etc. Para determinados tipos de material, que
tenham uma certa consistência, é possível fazer cortes a mão livre, com resultados
razoáveis. É o caso de alguns tipos de tecidos vegetais, como caules e folhas. Ex:
intestino, língua.
USO DE CORANTES- substâncias que absorvem certos comprimentos de onde
de luz visível e têm afinidade por determinados constituintes celulares.

6. Cortes seriados
1 - FIXAÇÃO - preservar a morfologia e a composição dos tecidos (12 a 24 horas)
Fixadores McDowell (paraformaldeído a 4% em solução de glutaraldeído a 1% em tampão fosfato
0,1 M pH 7,2 ou paraformoldeído 4% em tampão fosfato) ou Bouin (Formol comercial 100
ml;água destilada, 300,0 ml; ácido acético glacial 20,0 ml e ácido pícrico à saturação)
2 – DESIDRATAÇÃO - remove a água dos tecidos (6 a 24 horas). Álcool etílico, para retirar a
água do tecido, em concentrações crescentes até 100 % (álcool absoluto). Começa com álcool
70%; sempre colocar a solução sobre a peça; cobri-la completamente; agitar constantemente;
renovar várias vezes o álcool; usar recipientes de fundo largo e nunca aquecer o álcool.
3 - DIAFANIZAÇÃO –CHAMADA DE CLAREAMENTO, CONSISTE EM TROCAR O ÁLCOOL
QUE IMPREGNA O OBJETO DESIDRATADO POR UM SOLVENTE DE PARAFINA (XILOL,
BENZOL, TOLUOL). ESTA OPERAÇÃO TORNA O MATERIAL TRANSPARENTE
(DIAFANIZAÇÃO). Embebe a peça em substância miscível com a parafina (1-6 hs). Xilol ou toluol,
são solventes do álcool e da parafina. Não agitar o recipiente; recipiente estreitos, e preencher
pelo menos 2 cm.
4 - IMPREGNAÇÃO - EM PARAFINA, ESTA DEVE SER MANTIDA EM ESTUFA A 60ºC. A
PARAFINA PENETRA NOS VASOS, NOS ESPAÇOS INTERCELULARES E MESMO NO
INTERIOR DAS CÉLULAS, IMPREGNANDO O TECIDO E TORNANDO MAIS FÁCIL A
OBTENÇÃO DOS CORTES NO MICRÓTOMO. A parafina penetra nos espaços inter e
intracelulares (30 min). Parafina fundida entre 58 a 60oC. Nunca ultrapassar os 60oC
5 - INCLUSÃO – A PEÇA É COLOCADA EM PARAFINA FUNDIDA. A PEÇA DEVE SER
ORIENTADA, QUANDO BEM FEITO, O MATERIAL TORNA-SE PERMANENTE. CORTES DE 3-
4μm SÃO IMPOSSÍVEIS DE SEREM OBTIDOS EM TECIDOS FRESCOS OU MESMO FIXADOS,
FAZ-SE A INCLUSÃO EM RESINAS SINTÉTICAS QUE PERMITE A OBTENÇÃO EM CORTES
MAIS FINOS.

7. 6- CORTE NO MICRÓTOMO - OS BLOCOS DE PARAFINA SÃO CORTADOS COM UM
MICRÓTOMO AUTOMÁTICO QUE REGULA A ESPESSURA DOS CORTES (GERALMENTE 6-
8μm). AS FITAS FORMADAS PELOS CORTES SÃO ESTIRADAS EM ÁGUA A 40ºC E
“PESCADOS” COM UMA LÂMINA ALBUMINADA COM O AUXÍLIO DE UM PINCEL. O EXCESSO
DE ÁGUA É ESCORRIDO E OS CORTES SÃO COLOCADOS EM ESTUFA A 40ºC PARA
SECAREM. POSTERIORMENTE, A PARAFINA É RETIRADA DAS PREPARAÇÕES, BANHANDO-
SE AS LÂMINAS COM XILOL. A INCLUSÃO COM RESINA SINTÉTICA POSSIBILITA A
CONFECÇÃO DE CORTES MAIS FINOS (1-2 μm). PARA A M.E. SÃO NECESSÁRIOS CORTES
COM ESPESSURA ENTRE 0,02-0,1 μm, OS TECIDOS SÃO EMBEBIDOS EM RESINAS DURAS
E CORTADOS COM NAVALHAS DE VIDRO OU DIAMANTE. PODE-SE CONGELAR O MATERIAL
EM NITROGÊNIO LÍQUIDO E SEU CORTE POSTERIOR EM MICRÓTOMO REFRIGERADO
DENOMINADO CRIOSTATO. O CRIOSTATO É MUITO ÚTIL EM: PATOLOGIA QUANDO SE
NECESSITA DE UMA ANÁLISE IMEDIATA DE UM TECIDO; HISTOLOGIA PORQUE O
CONGELAMENTO NÃO INATIVA AS ENZIMAS E DIFICULTA A DIFUSÃO DE MOLÉCULAS
PEQUENAS E PARA ANÁLISE DE LIPÍDIOS, UMA VEZ QUE ESTES SÃO SOLÚVEIS EM
ETANOL E XILOL OU BENZOL.
Possuem avanço mecânico de até 1 m, em parafina em geral corta-se de 5 a 10 m, em resina 2
a 5 m. Navalhas de aço, vidro ou diamante (ultra micrótomos). Pode-se usar albumina para
“colar” o corte na lâmina de vidro em cortes de parafina.

8. 7- COLORAÇÃO - Antonius Mizaldus – (França) – 1567 – vacas que pastavam a planta Rubia
tinctorum produziam leite avermelhado e os ossos dos bezerros apresentavam regiões
avermelhadas. Leeuwenhoek – Açafrão (Crocus sativus), outros corantes vitais (índico, carmin,
azul de toluídina etc...). Em geral soluções aquosas ou alcóolicas.
Coloração em Parafina Mergulha-se a lâmina em soluções de xilol. Soluções decrescentes de
álcool. Cora com soluções aquosas.
Corantes
•Hematoxilina – extraída do pau-campeche (América Central) é processado (ligado ao Al+++
formando o hematoalúmen) – cor azul violeta (roxo). É um corante básico, portanto se liga a
estruturas ácidas (acidófilo), cora os núcleos.
•Eosina – cora em vermelho ou rosa, é um corante ácido, portanto basófilo, cora o citoplasma.
•Romanowsky, Giensa, Rosenfield- corantes pancrômicos – utilizados em hematologia.
•Toluidina-fuccina – efeito semelhante ao HE, só que utilizado para resina.
•Picrosírius – utilizado para corar colágeno.
8 – MONTAGEM PERMANENTE - O MATERIAL DEVE SER DIAFANIZADO PELO XILOL E
MONTADO EM UM LÍQUIDO REFRINGENTE, NORMALMENTE, BÁLSAMO DO CANADÁ O
XILOL AGE COMO DIAFANIZADOR E TAMBÉM COMO SOLVENTE DO BÁLSAMO. O XILOL E O
BÁLSAMO NÃO SÃO MISCÍVEIS EM ÁGUA, PORTANTO, O MATERIAL DEVE SER
DESIDRATADO. COLOCAR O MATERIAL ENTRE A LÂMINA E A LAMÍNULA E O LÍQUIDO
REFRINGENTE QUE SERVIRÁ DE MEIO DE CONSERVAÇÃO E OBSERVAÇÃO. O MEIO DE
MONTAGEM DEVE TER ÍNDICE DE REFRAÇÃO PRÓXIMO AO DO VIDRO, DEVE SECAR
RAPIDAMENTE, NÃO RACHAR, NEM SE ALTERAR.
DESCALCIFICAÇÃO
Em caso de dificuldade para cortar o material, os tecidos fixados poderão ser descalcificados por
dia a 4oC na mesma solução utilizada para fixação adicionada de 0,1 M de EDTA, antes de ser
incluído em resina histológica para microscopia de luz ou eletrônica de transmissão.

9. 1- Ocular
2- Objetivas e revólver
3- Platina
4- Charriot
5- Macrométrico
6- Micrométrico
7- Diafragma no condensador
8- Condensador
9- Parafuso da altura do condensador
10- Dois parafusos centralizadores do
condensador (NÃO MECHER)
11- Fonte de luz
12- Controle de iluminação
A objetiva 100x é usada com óleo de cedro cujo índice de refração é maior que a do ar e permite
maior aproveitamento dos raios luminosos que incidem sobre o objeto.
O cálculo do aumento (ampliação) da imagem é obtido multiplicando-se o aumento da objetiva
(vem gravado na mesma) pelo aumento da ocular (também gravado). Exemplo: utilizando-se uma
objetiva de 40x e uma ocular de 10x, a imagem observada está aumentada 400x.
Cada microscópio possui três
objetivas chamadas secas - de
pequeno aumento (4x), médio
aumento (10x) e grande aumento
(40x) e uma objetiva denominada de
imersão (100x).
AULA 1 ROTEIRO 1 - Título da Aula: Introdução ao microscópio óptico.
OBJETIVO Aprendizado sobre os componentes do microscópio e sua função. Realização do
esfregaço bucal, coloração e visualização na microscopia.

10. AULA 1- ROTEIRO 2 -Título da Aula: Célula Procariótica: bactérias do iogurte
OBJETIVO: Conhecer a morfologia de procariotos e sua organização.

11. MORFOLOGIA BACTERIANA
Bactérias do Iogurte:
estreptoco
cos
bacilos

12. BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS E GRAM
NEGATIVAS
GRAM
NEGATIVA
GRAM
POSITIVA
Membrana
Externa
Peptideoglicano
Membrana
plasmática
Membrana
plasmática
Peptideoglicano

13. COLORAÇÃO DE GRAM
1 . Com uma lâmina seca e já fixa com a
suspensão bacteriana do iogurte,
adiciona-se sobre a lâmina o Cristal
Violeta e deixa agir por 1 minuto. Após o
tempo retira o excesso do corante
lavando com uma fina tira de água.
2. Após lavar, adiciona-se sobre a lâmina
o Lugol e deixa agir por mais 1 minuto.
Novamente retira o excesso lavando
com uma fina tira de água.
3. Agora adiciona-se o álcool-acetona e
deixa agir por 10 a 20 segundos e
posteriormente lava com a água para
retirar o excesso.
4. O último passo é deixar agir sobre a
lâmina a Fucsina ou Safranina por
aproximadamente 20 a 30 segundos.
Depois é só lavar e secar com papel
absorvente ou se preferir deixar secar
naturalmente. Após a secagem a lâmina
já está pronta para a microscopia.

14. AULA 2 - ROTEIRO 1 - Título da Aula: Permeabilidade de membrana plasmática
OSMOSE
Passagem de água do
meio menos concentrado
(hipotônico) para o mais
concentrado (hipertônico) .
SOLUÇÃO HIPOTÔNICA -
CÉLULAS AUMENTAM DE
VOLUME devido à
penetração de água. Se o
volume for muito
acentuado, a membrana
plasmática se rompe e o
conteúdo da célula
extravasa, fenômeno
conhecido como lise
celular HEMOLISE, ex: o
eritrócito.
SOLUÇÃO HIPERTÔNICA
- CÉLULAS DIMINUEM DE
VOLUME devido à saída
de água.
Nas soluções isotônicas,
o volume e a forma da
célula não se alteram.
Meio hipertônico, isotônico e hipotônico
OBJETIVOS: - Praticar a utilização de um microscópio óptico.
- Observar as mudanças que ocorrem na morfologia de eritrócitos.
- Identificar quais são as soluções hipotônica, isotônica e
hipertônica.
Correlacionar os resultados com as propriedades funcionais das
membranas celulares.

15. AULA 2- ROTEIRO 1 – Título da Aula: Microscopia de pele humana
OBJETIVOS: - Visualizar a morfologia da epiderme humana.
- Visualizar a morfologia da derme humana.
- Correlacionar as estruturas observadas com as características dos tecidos
epitelial e conjuntivo.

17. 1. Tecido Epitelial
Estratificado Pavimentoso
Queratinizado
2. Tecido Conjuntivo Frouxo
3. Glândula Sebácea
4. Glândula Sudorípara
5. Tecido Conjuntivo Denso
Não Modelado
6. Tecido Adiposo

18. 1. Tecido Epitelial Estratificado Pavimentoso Queratinizado
2. Glândula Sebácea
3. Tecido Conjuntivo Frouxo
4. Glândula Sudorípara
5 e 6. Folículo Piloso
7. Tecido Conjuntivo Denso
Não Modelado
8. Tecido Adiposo

20. AULA 3 - ROTEIRO 2 - Título da Aula: Microscopia do tecido muscular
OBJETIVO: Visualização a morfologia músculo liso. Intestino

22. AULA 3 - ROTEIRO 2 - Título da Aula: Microscopia do tecido muscular
OBJETIVO: Visualização a morfologia músculo estriado esquelético. Lâminas de língua:

24. AULA 3 - ROTEIRO 2 - Título da Aula: Microscopia do tecido muscular
OBJETIVO: Visualização a morfologia músculo cardíaco. Coração

25. AULA 3 - ROTEIRO 3 - Título da Aula: Citoesqueleto- Cílios e flagelos
OBJETIVO: Visualização da lâmina de traqueia para visualizar dos cílios
Traqueia
Aumento final 1000X
1. Tecido Epitelial
Pseudoestratificado
2. Glândula caliciforme
(unicelular)
3. Cílios
Tecido Epitelial Pseudoestratificado
Tecido
cartilaginoso

26. A traqueia é um tubo flexível cuja parede é formada por três túnicas: mucosa,
submucosa e adventícia. A mucosa é constituída de epitélio pseudo-estratificado
cilíndrico ciliado (1) com células caliciformes (epitélio respiratório) apoiada sobre
uma lâmina própria constituída de tecido conjuntivo frouxo rico em fibras elásticas.
Logo abaixo, observa-se a região submucosa, formada por tecido conjuntivo
frouxo (2) e que apresenta glândulas túbulo-acinosas mistas (glândulas
seromucosas, seta) cujos ductos se abrem na luz traqueal. Após a submucosa
encontra-se o anel de cartilagem hialina (3). Externamente a traqueia é revestida por
tecido conjuntivo frouxo, formando a camada adventícia, que liga o órgão aos
tecidos vizinhos.
1

27. AULA 3 - ROTEIRO 3 - Título da Aula: Citoesqueleto- Cílios e flagelos
OBJETIVO: Visualização no testículo os flagelos dos espermatozoides na luz dos túbulos
seminíferos.

30. AULA 4 - ROTEIRO 1 – divisão celular e cromossomos
OBJETIVOS: - Visualizar os cromossomos.
- Visualizar as fases da mitose.

31. 1- interfase. MITOSE 2-prófase 3-metáfase 4- anáfase 5- telófase

34. AULA 4 - ROTEIRO 2 - Título da Aula: Estudo da cromatina sexual (AULA TEÓRICA GENÉTICA)
OBJETIVOS: - Visualizar a cromatina sexual em indivíduos dos gêneros feminino e masculino.
- Identificar os corpúsculos de Barr em indivíduos do gênero feminino.
- Correlacionar o seu achado com o seu significado biológico.

35. Existem duas considerações a serem feitas:
1. Os indivíduos do sexo masculino apresentam apenas um cromossomo X e,
portanto, diz-se que são hemizigotos em relação aos genes ligados ao X, em vez de
homo ou heterozigoto; os homens 46,XY jamais serão heterozigotos para os
caracteres ligados ao X.
2. Para compensar o complemento duplo de genes ligados ao X nas mulheres, em
oposição ao componente único nos homens, os alelos em apenas um dos dois
cromossomos X são expressados em qualquer célula feminina, ao passo que ambos
os alelos de qualquer lócus autossômico são ativos (compensação de dose em
mamíferos: hipótese de Lyon – cromatina sexual ou corpúsculo de Barr). Ex.
pelagem malhada preto e amarelo nas fêmeas de gatos e pelagem preta ou amarela
nos machos.
A inativação de um cromossomo X explica porque a quantidade de produto dos
genes localizados no cromossomo X é a mesma em machos e fêmeas, apesar da
diferença de dose gênica (o macho com um só X e a fêmea com dois).