Processos microbianos como insumos biológicos para agricultura sustentável

Processos microbianosProcessos microbianos
como insumos biológicoscomo insumos biológicos
para a agriculturapara a agricultura
sustentávelsustentável
Fabio L.Fabio L. OlivaresOlivares && Luciano P.Luciano P. CanellasCanellas
NúcleoNúcleo de Desenvolvimento de Insumos Biológicos parade Desenvolvimento de Insumos Biológicos para
a Agricultura (NUDIBA/UENF).a Agricultura (NUDIBA/UENF).

Teoria populacional malthusiana (Thomas Malthus: 1766 -1834)
An Essay on the Principle of Population (1798))

Revolução verde
(Ciclo de inovações tecnológicas para a agricultura)
Norman Ernest Borlaug, Nobel Paz 1970

Síntese de Haber-Bosch (amoníaco)
N2 (g) + 3 H2 (g) 2 NH3 (g) + energia
É uma reação catalisada com o ferro, sob as condições de 250
atmosferas de pressão e uma temperatura de 450 °C.
Para a produção da amônia, o nitrogênio é obtido do ar atmosférico, e o hidrogénio como resultado da
reação entre a água e o gás natural:CH (g) + H O (g) → CO (g)+ 3 H (g)
Aparelho de laboratório utilizado por Fritz
Haber para sintetizar a amônia em 1909.
Fotografia tirada em julho de 2009 no Museu
Judaico de Berlim. Nobel, 1918
reação entre a água e o gás natural:CH4 (g) + H2O (g) → CO (g)+ 3 H2 (g)

N –demanda
Custos
(Eficiência uso)
Aplicação:
Cada 100 unid:
< 50 unid –
planta
Destinos
Impac.
Ecológicos

Desafios para Agricultura Mundial
• Demandas para alta produção de alimentos sob uma perspectiva
ambiental e economicamente sustentável;
• INCT-FBN (Segurança alimentar para os próximos 50 anos) requer
avanços tecnológicos comparáveis a revolução verde;
• Mudanças climáticas globais x Impactos da agricultura
• Inovação científica e tecnológica para produção baseada em novos
modelos;
• Incremento da participação de insumos biológicos.

•• ““A construção de modelos de produção sustentável
é colocada como marco central para agricultura do
século XXI, nesta direção microrganismos, seus
processos e produtos são os elementos essenciais
para mudança dos paradigmas de produção
agrícola e os ingredientes mais preciosos do “boom
tecnológico” que esta por vir”.
agrícola e os ingredientes mais preciosos do “boom
tecnológico” que esta por vir”.

Processos
Microbianos
Biofertilizante Bioestimulante Biocontrole
Bioproteção
BiofármacosBiofertilizante Bioestimulante Biocontrole
Bioproteção
(abióticos)
Biofármacos

Estratégias para melhor aproveitamento de microrganismoEstratégias para melhor aproveitamento de microrganismo
a favor da produção vegetala favor da produção vegetal
Promoção do
Crescimento
Vegetal
Ativação de
comunidades
microbianas nativas
pelo manejo solo-
planta-ambiente
Inoculação de
microrganismos
selecionados

Biotecnologia deBiotecnologia de
InoculantesInoculantes

PLANTA
Propostas baseadas na combinação de:Propostas baseadas na combinação de:
((a)a) Bactérias promotoras do crescimento vegetal;Bactérias promotoras do crescimento vegetal;
((b)b) Matéria orgânica e suas subMatéria orgânica e suas sub--frações ;frações ;
PROCESSOS
MICROBIANOS
MATÉRIA
ORGÂNICA
•• InoculantesInoculantes
•• Substratos para plantasSubstratos para plantas
•• BiofertilizantesBiofertilizantes
•• BioestimulantesBioestimulantes
•• Fertilizantes organomineraisFertilizantes organominerais

10,00 C-labile added
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
15 20 25 30 35 40 45Log10nºcells
/gsoil SOM (g/m3)

BiofertilizanteBiofertilizante: Uso combinado de ácidos: Uso combinado de ácidos
húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.
Humic Acid Diazotrophic bacteria

húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.
Estudos BásicosEstudos Básicos

• Traditional view: Macropolymer (10-
500 KDa). “Monomers” (linear and
ramified chain assembled by covalent
bounds)
Humic acid: background
• Piccolo (2002) pointed that HS are more appropriated described as
Supramolecular self-association of small heterogeneous molecules stabilized by
weak bounds that can be disrupted adding small amount of organic acid.

CH3COOH
• Humic aggregate can be disrupted and its components released
in nanometric scale, which constitute the bases for ratio structure
and biological activity.

Root exudatesRoot exudates
disassemble thedisassemble the
Ácidos OrgânicosÁcidos Orgânicos
disassemble thedisassemble the
apparent complicatedapparent complicated
structure of HAstructure of HA

Estimulação da HEstimulação da H++--ATPaseATPase da membrama plasmáticada membrama plasmática
(Marcador bioquímico da bioestimulação)(Marcador bioquímico da bioestimulação)
b
ab ab
a
0
2
4
6
8
10
12
Control AHfp Bacteria AHfp+bacteria
treatments
molofPi(mgofptn)-1
(min)-1
•• ChangesChanges atat rootroot
architecturearchitecture
•• UptakeUptake ofof nutrientsnutrients
•• WaterWater contentscontents
*Média ± erro padrão da média; médias seguidas de letras diferentes na coluna são estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey (p<0,05).
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
44 ±4,6 (B)28 ±15,1 (B)0,0297 ±0,0024(A)957(A)0,096(AB)269 ± 14 (A)264 ±11 (A)Bac.+AHtf
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
118 ±6,1(A)58 ±2,73 (A)0,0245 ±0,0027(B)823(AB)0,101(A)179 ± 09(B)220 ± 23 (B)Bactéria
15 ±8,5 (B)16 ±2,17 (B)0,0182 ±0,0016(C)607(B)0,060(B)100 ± 10 (C)100 ± 09 (C)*Controle
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes
emergidas
Sítios de
mitose
Massa seca da raiz
Comprinento
específico
Área
específica
Comprimento
radicular
Área radicularTratamento
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes
emergidas
Sítios de
mitose
Massa seca da raiz
Comprinento
específico
Área
específica
Comprimento
radicular
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes
emergidas
Sítios de
mitose
Massa seca da raiz
Comprinento
específico
Área
específica
Comprimento
radicular
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes
emergidas
Sítios de
mitose
Massa seca da raiz
Comprinento
específico
Área
específica
Comprimento
radicular

Crescimento ÁcidoCrescimento Ácido
Auxinas
Poliaminas
Outros
Transportadores

Alterações anatômicas sobre o sistema radicularAlterações anatômicas sobre o sistema radicular

Ácidos Húmicos Sim Não
Fonte de C
Fonte de N
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 7 14 21 28
Dias após a inoculação
Logcélulas.gsolo-1
0 4 40 400
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 7 14 21 28
Dias após a inoculação
Logcélulas.gsolo-1
0 4 40 400
Após 4 semanas
H. seropedicaeH. seropedicae AHAH
Inibição da FBN*
* Contents higher than 400 mg AH.
l-1
SobrevivênciaSobrevivência no solono solo

A aplicação de ácidos húmicos aumenta a população
microbiana associada a planta
Zea mays (n = 16)
• 84%
•População nativa
Outras culturas
•Tomate, maracuja, mamão, cana-de-
• Incremento Populacional;
• Estabelecimento >
• Atividade > ?
AHv vermicompost; AHf filterAHv vermicompost; AHf filter
cake, HAi: inceptsol; HAo: oxisol; Hal:cake, HAi: inceptsol; HAo: oxisol; Hal:
litosol.litosol.
•Tomate, maracuja, mamão, cana-de-
açúcar
• Abacaxi (exceção)
Evidencias microscópicas
•SEM
•Epifluorescence linked with Gfp
• Persistência > ?
• Resposta amplificada
• Depende da fonte

BACTERIABACTERIA BACTERIA + HABACTERIA + HA
C applied in
solution (mg)
% C removed
solution (root)
4 100
40 100
120 88
200 71
400 69

Ácidos Húmicos como indutores de biofilmes
Células
Isoladas
Agregados microbianos Biofilmes
microbianos

Estabelecimento endofítico aumentadoEstabelecimento endofítico aumentado
Infecção atravês deInfecção atravês de
raízesraízes

WAYS OF INFECTIONWAYS OF INFECTION
How Humic acid modulateHow Humic acid modulate
pplantlant--bacteria interaction ?bacteria interaction ?CHEMOTAXYSCHEMOTAXYS
ATTACHMENTATTACHMENT
(SINGLE CELL WITH(SINGLE CELL WITH
APOLAR ATTACHMENT)APOLAR ATTACHMENT)
Canellas et al., 2008
Canellas & Olivares, 2014
Increase
efflux of C-
sources in
rhizosphere
Increase
points of
lateral root
numbers
WAYS OF INFECTIONWAYS OF INFECTION
ENDOPHYTIC COLONISATIONENDOPHYTIC COLONISATION
((AGREGATES TOAGREGATES TO
BIOFILM)BIOFILM)
Canellas et al., 2008
Enhanced
Establishmen
t of
Endophytic
population
Increase
attachment by
HA sorption in
cell wall and
bacteria
Chemotaxis &
Rhizosphere
establishment
Root attachment: single
cell to biofilm structure
Root Infection
(endophytic access)
Tissue Colonisation
(apoplastic
compartment)
Successful (?)
Endophytic
Interaction
Predominant Events

• Favorece agregação
na superfície das
raízes.
• Quando pulverizado
na parte aérea exerce
Daniele Frade -IC
na parte aérea exerce
efeito protetor.
•UV
•Dessecação

húmicos e bactérias diazotróficashúmicos e bactérias diazotróficas
endofíticasendofíticas..
Aplicações

Uso combinado de AH e bactérias diazotróficas
em mudas micropropagadas de cana-de-
açúcar.
Casa de vegetaçãoCasa de vegetação
InIn vitrovitro
CampoCampo

Fase de Aclimatação das mudasFase de Aclimatação das mudas
micropropagadasmicropropagadas em viveiroem viveiro
Controle Bactéria AH
Uso combinado
BacAH

Experimentos de campo: plantas micropropagadasExperimentos de campo: plantas micropropagadas
inoculadasinoculadas
Contro
l
BACAH32
% 10
% n.s.
control
AH
0
20
40
60
80
100
BRIX FIBRA POL PCC PUR
Características
agroindustriais (g/Kg)
Produção de colomos
(Mg/ha)

A B C
Transplante das mudas micropropagadas para o campo experimental
A
D
B C
E
D E
D E
Figura 12. Visão parcial do ensaio de campo: pesagem do vermicomposto (A), distribuição do vermicomposto nas linhas de
plantio (B), mudas micropropagadas (C), plantio no campo (D), plantas micropropagadas após 10 meses do plantio (E).

Produção de Sacarose (kg/m2)
C
B
AB A
0
50
100
150
200
Produção de Sacarose (kg/m2)
Série1 145 167 186 194
Controle Bacteria AH BACAH

150
200
250
300
36,89
A
31,64
AB
29,21
B 28,73
B
TCH TPH
0
50
100
150
BACAH
BAC
Control
AH
221,15
A 183,31
AB
179,46
B 168,54
B
Tukey 5%
Mg/ha
23 -30%

Produção de grãos milho (Mg /ha)

B
A
AB
AB
b
a
b
a
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Controle Bac AH Bac + AH
Tukey 5%
Kgha-1
Com N Sem N

Efeito da época de aplicação foliar dos tratamentos: i) ácidos húmicos extraídos
de vermicomposto (20 mg C L-1); ii) bactérias diazotróficas; iii) ácidos húmicos +de vermicomposto (20 mg C L ); ii) bactérias diazotróficas; iii) ácidos húmicos +
bactérias e iv) controle, sobre a produtividade do milho DKB 789.
ÉPOCAº Produtividade agrícola média
Mg ha-1
8 folhas 3474 A
4 + 8 folhas 3447 A
4 folhas 2941 B
CV (%) 19,87
F 10,28*
N 16
DMS 328
médias seguidas por letras diferentes nas colunas são estatisticamente diferentes pelo teste Tukey (P<0,01);
ºaplicação foliar realizada com equipamento costal pressurizado.
1composição do inoculo bacteriano: Herbaspirilum seropedicae estirpe HIII 206

Vermicomposto como veículoVermicomposto como veículo
microbianomicrobiano

Vermicomposto/ácidos húmicosVermicomposto/ácidos húmicos
(bioestimulação)(bioestimulação)
• Caracterização molecular dos compostos orgânicos presentes nos VC foi
realizada com a técnica da pirólise off-line acoplada à espectrometria de
massas;
• Foram identificados mais de 300 compostos principalmente os derivados de
ligninas, de carboidratos, de proteínas, ácidos e alcoóis graxos, compostos
terpênicos e hidrocarbonetos;
Dariellys Balmori, DSc
terpênicos e hidrocarbonetos;
• O conhecimento da composição molecular da matéria orgânica estabilizada
pela vermicompostagem é fundamental para o aprimoramento desses
processos biotecnológicos.

Vermicomposto/ácidosVermicomposto/ácidos
húmicos (bioestimulação)húmicos (bioestimulação)
Dariellys Balmori, DSc
• Compostos nitrogenados
• Compostos derivados de
ligninas
• Ésteres metílicos de ácidos
graxo
• Alcoóis e epóxidos
• Compostos terpênicos
• Hidrocarbonetos
• 900 compostos identificados

Enriquecimento biológico de
vermicomposto estabilizado
• Culturáveis e não culturáveis
• Fases de maturação
• Combinação de resíduos
• Seleção, compatibilidade

Enriquecimento biológico de vermicomposto estabilizado
Microrganismo Alóctone
• Azotobacter chrococcum
• Azospirillum lipoferum
• Incremento de N & P;
• Incremento de P na
presença de rocha;• Azospirillum lipoferum
• Pseudomonas striata
• 0,2% (m/m)
presença de rocha;
• P-nativo & P-adicionado;
• Incremento populacional

Fortificação de
composto &
vermicomposto
Vermicomposto
como veículo
microbiano

EEnriquecimento Biológiconriquecimento Biológico
de Substratosde Substratos

Enriquecimento Biológico de SubstratosEnriquecimento Biológico de Substratos --
PressupostosPressupostos
Ativação Biológica de Substratos Agrícolas
(Processos microbianos: FBN vida-
livre, solubilização de rochas, compostos
bioativos)
Microrganismos Matéria Orgânica e condicionantes abióticos
Fonte de Carbono (lábil ou recalcitrante?)
Ativação seletiva de grupos microbianos
introduzidos
bioativos)
Bioaumentação (Inoculação de
microrganismos)
Introduzir quem no substrato ?
Empirismo?
Cooperação Metabólica e Sucessão
Microbiana...
Imposição de Vantagens seletivas
• Biorreatores (FBN, rocha fosfatada...)
• Indutores de Biofilme
• Substâncias Húmicas
Construção de nichos microbianos
(sobrevivência, atividade e competitividade)

Enriquecimento Biológico de SubstratosEnriquecimento Biológico de Substratos –– Desenho OperacionalDesenho Operacional
Quem ?
Fungos Actinobactéria
s
Bactéria
s

(continuação)(continuação)Bioprospecção com base na composição do substrato e biorreatores
Composto e VermicompostoSerrapilheira: Ciclagem
Rizosfera/Rizoplano Planta-específico

(continuação)(continuação)Passos para seleção de combinações – in vitro
Características Promoção do Crescimento Vegetal: isolados e em
combinação: sinergias de atividade

(continuação)(continuação)Estudos de compatibilidade microbiana
4
5
6
7
Log10UFC/mL
b b
Fungos compatíveis: Taxa de sobrevivência, aumento da
atividade? Maximização da PCV pela bactéria?
0
1
2
3
Controle Isolado 467 Isolado 476
Log10UFC/mL

Inoculantes microbianos mistosInoculantes microbianos mistos –– bactériabactéria--plantaplanta
HIFA FÚNGICA

4
5
6
7
8
9
log10cell/gfolha
Sobrevivencia de H.seropedicae em folhas de
milho
Inoculantes microbianos mistosInoculantes microbianos mistos –– bactériabactéria--plantaplanta
100
120
140
160
180
200nmoles/frasco/h
Atividade Diazotrófica da bactéria
1 7 14 21 28 56
Bac 8,2 5,4 4,2 3,4 2,2 0
Bac+Fungo 8,2 6,8 5,8 5 3,2 2,5
0
1
2
3
4
log10cell/gfolha
0
20
40
60
80
100
24 48 60 72
nmoles/frasco/h
Horas
B B+F
Aguiar, DSc Thesis

Jucimara
Anunciação –
MSc/DSc
Actinobactérias degradam ácidos húmicos e
suportam populações de bactérias diazotróficas:
Biomacromoléculas poliméricas (amido, celulose) e
Supramoléculas (matéria orgânica estabilizada)
• Streptomyces estirpes AC1, AC4 e AC5
são capazes de utilizer ácidos húmicos
como fonte exclusive de carbono;
• Non-limited to specific molecules ;
• Biodegradation of aromatic , sulfonated
, polysaccharides and carboxylic domains.

100 100
116
206
Conteudo de N e P (%) em
vermicomposto maturado
VC VC+BAC
100 100
N P

Tomate Industrial: Enriquecimento de Substrato/Spray
FoliarVCi Vci+FA
C+FAC
Plantlets and tomato fruit yields
(70% increase)

+ 55 22
27397198
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