CONFOCAL MICROSCOPY

1. CONFOCAL MICROSCOPY
Docente solicitante: Prof. Thiago Araújo Simões
Data da apresentação:

2. 1. O que faz?
■ A microscopia confocal permite a obtenção de
imagens de alta resolução através de cortes
ópticos, posteriormente agrupados para se
fazer a reconstrução tridimensional da
topografia de objetos complexos.
■ Foi desenvolvido primeiramente por Marvin
Minsky, em 1955 e patenteada em 1957.
■ Esta técnica possui diversas aplicabilidades na
ciência, principalmente na obtenção de
imagens de amostras vivas e de informação
computadorizada tridimensional na pesquisa
biológica, na análise química e de materiais.
Fonte da
imagem: http://www.nikoninstruments.com/pr_BR

3. IMAGEM 1 IMAGEM 2 IMAGEM 3

4. 2. Tipos de amostras?
■ Na Microscopia Confocal as amostras podem ser: organismos vivos, culturas celulares,
amostras fixadas, materiais inorgânicos, além de nano-cristal, sendo as técnicas adequadas
ao tipo de amostra e procedimento.
■ microscópios confocais de varredura a laser: Esse processo geralmente é lento e não
funciona para imagens ao vivo, mas pode ser útil para criar imagens representativas de alta
resolução de AMOSTRAS FIXAS .
■ microscópios confocais de disco giratório: Possui menor energia de excitação o que reduz
a fototoxicidade e o fotobranqueamento de uma amostra, muitas vezes tornando-a o sistema
preferido para a geração de imagens de CÉLULAS OU ORGANISMOS VIVOS.
■ microscópios confocais de disco giratório duplo: funcionam sob os mesmos princípios do
anterior, exceto a inclusão de um segundo disco giratório contendo microlentes, que o torna
mais sensível que o anterior para captação de IMAGENS VIVAS.
■ microscópios de matriz programável: usam um modulador de luz espacial controlado
eletronicamente que produz um conjunto de orifícios em movimento. Muito bom para
amostras dinâmicas.

5. 2. Tipos de amostras?
■ As amostras podem ser espessas, e ainda assim é possível obter imagens de seus planos
específicos sem a necessidade de submeter a amostra a processamentos de fatiamento. Esta
característica viabiliza ainda a observação de amostras vivas.
■ As amostras biológicas são frequentemente tratadas com tintas fluorescentes para tornar
visíveis os objetos selecionados.
■ Antes de usar o microscópio a amostra deve passar por uma preparação, no caso da
microscopia confocal, os protocolos para a preparação de amostras fixadas são
relativamente simples e reprodutíveis.
■ Uma vez prontas as amostras, o material é levado ao microscópio confocal. No instrumento,
inicialmente se focaliza a amostra ao microscópio com a objetiva adequada, escolhe-se o
campo a ser observado e inicia-se a aquisição de imagens.

6. Microscópio confocal
(FONTE: MINSKY, 1988 apud OLIVEIRA, 2012)
Microscópio convencional
3. Princípios de Funcionamento

7. 4. Limitações
■ Cada uma dessas classes de microscópio confocal tem vantagens e limitações
particulares. Mas podemos destacar algumas:
1. Os equipamentos geralmente possuem um custo elevado, quando comparado a
microscopia convencional, que acaba por limitar a sua aquisição por laboratórios de
pequeno porte.
2. Apresenta um número limitado de comprimentos de onda de excitação disponíveis para os
sistemas de iluminação a laser, sendo que alguns equipamentos apresentam um mínimo de
combinações de comprimento de onda de excitação que limita bastante o seu uso.
3. A intensidade da emissão de laser promove danos fotoquímicos nos marcadores
fluorescentes acelerando o seu decaimento.
4. Os microscópios de disco giratórios e o de matriz programável usam uma densidade de
amostragem fixa, limitada, que é definida pela resolução da câmera.