Pos Usp Aula Biomol Dna Rna Prot Genomica Parte1

Fundamentos de Biologia
Molecular, métodos
avançados e ferramentas
aplicativas a Botânica

Objetivos do Curso

 Métodos avançados em biologia
molecular, com aprofundamento do
conhecimento para abordagens
pessoais em biomol, com viés
aplicativo a sua própria pesquisa.

Roberta A. Campos PhD. March 2012 2

Qualificação

 Bióloga: Bacharel & Licenciada – RGS (2001)

 MSc Biotecnologia (UCS e UFRGS) - (2001-2003)

 DTI 7G: Projeto Genoma Sul – Micoplasma – RGS (2004)

 PhD Biofísica (UFRJ) - Heat Schock Protein – RJ (2005-2009)

 PD IQUSP: Projeto BIOEN – Genoma Cana – SP (2009-2011)

 PD Petrobras – Projeto: Transcriptoma Araucaria (2011-2012)


DNA – Introdução

O carreador da Informação Genética


Os diferentes alfabetos


Componentes
dos Ácidos
Nucléicos

BASES
NITROGENADAS


DNA - Polímero de desoxribonucleotídeos


Anti-paralelismo do DNA


DNA


RNA


Modelo de
Replicação do DNA
Watson e Crick

propuseram mais do que isto ...

… Eles propuseram:

Dogma Central de BIOMOL


Dogma Central de BIOMOL


•DNA macromolécula inerte, ou
seja, não tem atividade catalítica. É
apenas reservatório da informação
genética. (Genótipo).

•Proteínas macromoléculas
catalíticas efetoras da mensagem
genética, ou seja, traduzem a
informação genética em uma
função. (Fenótipo).

•RNA macromoléculas que faz
a intermediação da linguagem de
nucleotídeos para aminoácidos..
Possui atividade catalítica.


Fluxo da informação gênica


Replicação Semi-
conservativa do DNA


COMPACTAÇÃO DO DNA EM NUCLEOSOMAS


DNA - COMPACTAÇÃO


DNA Diferentes Níveis
de Compactação da
Cromatina


Síntese de DNA

Mecanismo Enzimático da Replicação

Uma das unidades
PRECURSORA
do RNA
Ribonucleotídeo
trifosfatado


Como
duplica?

Replicação
do DNA


DNA - Incorporação do primeiro
d-XTP ao primer de RNA


DNA - Hidrólise do trifosfato e adição do
primeiro d-XTP


Forquilhas de
Replicação

Bi-direcional do DNA


A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ
OCORRE NO SENTIDO

5’ 3’

E COMO AS FITAS SÃO
ANTI-PARALELAS

ENTÃO ...

DNA - Forças de Torção Criadas
pela Abertura da Dupla Hélice


A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ OCORRE NO SENTIDO

5’ 3’
E COMO AS FITAS SÃO ANTI-PARALELAS ENTÃO ...


Forquilha de Replicação
Simplificada


DNA - Remoção dos
Primers de RNA e
Fechamento dos Nicks


Proteinas estabilizadoras de DNA
simples fita (SSB Proteins)


Complexo de Replicação Completo


DNA Ligase

Estabelece a ligação
fosfodiester após a remoção
dos primers de RNA


Origem (Iniciação) de Replicação do DNA


DNA

Topoisomerase I

Relaxamento das Forças
de Torção pela


Atividade
(exonucleásica 3-5)
de Correção de Erros
das DNAs
Polimerases


Síntese de RNA

Transcrição

Transcrição do DNA


Síntese de RNA

RNAs polimerases I, II e III

(Somente 5’ 3’)

Precursores de RNA


O Promotor SEMPRE esta no comando!

Sequências de reconhecimento das RNA polimerases


Ambas as fitas do DNA podem ser transcritas


Em EUCARIOTOS

A sequência dos genes/exons é
interrompida por introns


Síntese do Transcrito Primário do mRNA


TRADUÇÃO
(Somente sentido 5’ 3’)

Síntese de Proteínas

Tradução do mRNA


t-RNA, O adaptador das Linguagens


O Código
Genético


Quadros de Leitura
ORFs (open-reading frames) & Codons do mRNA


Quadros de diferentes Leituras (ORFs)
Pode resultar em aminoácidos diferentes,
proteínas diferente, polimorfismos gênicos ou
mutação genéticas.
Ex.: doenças metabolismo inato.


Superposição de quadros de leitura
(frames)


oAlterações da “frame” por mutações


Estrutura do tRNA e anti-codon


Iniciação da
Síntese de
Proteínas


Sinais de Reconhecimento da Iniciação


Alongamento
da Síntese de
Proteínas


Translocação do
Ribosoma


Terminação da
Síntese de
Proteínas


Transcrição e Tradução Simultânea


Controle da Expressão Gênica

Etapas do Controle da Expressão Gênica


Síntese do Transcrito Primário do mRNA

mRNA Maduro


Elementos Básicos de Região
Promotora da Transcrição no DNA


PTN Estrutura
 Primária ou nível
primário

 Secundária ou nível
secundário ou helicoidal

 Terciária ou nível
terciário

 Quaternária ou nível
quaternário


PTN Estrutura
Estrutura Primária ou Nível Primário
É a seqüência em número de aminoácidos (cadeia peptídica). A ligação
estabilizante é a ligação peptídica (covalente). Se imaginarmos os
aminoácidos representados por letras: A, B, C, D, ... teremos uma
esquematização da estrutura primária de uma proteína:

A–B–C–D–A–E
É importante salientar que o número de aminoácidos determina o número de
proteínas. Uma variação na seqüência conduz a uma proteína diferente e com
ação bioquímica diferente. Ex: a ocitocina e a vasopressina diferem entre si na
seqüência de apenas dois aa; a ocitocina provoca as contrações uterinas e a
vasopressina provoca aumento da pressão sangüínea.


PTN Estrutura
Estrutura secundária ou nível secundário (helicoidal)
É o enrolamento da estrutura primária em torno de um eixo imaginário, originando
uma hélice chamada de  hélice. Assim, esta estrutura está relacionada com a
disposição espacial das estruturas primárias, e pode ser em forma de um  hélice ou
uma folha pregueada.


PTN Estrutura - Estabilidade
 Ligação ou Ponte de Hidrogênio: formada pela interação ou atração
entre: - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo amina
de outro/ - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo
carboxila de outro.
 Ligação Iônica: formada pela atração entre as cadeias laterais dos
AA ácidos e AA básicos.
 Ligação hidrófoba ou apolar: formada pela interação de radicais
apolares como: metil, etil, metileno. AAs constituintes da molécula.
 Ligação ou ponte dissulfeto: formada pela união de grupos –SH dos
AA cisteína.

OBS: - As ligações estabilizantes em maior número são as pontes de “H”.
- A ligação estabilizante mais forte é a ligação dissulfeto.


Estrutura
c) Estrutura terciária ou nível terciário
É a sua forma tridimensional ocasionada pelo enrolamento da espiral
sobre si mesma (novelo). As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura
secundária.


Estrutura
d) Estrutura Quaternária ou Nível Quaternário
É a que resulta da reunião de várias estruturas terciárias que, em conjunto, assumem
formas espaciais bem definidas. As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura
secundária.
OBS: nem todas as proteínas apresentam esta estrutura, mas de uma maneira geral,
todas as enzimas as apresentam.


Desnaturação
A desnaturação de uma proteína é a desorganização das estruturas
quaternárias, terciárias e secundárias.
Agentes desnaturantes são os que provocam a desorganização.
São eles: agentes físicos (calor, radiações UV, alta pressão e ultra som)

agentes químicos (ácidos fortes, bases fortes, metais pesados e uréia)

A proteína desnaturada apresenta as seguintes alterações:
a) Físicas: aumento da viscosidade; não podem ser cristalizadas ou auto-organizadas.
b) Químicas: maior
reatividade: devido a exposição de grupos químicos que estavam
encobertos por estruturas; diminuição da solubilidade do PHi e, consequente
precipitação.
c) Biológicas: perda
de suas propriedades enzimáticas, antigênicas e hormonais;
facilmente digeridas por enzimas hidrolíticas.


Enovelamento
Protéico

Chaperona
Molecular


Métodos Avançados

Biotecnologia & Biomol

Sequenciamento
Histórico

Década de 50 até Atualidade...

Seq-history
* 1953 Discovery of the structure of the DNA double helix (Watson, Crick, Franklin).
* 1958 Prove the semi-conservative nature of dna replication (Meselson, Stahl)
* 1961 First DNA triplet is decoded (Matthei, Nierenberg)
* 1972 Development of recombinant DNA technology, which permits isolation of defined fragments
of DNA; = sequencing were from bacteriophage or virus DNA.
* 1972 The first gene is sequenced
* 1975 The first complete DNA genome to be sequenced is that of bacteriophage φX174
* 1977 Allan Maxam and Walter Gilbert publish "DNA sequencing by chemical degradation“.
* Fred Sanger, independently, publishes "DNA sequencing by enzymatic synthesis".
* 1980 Fred Sanger and Wally Gilbert receive the Nobel Prize in Chemistry
* 1982 Genbank starts as a public repository of DNA sequences.
* 1982 Andre Marion and Sam Eletr from Hewlett Packard start Applied Biosystems in May, which
comes to dominate automated sequencing.
* 1982 Akiyoshi Wada proposes automated sequencing and gets support to build robots
with help from Hitachi.
* 1983 Polymerase-Chain-Reaction (Mullis) PCR
* 1984 RFLP fingerprinting (Jeffreys)
* 1984 Medical Research Council decipher complete DNA sequence of the Epstein-
Barr virus, 170 kb.
* 1985 Kary Mullis and colleagues develop the polymerase chain reaction, a technique to replicate
small fragments of DNA
* 1986 Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology and Smith announce the
first semi-automated DNA sequencing machine. by Applied Biosystems as 370A.
* 1987 Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI 370.

Seq-history
* 1990 The U.S. National Institutes of Health (NIS) begins large-scale sequencing trials on Mycoplasma
capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and Saccharomyces cerevisiae (at 75 cents (US)/base).
* 1990 BLAST algorithm for aligning sequences published (Lipman, Myers).
* 1990 capillary electrophoresis published (Barry Karger, Lloyd Smith, Norman Dovichi).
* official start of the Human Genome Project
* 1991 Craig Venter develops strategy to find expressed genes with ESTs (Expressed Sequence Tags).
o Uberbacher develops GRAIL, a gene-prediction program.
* 1992 Craig Venter leaves NIH to set up The Institute for Genomic Research (TIGR).
o William Haseltine heads Human Genome Sciences, to commercialize TIGR products.
o Wellcome Trust begins participation in the Human Genome Project.
o Simon et al. develop BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) for cloning.
+ Weissenbach - complete human genetic map[31].
* 1993 Wellcome Trust and MRC open Sanger Centre, near Cambridge, UK.
o The GenBank database migrates from Los Alamos (DOE) to NCBI (NIH).
* 1995 Venter, Fraser and Smith publish first sequence of free-living organism, Haemophilus influenzae
(genome size of 1.8 Mb).
o Michael Reeve and Carl Fuller, thermostable polymerase for sequencing[8].
* 1996 International HGP partners agree to release sequence data into public databases within 24 hours.
o International consortium releases genome sequence of yeast S. cerevisiae (genome size of 12.1 Mb).
o Yoshihide Hayashizaki's at RIKEN completes the first set of full-length mouse cDNAs.
o ABI introduces a capillary electrophoresis system, the ABI310 sequence analyzer.
* 1997 Blattner, Plunkett et al. publish the sequence of E. coli (genome size of 5 Mb).
* 1997 First cloned animal, Sheep "Dolly", is born (Wilmut).

Seq-history
* 1998 Phil Green and Brent Ewing of Washington University publish “phred” for interpreting
sequencer data.
o Venter starts new company “Celera”; “will sequence HG in 3 yrs for $300m.”
o Applied Biosystems introduces the 3700 capillary sequencing machine.
o Wellcome Trust doubles support for the HGP to $330 million for 1/3 of the sequencing.
o Sulston, Waterston et al finish sequence of C. elegans (genome size of 97Mb).
* 1999 NIH moves up completion date for rough draft, to spring 2000.
o NIH launches the mouse genome sequencing project.
o First sequence of human chromosome 22 published.
* 2000 Celera and collaborators sequence fruit fly Drosophila melanogaster (180Mb) -
validation of Venter's shotgun method.
* 2000 HGP consortium publishes sequence of chromosome 21.
* 2000 HGP & Celera jointly announce working drafts of HG sequence, promise joint publication.
* 2000 Estimates for the number of genes in the human genome range from 35,000 to 120,000.
* 2000 International consortium completes first plant sequence,Arabidopsis thaliana
(genome size of 125 Mb).
* 2001 HGP consortium publishes Human Genome Sequence draft in Nature (15 Feb)[38].
* 2001 Celera publishes the Human Genome sequence.
* 2002 HapMap project initiated to decipher human genetic variation
* 2005 420,000 VariantSEQr human resequencing primer sequences published on new NCBI database.
* 2005 Genographic project launched to study human migration
* 2007 Craig Venter publishes his full diploid genome.

Era do Pós-genomas
 Derivar conhecimento significativo de sequências de DNA definirá a pesquisa
biológica através das próximas décadas, exigindo a interação entre químicos,
biólogos, médicos, farmacêuticos, engenheiros, cientistas da computação,
sociólogos e etc = Era da pluralidade.
◦ Temos = Número de genes, localização exata e funções de “N” organismos
◦ Rotas de Regulação gênica
◦ Temos = Organização da sequência de DNA
◦ Temos = Estrutura e organização cromossômica
◦ Tipos, quantidade, distribuição e funções do DNA não-codificante (íntrons)
◦ Mapeamento da expressão gênica, síntese de proteínas e eventos pós-
tradução
◦ Interação de proteínas em máquinas moleculares complexas
◦ Funções de genes prevista X experimentalmente determinadas
◦ Conservação evolucionaria entre organismos
◦ Proteomas - Transcriptomas - Regulomas
◦ Predição para pré-disposição a doenças baseada nas variações das
sequências dos genes – SNPs. = EUGENIA – DROGAS PERSONALIZADAS.

Projeto Genomas Vegetais
By Sanger


Morning - The end

Roberta A. Campos PhD. March 2012

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