2. C
T
G
G
A
C
T
CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAGCATACGGGGACTGC
ACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGA
GTGACACACAGTGCAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT
10. Como validar as marcas?
Desenvolvimento de um SCAR
(S equence characterized amplified RAPD )
4) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois
bulks de DNA com fenótipos contrastantes,
5) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um
vetor (plasmideo),
6) sequenciamento do fragmento isolado,
7) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os
decâmeros
8) teste final (Paran e Michelmore, 1993).
11.
12. SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES (SAM)
Marcador Primer Gene Referencia
RAPDS
OPM18900 CACCATCCGT Vf Koller et al.,1994
OPU01400 ACGGACGTA Vf Koller et al.,1994
OPD20500 ACCCGGTCAC Vf Yang & Kruger, 1994
OPC081100 TGGACCGGTG Vf Tartarini 1996
OPC09900 CTCACCGTCC Vf Tartarini 1996
OPAL07580 CCGTCCATCC Vf Tartarini 1996
OPAM192200 CCAGGTCTTC Vf Tartarini 1996
OPA15900 TTCCGAACCC Vf Durham and Korban 1994
OPO141700 AGCATGGCTC Vf King et al. 1998
OPAF132000 CCGAGGTGAC Vf King et al. 1998
OPAG051900 CCCACTAGAC Vf King et al. 1998
OPAG12800 CTCCCAGGGT Vf King et al. 1998
SSR
CH05e03 For:CGAATATTTTCACTCTGACTGGG Vbj M.Gygax (Frey et al.,2004)
Rev:CAAGTTGTTGTACTGCTCCGA
CH02B10 For: CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG Vr Hemmat et al.,2002
Rev: CAAGTGGCTTCGGATAGT
CHVf1 For: ATCACCACCAGCAGCAAAG Vf C.Gessler (Frey et al.,2004)
Rev: CATACAAATCAAAGCACAACCC
CH02c06 For: TGACGAAATCCACTACTAATGCA Vr Baldi et al.,2004
Rev: GATTGCGCGCTTTTTAACAT
CH02C02a For: CTTCAAGTTCAGCATCAAGACAA Vr2 Patocchi et al., 2003
Rev: TAGGGCACACTTGCTGGTC
CH02B07 For: CCAGACAAGTCATCACAACACTC Vd Calenge et al., 2005
Rev: ATGTCGATGTCGCTCTGTTG
Primers específicos Vf
Vfa1 For: TCTATCTCAGTAGTTTCTATAATTCC Vf Xu & Korban (2002)
Rev:GTAGTTACTCTCAAGATTAAGAACTT
Vfa2 For: CTCAATCTCAGTAGTTTCTATGGA Vf Xu & Korban (2002)
Rev: CCCCCGAGATTAAGAGTTG
Vfa3 For:ATATTAGTAGTTTCTATAATCTGAAGG Vf Xu & Korban (2002)
Rev:CCCCCGAGATTAAGAGATG
Vfa4 For:TATCTCAATCTCAGTAGTAATAGTATC Vf Xu & Korban (2002)
Rev:GACCTTGGAAACCACAATC
AL07/SCAR 450 464 For: TCCTTACTGAGGAGGAAACCAG Tartarini et al. (1999)
Rev: CAAGGGAACTGATCTTTCGTTG
ARGH
ARGH 25/CH02B07 For:CAAACATCATCGTAATTTTGACG Vd Baldi et al.,2004
Rev:CATACTCTTCATGAGGATAATTC
ARGH37 For:TGCACGACATTAGCAACACTG Vr2 Baldi et al.,2004
Rev:GAAACAACTTCTTTTGAGAGTTC
ARGH17 For:TTGCCGACGTTCGTGATGCT Vr2 Baldi et al.,2004
Rev:GATATCCTTTGTTTGGACAACC
ARGH 34/CHVf1 For:TGTATGACCAGCCGAAGGTG Vf1 Baldi et al.,2004
REv:CCAGGACAACAATGTACCTC
13.
14.
15. O conhecimento de sintenia permite o acesso de reprodução, por exemplo,
todos os alelos de todos os cereais, e não de única espécie.
Transferência de genes para trigo do arroz. Gene foi encontrada em arroz
por sintenia e, posteriormente, isolado e modificado pela alteração da
seqüência de DNA que caracterizou genes do trigo antes de substituir o
gene modificado de arroz.
Este método pode ser aplicado a
qualquer gene de qualquer cereal,
três principais de trigo, arroz e milho
Mais importante, no entanto,
atualmente existe a possibilidade de
combinar os conhecimentos de
bioquímica, fisiologia e genética e
transferência de uma cultura para
outra por meio de sintenia.
16. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Amplificar milhares de vezes um fragmento de DNA.
Iniciadores é uma etapa chave para um PCR bem sucedido
Necessita do conhecimento prévio da sequência de DNA
alvo
Uso de iniciador com parâmetros específicos, como:
Temperatura, tamanho, composição e conteúdo GC
Parâmetros são calculados utilizando-se softwares
específicos a fim de que os iniciadores se unam à
sequência de DNA de interesse.
17. O desenho dos iniciadores é dividido em várias
fases:
Busca e escolha das sequências de interesse;
Alinhamento das sequências;
Determinação do consenso;
Seleção da região consenso mais conservada;
Escolha e teste dos iniciadores.
18. A Tm (Temperature melting)
mínimo 57°C, máximo 63°C e ótima de 60°C
Percentual de GC contido na seqüência alvo de DNA
usualmente é de 40% a 60%
GC na constituição da fita justifica-se pelo fato de haver uma ligação
mais forte entre esses nucleotídeos (através de três pontes de
hidrogênio) comparada às duas pontes em AT.
Torna-se mais difícil de separar as fitas nas ligações GC que em AT.
Tamanho dos fragmentos amplificados (amplicon)
varia de 100 a 300 nucleotídeos.
Comprimento estipulado para os iniciadores
mínimo de 19, máximo de 22 e ideal de 20 pares de bases.
19. Homepage Map Viewer: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview
Selecione Homo sapiens Pesquisa (humano)
a partir do menu pull-down,
digite na caixa de FMR1 em seguida, selecione Go.
Na página de resultados, quatro entradas são retornados (4 hits).
FMR1 foi mapeado em três diferentes mapas: Genes_cyto,
Genes_seq e Morbid
Selecione o mapa Genes_seq para ver a estrutura do gene FMR1.
Dois links à direita do mapa Genes_seq são de uso em recuperar os
5 'e 3' DNA de acompanhamento,
No topo da página, Download / Ver Seqüência /
20. Prec isamos ter uma sequencia de cDNA mas
precisamos ter também a seqüência de nucleotídeos
que se encontra 5 'ou 3' de um gene ou os íntrons para
análises adicionais.
Pois a seqüência genômica disponível a partir do banco
de dados público não pode ter essa anotação ou pode
ser tão grande que torna difícil para recuperar apenas
uma região de interesse,
Ferramentas Map Viewer torna mais fácil de definir,
visualizar e baixar seqüência genômica em vários
formatos
21. Usamos o visualizador de Mapa para procurar
genes candidatos em uma região
O Map Viewer oferece suporte a consultas por
qualquer loco posicionado em um mapa
Feito pelo número de acesso ou qualquer
outro link que possa definir a sua faixa de
interesse (loco no mapa).
