O documento descreve a expressão, purificação e testes de inibição da enzima diidroorotato desidrogenase humana (HsDHODH). A enzima foi expressa em E. coli e purificada usando cromatografia de afinidade. Cinco compostos inibiram a HsDHODH, mas não a enzima equivalente de Trypanossoma cruzi. Condições iniciais de cristalização da enzima humana também foram identificadas.

1. A enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a oxidação da molécula L-
diidroorotato a orotato na quarta etapa da via de novo de biossíntese de nucleotídeos
de pirimidina, utilizando como cofator FMN e como agente oxidante a molécula de
ubiquinona (figura 1). DHODH têm sido utilizada como alvo terapêutico para o
tratamento de doenças proliferativas e parasitárias [1,2]. Neste trabalho, a partir de
um protocolo de clonagem, expressão e purificação, que foram anteriormente
estabelecidos, a enzima DHODH humana pode ser submetida à ensaios de
cristalização de forma a possibilitar a determinação da estrutura por técnicas difração
de raios-X. A enzima também foi submetida à ensaios de inibição na presença de
compostos previamente identificados como ligantes das enzimas de
tripanossomatídeos de forma a atender duas estratégias: identificar compostos que
tenha ação seletiva para as enzimas de tripanossomatídeos e identificar uma nova
classe de compostos com ação inibitória contra a enzima humana.
O gene que codifica a enzima HsDHODH foi clonada no vetor de expressão pET28a(+)
(Novagen), transformada em E. coli da linhagem BL21(DE3) e expressa fusionada a
duas caudas de histidina, sendo uma localizada na região N-terminal e a outra na C-
terminal. A fusão das caudas de histidina permitiu que a enzima fosse purificada
através de uma cromatografia por afinidade, utilizando a resina Ni-NTA Agarose
(Qiagen). A eluição foi realizada através de um gradiente crescente de imidazol (figura
2). O material purificado foi inicialmente utilizado para a realização dos testes de
inibição em que foram utilizados duas diferentes estratégias: uma com incubação por
16h a 20°C e outra sem incubação. O protocolo utilizado para o ensaio de inibição
consiste no monitoramento da atividade enzimática através de um ensaio
espectrofotométrico a 600nm que utiliza o reagente colorimétrico DCIP, onde a
redução do DCIP é estequiometricamente equivalente a oxidação de L-diidroorotato,
substrato da enzima. A concentração da proteína no ensaio final foi de 1,25µg/mL em
um volume de 200µL e o ensaio foi feito em um leitor de microplacas Elx808 na
presença de 32 diferentes compostos na concentração de 200µM por 2min.
Anteriormente foram realizados ensaios de cristalização utilizando os kits de
cristalização comercialmente disponíveis Crystal Screen™, Crystal Screen 2™
(Hampton Research), PEG/Ion Screen ™ (Hampton Research) e NeXtal Tubes MBClass
Suite (Qiagen) que utilizam método da matriz esparsa. Foram identificados algumas
condições com potenciais condições de cristalização e nesse projeto essas condições
foram varridas variando-se o agente precipitante, o pH, a temperatura, a solução
tampão e os aditivos.
A proteína HsDHODH foi expressa e purificada com sucesso com rendimento de 0,46mg de
proteína em 1 litro de meio de cultura. Nos ensaios inibitórios, dos 32 compostos testados
5 apresentaram ação inibitória contra a HsDHODH (figura 3). Esses mesmos compostos, no
entanto, não inibiram a enzima DHODH de Trypanossoma cruzi. As figuras 4 e 5 mostram
as atividades enzimáticas da HsDHODH perante os compostos e sem a presença dos
mesmos (usado como referência). O efeito inibitório da proteína mais consistente com a
incubação pode ser consequência de uma interação tempo dependente dos ligantes com a
proteína. A varredura das condições de cristalização identificou condições de cristalização
para a realização de futuros ensaios (figura 6), que abrirão oportunidade para realizar co-
cristalização com os compostos identificados nos ensaios de inibição.
Ensaio de cristalização e inibição da enzima diidroorotato desidrogenase humana
Renata F. Pessanha, Matheus P. Pinheiro, M. Cristina Nonato
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO - USP, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Agencia Financiadora: CNPq
Palavras-chave: Homo sapiens - DHODH – cristalização - expressão heteróloga
[1] T. Annoura et. al, J. Mol. Evol., 60, 113-127 (2005).
[2] Liu et al. Structure, 15, 25-33 (2000)
Ao PIBIC pelo suporte financeiro e ao Prof. Jon Clardy (Universidade de Harvard) pela
disponibilização do DNA molde da enzima HsDHODH.
Figura 1. Reação de oxidação-redução catalisada pela enzima DHODH de Homo sapiens. Sendo a
molécula de ubiquinona (segundo substrato) o agente oxidante.
HsDHODH
Figura 6. Cristal da enzima HsDHODH obtida
na presença de 16% (m/v) PEG 3350 como
agente precipitante e 0,2M de Citrato de
sódio em gota 1 : 2 (proteína : poço).
Composto
Com incubação Sem incubação
Inibição Inibição
LCPSA624 48,00 ± 0,88 20,98 ± 1,32
LCPSP046 45,57 ± 0,98 29,92 ± 1,06
LCPSP026 49,09 ± 0,88 -5,19 ± 2,07
LCPSP028 46,15 ± 2,10 10,28 ± 1,39
LCPSP063 43,93 ± 2,86 4,60 ± 1,48
Figura 3. Porcentagem de inibição da proteína HsDHODH
na presença de cinco diferentes compostos após
incubação e sem incubação.
0 20 40 60 80 100 120 140
0,0
2,0x10
-6
4,0x10
-6
6,0x10
-6
8,0x10
-6
1,0x10
-5
1,2x10
-5
1,4x10
-5
1,6x10
-5
1,8x10
-5
Absorvância(600nm)
Tempo (s)
Referência
LCPSA624
LCPSP046
LCPSP026
LCPSP028
LCPSP063
Figura 4. Atividade da enzima HSDHODH na
presença dos cinco compostos após incubação.
Figura 5. Atividade da enzima HSDHODH na
presença dos cinco compostos sem incubação.
0 20 40 60 80 100 120 140
0,0
2,0x10
-6
4,0x10
-6
6,0x10
-6
8,0x10
-6
1,0x10
-5
1,2x10
-5
1,4x10
-5
1,6x10
-5
Absorvância(600nm)
Tempo (s)
Referência
LCPSA624
LCPSP046
LCPSP026
LCPSP028
LCPSP063
97kD
a
65kD
a
45kD
a
20kD
a
30kD
a
Figura 2. Eltroforese SDS-page (12% poliacrilamida)
mostrando a pureza da proteína . Poço 1: padrão
molecular; poços 2 a 6: lavagem realizada com 100mM de
Imidazol; poços 7 a 10: eluições a 250mM de Imidazol.
HsDHODH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10