O documento descreve uma pesquisa sobre a auto montagem da proteína do capsídeo do vírus do moteado clorótico do caupi (CCMV) em moléculas de RNA de diferentes tamanhos. Os resultados mostraram que uma proporção de 6:1 de proteína/RNA permite o encapsulamento de RNAs variando de 140 a 12.000 nucleotídeos. RNAs curtos são empacotados em estruturas com 1-4 moléculas de RNA, enquanto RNAs longos são empacotados por múltiplos capsí

1. AUTO MONTAGEM DA PROTEÍNA DO CAPSÍDEO
DE VÍRUS EM MOLÉCULAS DE RNA DE
DIFERENTES TAMANHOS: EXIGÊNCIA DE UMA
ELEVADA MASSA DE PROTEÍNA ESPECÍFICA EM
RELAÇÃO A MASSA DE RNA
Amanda Letícia da Silveira
Bruna Canabarro Pozzebon
Mara Elisa Soares de Oliveira
Marina Guimarães Pacífico
Yasmim Freitas

2. INTRODUÇÃO
 Partículas semelhantes a vírus podem ser
formadas por auto montagem (VLPs) de
proteínas do capsídeo a partir de moléculas de
RNAs de comprimento crescente;

3. INTRODUÇÃO
 Vírus do moteado clorótico do caupi (CCMV):
 RNA1 e RNA2: replicação viral;
 RNA3: proteína de movimento e capsídeo;
 RNA1: 3,171 nt
 RNA2: 2,774 nt
 RNA 3: 2,173 nt

5. OBJETIVO
 Examinar a auto montagem da CP do vírus do
moteado clorótico do caupi com moléculas de
RNA que variam de 140 a 12.000 nts.

6. MATERIAL E MÉTODOS
 Foram utilizados plasmídeos para clonagem de
RNA;
 Combinação RNA B1 e B3 por subclonagem
direcional;
 Amplificação dos moldes de DNA pra transcrição
de RNAs curtos; (Influência do DNA no
capeamento)

7. MATERIAL E MÉTODOS
 Transcrição do RNA; (linearizou pra produzir um
RNA transcrito).
 Purificação da proteína do capsídeo do CCMV;
(Retira o vírus da planta e realiza a extração e
posteriormente verifica a concentração de
proteína).
 Montagem in vitro: Titulações preliminares e
revelação em gel. (Estudou a montagem do vírus
com diferentes concentrações de RNA).

8. MATERIAL E MÉTODOS
 Montagem in vitro de VLPs. Colocou a concentração
de RNA e misturou numa proporção de 6:1. Analisou
as partículas e realizou coloração negativa.
 Combinação de RNAs B1+B3: clonou, transcreveu in
vitro e colocou em concentrações diferentes, para
ver a concentração do RNA X Proteína e vice versa
(influência na capsidação viral).

9. MATERIAL E MÉTODOS
 Microscopia eletrônica de transmissão de VLP:
Coloração negativa para comparar as partículas
produzidas com a do vírus;

10. RESULTADOS

11. RESULTADOS

12. RESULTADOS

13. RESULTADOS
FIG 4 (A) Average capsid diameter as a function of RNA length. A plot of the average capsid diameter as a function of the length of ssRNA packaged, with each
assembly carried out at the magic ratio in RNA assembly buffer (RAB), is shown. Each average contains contributions only from the capsids associated with the
predominant multiplet (i.e., singlet, doublet, triplet, or quadruplet) for the corresponding RNA length (except in the case of 5,300 nt, where equal amounts of
singlets and doublets were observed). The plot is divided along the abscissa into three regions: (I) the region between 140 and 1,000 nt, where we find
predominantly singlet capsids that contain multiple ssRNA molecules; (II) the region between1,500 and4,000 nt, where each singlet capsid contains only one
RNA molecule (the point denoted by an asterisk corresponds to the wt CCMV virion); and (III) the region above4,000 nt corresponding to the appearance of
multiplet capsids sharing anRNAmolecule. The error bars represent the full width at half-maximum for each distribution. (B) Fraction of multiplets as a function
ofRNAlength. The negative-stainTEMimages at the top of the panel show typical structures observed for singlets (A), doublets (B), triplets (C), and quadruplets
(D). The frequency of multiplet capsids (bottom panel)—defined as the fraction of capsids present in the transmission electron microscopy as doublets (), triplets
(o), and quadruplets ()—increases with ssRNA length after 3,200 nt. Singlets (OE) predominate for smaller lengths. Hand-drawn best-fit lines have been added
to aid the eye in following the appearance and disappearance of the different multiplet populations as RNA length increases.

14. RESULTADOS

15. RESULTADOS DISCUSSÃO
FIG. 6 Distribuição dos diâmetros da cápside que aparecem nos singuletos e multipletos
para cada comprimento de RNA empacotado. Contribuições dos singuletos, dupletos,
tripletos, quádruplos são mostrados em preto, vermelho, verde e azul, respectivamente. A
distribuição na parte superior esquerda é para peso de CCMV. Em cada distribuição das
contagens foram normalizados para que a dimensão mais abundante. O número total de
partículas medidas são mostradas em parênteses.

16. CONCLUSÕES
 O RNA variando de 140 a 12.000nt pode ser
embalado completamente por CCMV CP;
 Proporção ideal de Proteína/RNA é de 6:1, para o
encapsulamento;
 RNAs curtos com até 2000nt são empacotados
em estruturas T2 e T3 com 1 a 4 moléculas de
RNA no capsídeo;
 Os RNAs longos com até 4500nt são
empacotadoss por 2 ou mais capsídeos T3 ou T4;
 Os RNAs intermediários são empacotatos em
capsídeos T3.