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Trabalho sobre Projeto de sistema de registro e Aquisição de dados em matrizes multieletrodo - 2

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  1. 1. Exame de Qualificação “Projeto de um Sistema de Estimulação Elétrica, Registro, Amplificação e Filtragem de Sinais de Neurônios em Matriz de Microeletrodos” Francisco Fambrini FACCAMP ffambrini@gmail.com Dr. José Hiroki Saito Orientador saito@dc.ufscar.br
  2. 2. Sumário 1- Introdução 2 - Pesquisa bibliográfica sobre MEA, Aspectos gerais; 3- Pesquisa bibliográfica sobre o Hardware e Software de sistemas MEA ; 4- Proposta de trabalho; 5- Validação, resultados esperados e cronograma; 6- Resultados preliminares
  3. 3. Introdução • Objetivo geral: – Desenvolvimento de um projeto completo para Aquisição e Registro de dados a partir de MEA padrão de 60 eletrodos da MultiChannel Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de sinais de teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos neurônios, filtros e placa de aquisição de dados. • Motivação: – Ir de encontro ao domínio da tecnologia de interface neurônioeletrodo relativa à MEA e a outros dispositivos como EEG.
  4. 4. Pesquisa bibliográfica sobre MEA, aspectos gerais.
  5. 5. Matriz de Microeletrodos (Microelectrode Array – MEA, em inglês) MEA é um dispositivo de nanotecnologia construído com a mesma tecnologia dos circuitos integrados. Serve para cultura de células neuronais in vitro, em tecidos ou dissociadas. Acima, uma MEA padrão da MultiChannel Systems com eletrodos de 30 µm de diâmetro e 200 µm de espaçamento entre si, com 60 microeletrodos (pontos escuros nas extremidades condutoras e raias isoladas).
  6. 6. Neurônios e células da Glia Neurônios são células básicas do cérebro e do sistema nervoso. Células da glia tem funções de sustentação, nutrição e defesa dos neurônios. A maior parte dos tumores do SNC(Sistema Nervoso Central) são tumores gliais. Neuroblastomas são muito raros.
  7. 7. Medidas de Neurônios in vitro usando MEA • As medidas usando MEA podem ser em: – Tecidos neuronais - fatias de células obtidas de uma parte do cérebro; – Neurônios dissociados - aqueles separados da fatia de tecido do cérebro. • Os neurônios podem ser cultivados por várias semanas e os seus sinais eletrofisiológicos medidos ao longo do tempo.
  8. 8. Características dos Sinais em MEA • Atividade elétrica – Extracelular , espontânea ou evocada, de um grupo de neurônios • Amplitude do sinal extracelular entre 20 e 40 µV. • Frequência de amostragem entre 5 e 48 kHz. • Dados na ordem de Gbytes. Padrões de atividade: • Atividade basal : repouso • Spike: pico do sinal; atividade elétrica de um ou mais neurônios • Burst: sequência de spikes num intervalo pequeno de tempo
  9. 9. Detecção dos Spikes  Spike:    Impulsos nervosos ou potenciais de ação Produzidos por um ou mais neurônios É observado por um período de tempo relativamente longo 100-01-basale1-1-12 100-01-basale1-1-12 100 100 00 100-01-basale1-1-12 100-01-basale1-1-12 -50 -50 40 40 20 20 -100 -100 00 -150 -150 25.8 25.8 26 26 26.2 26.4 26.2 26.4 Time [sec] Time [sec] 26.6 26.6 26.8 26.8 Amplitude [uV] Amplitude [uV] Amplitude [uV] Amplitude [uV] 50 50 -20 -20 -40 -40 -60 -60 -80 -80 -100 -100 -120 -120 26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43 26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43 Time [sec] Time [sec]
  10. 10. Sinal Eletrofisiológico Por que estudar spikes? A informação está contida nos spikes e no atraso entre dois spikes consecutivos.
  11. 11. Detecção dos Spikes • Desvio padrão é calculado sobre a atividade basal • Limiar é calculado como um múltiplo do desvio padrão
  12. 12. Detecção dos Bursts Burst:  Sequência de spikes que ocorrem em um período pequeno de tempo  Duração igual a soma de todos os ISI (intervalo entre spikes) contidos num mesmo conjunto Identificação de Bursts Hipóteses:  O Burst é caracterizado por um certo número de spikes Definir número mínimo de spikes pertencentes a um burst  Spikes de um mesmo Burst encontram–se muito próximos Definir espaçamento temporal mínimo para considerar se o spike é pertencente ao burst ou não  Os Bursts encontram–se separados por no mínimo centenas de ms.
  13. 13. Detecção dos Bursts Spikes dentro dos bursts são muito próximos (ISImáx de 100 ms) Distância entre bursts de no mínimo 100 ms (IBImín de 100 ms) Formado por um número determinado de spikes (5 a 10 spikes)
  14. 14. Tipos de MEA – MultiChannel Systems MEA planar – para cultura in vitro. MEA padrão densidade Thin MEA MEA256 de alta MEA padrão – com 60 eletrodos, considerada padrão da MultiChannel Systems Thin MEA – espessura fina para possibilitar imagem invertida MEA256 – com 256 eletrodos
  15. 15. Mea Flexível Serve para medir sinais em implantes no cérebro
  16. 16. Exemplo de aplicação em farmacologia biosensor para testes in vitro de drogas Registros elétricos feito em 6 eletrodos em fatia de hipotálamo de rato. Cada ponto marcado com A, B, C, D, E e F é um microeletrodo onde foi aplicado um hormonio que estimula o hipotálamo (Ghrelin). Os eletrodos que registraram aumento no número de spikes entre 24 e 40 s são das regiões B, C, E e F, região onde foi aplicado o hormônio. As regiões A e D, mais distantes do ponto de aplicação do hormônio, tiveram significativa redução do número de spikes/segundo.
  17. 17. Hardware e Software de sistemas MEA
  18. 18. Laboratório de Eletrofisiologia para estudos de registros e estímulos de MEA
  19. 19. Soquete elétrico Propiciar as conexões elétricas com a MEA e a sustentação mecânica
  20. 20. Amplificador para MEA Muitos canais são necessários (60, 64, 128 ou 256 dependendo do sistema) e um nível de ruído elétrico baixíssimo é fundamental. Níveis de ruído tão baixos quanto 5 µV/√Hz são necessários à entrada do amplificador, a cada canal. PGA (Programmable Gain Amplifier). Aspecto de um amplificador PGA headstage externo para MEA. O operador pode alterar o ganho de cada canal simplesmente alterando um ajuste no software de registro no computador. - Ganho de Tensão: 1200 vezes; - Banda passante: 1 Hz – 3 kHz; - Contatos banhados a ouro substituíveis; - Acesso direto a cada eletrodo para estimulação; - Elemento de aquecimento interno, com sensor de temperatura.
  21. 21. Janela de controle do ganho do PGA no software Neuro-Righter
  22. 22. Soquete, amplificador e placa de aquisição de dados com conversor AD, fabricado por MED64 Systems, Japão.
  23. 23. Softwares para fazer os registros dos sinais da MEA MeaBench Neurorighter McRack MED64 Mobius
  24. 24. MEA Bench • • Disponível grátis em: http://www.its.caltech.edu/~daw/meabench/ MEABench comunica-se com o hardware através de um driver escrito por Thomas DeMarse ; • Usa originalmente amplificadores de MultiChannel Systems. Escrito em C, roda sob sistema operacional RT-Linux
  25. 25. Mea Bench Interface gráfica
  26. 26. NeuroRigther • Disponivel grátis: https://sites.google.com/site/neurorighter/ NeuroRighter possibilita rejeição do ruído usado em estimulo on-line, spike-detection, e pode gravar o pacote de dados com baixo período de latencia. Cada um dos 64 canais é amostrado em frequencia de 25 kHz, com periodo de amostragem em torno de 9 milissegundos. Usa placas de conversores A/D e D/A (16 bit) da National Instruments (usadas com o Labview) que permite montar um sistema barato de registro e estimulação de dados.
  27. 27. NeuroRigther Interface gráfica
  28. 28. MC Rack • É um dos softwares oficiais da MultiChannel Systems. • Não é gratuito: http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack
  29. 29. MED64 Moebius • • • • Não é gratuito, disponivel em: http://www.med64.com/products/software.html Faz registro de potenciais evocados e expontâneos e grava e analisa spikes de cortes de cultura de células de neurônios. Usa hardware proprietário de MED64 Systems.
  30. 30. Soquetes disponíveis (MultiChannel Systems) • Soquete montado dentro da blindagem para limitar captação de ruídos
  31. 31. Gerador de Sinais MEA-SG Gera sinais elétricos variados nos pads de uma placa de circuito impresso que tem o mesmo formato da MEA padrão; Simula eletronicamente uma cultura de neurônios em MEA padrão e permite testar todo o sistema: soquetes, amplificadores, conversor AD e software de registro de dados.
  32. 32. Amplificador - headstage • Wagenaar e Potter propõe a seguinte topologia: • Amplificador não-inversor, seguido de um filtro passaaltas de 2ª ordem e de um filtro passa-baixas passivo de 1ª ordem.
  33. 33. Conversor AD – Analógico Digital • Multichannel Systems e MED64 possuem seus próprios conversores A/D vendidos com o equipamento deles (16 bits); • Potter e Wagenaar utilizam placas da National Instruments (usadas com o Labview), ex: NI cDAQ 9138. • Estrutura básica de um conversor A/D:
  34. 34. Multiplexador (MUX) • Como são necessários registrar muitos canais, um multiplexador é necessário na entrada do conversor A/D. Esses muxs já fazem parte das placas de aquisição de dados, juntamente com o conversor A/D.
  35. 35. Proposta de Trabalho
  36. 36. Proposta de Projeto • Projeto completo para Aquisição e Registro de dados a partir da MEA padrão de 60 eletrodos da MultiChannel Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de sinais de teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos neurônios, filtros e placa de aquisição de dados. • Como os sinais eletrofisiológicos captados pelos microeletrodos são da ordem de microvolts, esses sinais devem ser ampliados cerca de 1200 vezes por um sistema amplificador de duas fases, com técnicas especiais que evitam a amplificação de ruídos.
  37. 37. Etapas do trabalho 1- Estudo dos circuitos eletrônicos envolvidos. 2- Simulação computacional do amplificador, estimulador, gerador de sinais e placa de aquisição de dados (DAQ); 3- Construção dos protótipos: soquete, amplificador, estimulador, gerador de sinais e DAQ 4- Levantamento das medidas elétricas concernentes aos circuitos tais como: impedâncias, ganhos, níveis de ruído elétrico, sensibilidade, etc. 5- Comparação com as características elétricas descritas na literatura; 6- Validação de todo o sistema em condições reais de uso, aplicando-o em MEA onde se cultiva o tecido nervoso ou neurônios dissociados.
  38. 38. Detalhes do hardware
  39. 39. Causas de Ruído em Amplificadores Distorção e ruído estão presentes em qualquer sistema físico real e normalmente contribuem para a deterioração das características deste sistema. Um amplificador deveria fornecer idealmente em sua saída uma réplica do sinal de entrada multiplicado por uma constante. No entanto sua saída contém também sinais adicionais ausentes na sua entrada, que são os ruídos e distorções gerados no processo de amplificação. Ruído é um tipo de erro que não está presente no sinal original vi, mas aparece na saída independentemente de haver ou não sinal de entrada. Provém tanto dos circuitos internos como de fontes externas por acoplamento eletromagnético. O ruído tanto pode ser de natureza aleatória (randômico) como previsível (determinístico).
  40. 40. Ruído extrínseco • Tem causas externas, principalmente EMI (eletromagnetic Interference) e RFI (rádio frequency interference). • Blindagens metálicas tem por função minimizar os ruídos extrínsecos. • O principal que precisa ser filtrado é o de 60Hz, da rede elétrica, e seus harmônicos (múltiplos inteiros).
  41. 41. O que é ruído intrínseco ? Vin vs Time 1.5 R1 1k Vin (mV) 1 R2 2k 0.5 0 -0.5 0 2 4 6 8 10 12 -1 -1.5 V1 2.5 - Vout Ideal vs Time VF1 + 4 U1 OPA335 3 + + Time (mS) 2 Vout (mV) VG1 V2 2.5 1 0 -1 0 2 4 6 8 10 12 10 12 -2 -3 A principal fonte de ruído intrínseco é o movimento aleatório de cargas elétricas, que aumenta com o aumento da temperatura; -4 Time (mS) Vout with Noise vs Time 5 4 Vout (mV) 3 2 1 0 -1 0 2 4 6 -2 -3 -4 Time (mS) 8
  42. 42. Tipos de ruído intrínseco em amplificadores 1) Ruído Branco (ou ruído térmico): tem densidade de potência constante ao longo do espectro. 2) Ruído Rosa (ou ruído 1/f):a densidade espectral de potência é inversamente proporcional à frequência do sinal. 3) Ruído de Pipoca: ocorre em semicondutores. (1) e (2) tem distribuição estatística Normal ou Gaussiana e (3) tem distribuição multimodal Obs: os nomes em inglês são: 1) White Noise or Broadband noise or Thermal noise 2) Pink noise or 1/f noise 3) Popcorn noise or Burst noise or Red noise
  43. 43. Equação de Johnson-Nyquist (Equação do ruído térmico) En = 4kTk R∆f T é a temperatura (kelvin) R é a resistência sobre a qual surge o ruído ( Ω ohms) ΔF é o intervalo de frequência (hertz) K é a constante de Boltzmann ( 1.381 x 10^ -23 joule/kelvin) En é a tensão média quadrática do ruído (valor RMS) em circuito aberto sobre um resistor R.
  44. 44. Cálculo do ruído térmico de um estágio amplificador
  45. 45. Função dos filtros • Reduzir a banda passante do amplificador e consequentemente reduzir o ruído térmico; • Filtros Passa-Altas e Passa-Baixas na saída do amplificador headstage para limitar ruido.
  46. 46. Amplificador Headstage • 3 topologias possíveis: R1 10k R3 10k IOP1 R2 1k - R5 10k IOP2 - out IOP3 - out2 in2 + R8 10k R10 10k I1 + IOP5 + R7 10k in R4 10k - R6 10k + IOP4 - out3 R9 10k Ref. I2 + Inversor Não-inversor R11 10k Amplif. Instrumentação
  47. 47. Amplificador Não-Inversor • Ganho é G= 1+(R2/R1) .... fora da saturação Ganho de Tensão e de Potência em dB: GVdB Vout = 20 log Vin Pout GPdB = 10 log Pin
  48. 48. Melhor escolha: AI - Amplificador de Instrumentação • Apresenta melhor CMMR (rejeição de ruído de modo comum) do que o amp. não-inversor. Fazendo todos os resistores iguais a R Vout  2R = 1 +  Rg   (V1 − V2 )  
  49. 49. Escolhido: Texas INA333 • Menor nível de ruído seria o INA118, porém custo muito alto (R$ 72,00 cada peça). INA333 custa R$ 11,00.
  50. 50. Filtros passivos de 1ª ordem • Passa-baixas e Passa-Altas RC Filtros de 1ª ordem atenuam -6 dB por oitava ou -20db /década
  51. 51. Curvas para os filtros • Passa-baixas Passa-altas 1 Fc = 2πRC Frequência de corte ou Frequência de meia-potência é a frequência abaixo da qual ou acima da qual a potência na saída de um sistema é reduzida à metade da potência aplicada na entrada do mesmo sistema que corresponde uma redução a 70,7% do valor da amplitude de entrada. Em decibéis  atenuação de -3 dB por oitava para filtros de 1ª ordem.
  52. 52. Filtros Ativos - com amplificador operacional • • Filtro ativo passa-baixas de 2 ordem: possui 2 elementos que armazenam energia - 2 capacitores - Filtro tipo Butterworth Função de Transferência: H ( jω ) = • 1 ω  1+   ω   c 2 Frequência de corte: Fcorte 1 = 2π R1C1 R2C2 2ª ordem: Atenuação de -40 dB por década ( ou -12 dB por oitava)
  53. 53. • Filtro Ativo Passa-Altas com Amplificador Operacional Filtro Passa-Altas de 2ª ordem tipo Butterworth com amplificador operacional - possui 2 capacitores. Obs: Filtros de 2ª ordem possuem atenuação igual a -40 db por década (ou -12 dB por oitava). Função de Atenuação é o inverso da Função de Transferência: A(s)=1/H(s)H(s)=1/A(s)
  54. 54. Filtros Passa-Altas são derivadores e alteram a forma da onda ! Vo(t) : tensão na saída no instante t Vi : tensão na entrada do filtro
  55. 55. Conversor Analógico/Digital • Chip ADS 1299 – Conversor AD de 24 bits
  56. 56. Conversor A/D de 24 bits e multiplexador de 8 entradas num único chip Resolução do ADC:
  57. 57. Validação e Resultados esperados
  58. 58. Validação do protótipo • A validação constará de 3 etapas: a) Simulação dos Circuitos em Computador; b) Testes Elétricos dos protótipos (modelo físico) ; c) Testes em Campo. (a) Simuladores como LT-Spice (Linear®), Tina (Texas®), Proteus (Labcenter®) e Filterlab (Microchip®) serão utilizados; (b) Construção dos protótipos em bancada e medidas de ruído do amplificador, possivelmente no Centro Renato Archer (CTI-2) em Campinas-SP. (c) Testes efetuados com MEA cultivada in vitro, na Universidade Federal de Uberlândia, comparando o desempenho do sistema desenvolvido alvo dessa dissertação com o Sistema de Aquisição e registro de dados adquirido da MCS – Multichannel Systems da Alemanha.
  59. 59. Protocolo de testes a serem realizados na UFU ( Univ. Federal de Uberlândia) • • • Uma cultura de células poderá ser preparada em laboratório de biologia da profa. Celina Lotufo na UFU e cultivada em MEA para o Teste de Campo. Na UFU está sendo providenciada a instalação do laboratório de MEA com equipamento adquirido da MCS da Alemanha sob coordenação do prof. João Batista Destro Filho (verba aprovada pela FAPEMIG). Caso o equipamento de MCS já esteja instalado na UFU, um teste comparativo será feito, com a finalidade de comparar o desempenho do protótipo descrito nesse trabalho com o equipamento de MCS. O teste comparativo deverá registrar a mesma cultura e os mesmos eletrodos em MEA, e comparar os registros em três aspectos: a) Nível de ruído elétrico introduzido pelo amplificador e placa DAQ; b) Resolução temporal (analisando os gráficos na tela do computador) c) Resolução do conversor A/D.
  60. 60. CRONOGRAMA
  61. 61. Cronograma 1. Revisão bibliográfica e embasamento teórico. Investigar trabalhos científicos de base teórica, dos domínios envolvidos e trabalhos relacionados ao objetivo deste trabalho; 2. Construir os modelos computacionais; 3. Obtenção dos componentes eletrônicos; 4. Elaborar um artigo descrevendo o trabalho e submetê-lo a conferências internacionais e nacionais; 5. Preparo da Monografia para o Exame de Qualificação; 6. Construir os protótipos; 7. Efetuar as medidas elétricas com o protótipo; 8. Fazer a validação do sistema na UFU; 9. Redação do documento de Dissertação de Mestrado. 10. Entrega e defesa da Dissertação de Mestrado;
  62. 62. Apêndice • Estágio atual do desenvolvimento do trabalho
  63. 63. Efetuamos as medidas necessárias usando um Projetor de Perfil
  64. 64. E desenhamos nosso primeiro protótipo
  65. 65. ...construímos artesanalmente nosso protótipo, usando inicialmente papel, xérox...
  66. 66. E foi evoluindo...
  67. 67. Até chegar no primeiro protótipo artesanalmente construído...
  68. 68. Mostrando toda a evolução do desenvolvimento do soquete...
  69. 69. Produzimos então os arquivos .DFX e Gerber, necessários à produção industrial do soquete
  70. 70. Como testar o soquete ? • Teste mais simples: usando solução salina ( NaCl a 3,5 % - mesma concentração da água do mar, aplicado sobre a MEA)
  71. 71. Como testar o soquete ? • Construindo um dispositivo de testes e simulação para o soquete e todo o sistema, chamado MEA-SG (Signal Generator) semelhante ao produzido por MultiChannel Systems
  72. 72. Protótipo do MEA-SG • Usando um microcontrolador PIC12F683, usa o conceito de síntese digital por software das formas de onda desejadas:
  73. 73. Usando o PWM (Pulse Width Modulator) do microcontrolador PIC • Na saída do PWM, coloca-se um circuito integrador de 2 ordem, usando 2 resistores e 2 capacitores;
  74. 74. Um integrador é... um filtro passa-baixas operando em um frequência f muito maior que sua frequência de corte, ou seja, f >>Fc. Levando-se em conta esse fato, escolheram-se valores adequados para os resistores e capacitores do filtro, de modo a minimizar o ripple na senóide produzida. Foi escolhido R1=1 Kohms, C1 = 470 nF, R2=1 Kohms e C2=100nF, de modo que a frequência de corte ficou em 734 Hz, para um pwm trabalhando a 500 KHz. Fcorte = 1 2π R1C1 R2C2
  75. 75. Circuito final da segunda versão do MEA SG
  76. 76. Aspecto final do protótipo, ainda em placa padrão e circuito impresso
  77. 77. Desenhando a placa final do MEA SG
  78. 78. Circuito completo do amplificador- 1 canal
  79. 79. Equipamentos utilizados
  80. 80. Resultados Preliminares 1-Sinal medido na saída do amplificador com Osciloscópio Tektronix TDS1001-C; 2-Ganho total do amplificador ajustado para G=1000; 3-Amplificador alimentado com duas baterias de 12 volts associadas em série; 4-Sinal de entrada gerado pelo MEA-SG com amplitude calculada para 100 uV; 5-Temperatura ambiente em torno de 25º C Obs: A rigor, o nível de ruído de um amplificador deveria ser medido com Analisador de Espectro e a unidade usual de medida de ruído deve ser V/√Hz, a qual leva em conta a frequência do sinal de entrada, mas dispunhamos apenas de um osciloscópio.
  81. 81. Alguns resultados obtidos - I
  82. 82. Resultados - II
  83. 83. Resultados - III
  84. 84. Resultados - IV
  85. 85. Resultados Nível de ruído em função do ganho de tensão para o amplificador proposto
  86. 86. Artigo aprovado para publicação • ISIE 2013 – 22nd IEEE International Symposium on Industrial Electronics, Taipen (Taiwan) que acontecerá nos dias 28 a 31 de Maio de 2013. • Título do artigo: – “Low noise headstage design of MEA microelectrode signal amplification “
  87. 87. Obrigado!!

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