Este documento descreve um estudo que caracteriza o bloqueio farmacológico e gênico temporário dos receptores de adenosina, transportadores de nucleosídeos e ecto-5'-nucleotidases em embriões de peixe-zebra para avaliar sua participação no desenvolvimento inicial. O estudo envolve a injeção de morfolinos para knockdown gênico e tratamentos farmacológicos, além da análise morfológica e de locomoção das larvas. Os resultados incluem alterações na morfologia, taxa de sobrevivência

1. Caracterização do bloqueio farmacológico e bloqueio gênico
temporário dos receptores de adenosina, dos
transportadores de nucleosídeos e da ecto-5’-nucleotidases
em embriões de peixe-zebra (Danio rerio)
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS
Laboratório Neuroquímica e psicofarmacologia - PUCRS
Felipe Machado Torresini
Orientadora: Profª. Dra. Rosane Souza da Silva

2. Introdução
Sistema Purinérgico
 Receptores P1 (A1, A2A,
A2B e A3).
 Transportadores de
nucleosídeo
 Enzimas nucleotidases
 Adenosina

3. Justificativa
 O uso de MOs em peixe-zebra.
 A padronização do processo de injeção de MOs.
• Reprodutibilidade de uma curva dose-resposta
• Descrição adequada do fenótipo gerado
• Detalhamento de cada etapa
 Pela primeira vez será feita esta abordagem com relação ao estudo do
Sistema Purinérgico.

4. Objetivos
Avaliar a participação dos transportadores de nucleosídeo, dos
receptores P1 e da ecto-5’-nucleotidase nos processos iniciais do
desenvolvimento do peixe-zebra através de bloqueio farmacológico.
Objetivos específicos:
• Padronizar a curva dose-sobrevivência de embriões de peixe-zebra
submetidos ao bloqueio temporário dos genes que codificam para o
Transportador Concentrativo de Nucleosídeos, para os Receptores P1
(A1, A2A1 e A2A2) e para a ecto-5’-nucleotidase.
• Caracterizar a morfologia de larvas de peixe-zebra expostas ao
bloqueio gênico transitório dos genes que codificam para o
Transportadore Concentrativo de Nucleosídeos, para os Receptores P1
(A1, A2A1 e A2A2) e para a ecto-5'-nucleotidase.

5. Materiais e Métodos
• Todos os protocolos serão submetidos à aprovação pelo Comitê de
Ética para Uso de Animais (CEUA-PUCRS).
• Animais utilizados
– Obtenção de ovos através do acasalamento de matrizes;
– Administração dos MO será em embriões de no máximo 1 (hpf);
– Mantidos até os 7 (dpf) em estufa BOD;
– Ciclo claro-escuro de 14/10h.

6. Materiais e Métodos
Nocaute gênico em peixe-zebra: MORFOLINOS (MOs)
– Fita anti-senso de aproximadamente 25 pb.
– Pré-mRNA ou mRNA maduro.
– Formas de aplicação.

7. Materiais e Métodos
Tratamentos aplicados:

8. Materiais e Métodos
Aplicação de micro-injeções
Coloração com vermelho de fenol. Capilar de vidro acoplado a um microinjetor;
Pressão inicialmente 24psi.

9. Materiais e Métodos
Microinjeção com p53 MO
Para reduzir o risco de alvos errôneos já descritos na literatura será
co-injetado o MO para p-53, a qual evita o fenótipo neurotóxico
dependente de p-53.
p53 MO Atenua apoptose

10. Materiais e Métodos
Análise Morfológica – 5 dpf
• Software NIS-Element-D.
Comprimento Total do corpo (mm) – 4x
Superfície Ocular (mm²) – 4x

11. Resultados
Medidas realizadas

12. Resultados
Medidas realizadas

13. Resultados
Medidas realizadas - MO

14. Resultados
Cauda retorcida CNT2 – 4x
Edema pericárdico Dipiridamol 2,5 mg – 4x

15. Resultados
Análise morfológica - 5 dpf

16. Resultados
Análise morfológica - 5 dpf

17. Materiais e Métodos
Teste de locomoção – 7 dpf
• ANY-maze
– Tempo de duração do teste 10
min.
– Total da distância percorrida.
– Velocidade média.
– Tempo Total móvel e imóvel.

18. Resultados
Teste de locomoção – Larvas 7 dpf

19. Resultados
Taxa de sobrevivência 0 – 7 dpf
Relação ao controle
Diminuição:
 DPCPX (9,91-17,7%)
 ZM (1,4-28,6%)
 Dipiridamol (14,5-26,8%)
 AMPCP (21,3-55,0%).
O controle injetado apresentou um
aumento de 8,55%.

20. Conclusão
• Comprimento total AMPCP 1 mg, aumentou.
• DPCPX 0,05 e 0,01; AMPCP 1,5 mg aumentou.
• Comprimento total e Superfície Ocular de larvas com MO, não tiveram
diferença.
• Análise morfologica – as doses de AMPCP e Cafeína 0,5 mg
apresentaram edema pericárdico.
• Análise morfológica MO – 5’ NT apresentaram edema pericardíaco.
• Análise morfológica MO - CNT2 e A1 apresentaram cauda retorcida.
 Taxa de sobrevivencia - DPCPX , ZM Dipiridamol e AMPCP diminuição.

21. Perspectivas
• A padronização da técnica do uso de MO em nosso Laboratório para o
estudo de knockdowndos alvos moleculares aqui descritos.
• A comparação entre as intervenções farmacológicas e gênicas no
sistema adenosinérgico em fases iniciais do desenvolvimento.