1. O documento descreve a síntese de nanoestrelas de ouro e sua funcionalização com tirosinase para desenvolvimento de biosensores. 2. As nanoestrelas de ouro são sintetizadas usando sementes de ouro funcionalizadas com PVP e crescimento controlado variando a concentração de ouro e sementes. 3. A funcionalização das nanoestrelas é realizada com tirosinase e compostos orgânicos como CALNN e 11-MUA para estabilizar as partículas e permitir a ligação da

1. PREPARAÇÃO DE NANOBIOCONJUGADOS DE
NANOESTRELAS DE OURO E TIROSINASE PARA
DESENVOLVIMENTO DE SENSORES
Rui Pedro Fernandes Ribeiro
Orientadora: Prof.ª Doutora Eulália Pereira
Coorientadora: Mestre Leonor Soares
Julho 2013

2. Introdução
Nanotecnologia: um campo multidisciplinar!
Bionanoconjugados
nanopartículas com biomuléculas
adsorvidas à superfície tornando-a
mais biocompatível.
Biossensores e Bioremediação
imagem adaptada de http://nanotech.ica.ele.puc-rio.br/nano_introducao.asp

3. Sumário
1. Síntese de núcleos de crescimento;
2. Síntese de Nanoestrelas;
3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas;
4. Funcionalização de nanoestrelas;
5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase.

4. 1. Síntese de núcleos de de crescimento
Funcionalização com PVP:
• 60 moléculas / nm2
N O
H
H
n
Diâmetro médio
13,71 ± 1,52 nm
10 12 14 16 18 20 22
Diâmetro (nm)
Contagem
0 20 40 60 80 100 120 140
A450nm ⁄ ASPR T.E.M D.L.S. Potencial ζ
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
300 400 500 600 700 800
(nm)
AuNPs 14,3 nm 13,7 ± 1,5 nm 16,0 ± 3,6 nm - 45 ± 19 mV
AuNPs + PVP 19,1 nm - 18,7 ± 1,4 nm - 37,2 ± 13 mV
0
Abs
AuNPs
AuNPs + PVP

5. 2. Síntese de Nanoestrelas
Método de Liz-Marzán
Reagentes
• Percursor metálico: HAuCl4
• Agente Redutor: DMF
• Agente de Revestimento: PVP
• Núcleo de Crescimento (NP-PVP)

6. 2. Síntese de Nanoestrelas
1
0.8
0.6
0.4
0.2
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
Cfg1
Cfg2
Cfg3
Cfg4
1
0.8
0.6
0.4
0.2
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
Racio 9
Rácio 11
Rácio 15
Espetro de extinção de AuNSs (rácio 9) sintetizadas com
diferentes tamanhos de seeds:
• Cfg1 - 19,3 nm
• Cfg2 - 18,9 nm
• Cfg3 - 17,9 nm
• Cfg4 - 15,9 nm
Espetro de extinção de AuNSs sintetizadas com seeds
Cfg3 em diferentes rácios.

7. 2. Síntese de Nanoestrelas
Racio 9 Racio 11 Racio 15
AuNSs Calculado T.E.M.
Rácio 9 38,8 nm 36,1 ± 6,05 nm
Rácio 11 41,2 nm 39,7 ± 5,30 nm
Racio 15 45,3 nm 47,6 ± 9,09 nm
Schematic representation imagem adaptada de of Rodríguez-a 4-fold Oliveros nanostar, et al., with 2012.
two relevant symmetry
plane ! where the number of tips is varied and the polarization plane . (b)

8. 2. Síntese de Nanoestrelas
0.25
0.245
0.24
400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Abs
AuNSs (DMF)
AuNSs (Etanol)
AuNSs (Água)
395 400 405 410
0.235
Diâmetro (nm)
Contagem
20 30 40 50 60 70 80
0 20 40 60 80
Diâmetro médio
50,25 ± 8,53 nm
Síntese de uma solução stock de 120 mL de AuNSs
Espetro de extinção de AuNSs antes e após as
lavagens.

9. 3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas
1
0.8
0.6
0.4
0.2
Espectros de extinção de AuNSs após a variação do pH e da força iónica.
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
pH 3
pH 5
pH 6,45 (neutro)
pH 7
pH 8
pH 9
pH 10
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
sem sal
27 mM
55 mM
110 mM
145 mM
182 mM
Espetro de extinção de AuNSs variando o pH
numa gama entre 3 e 10.
Espetro de extinção de AuNSs variando a força
iónica pela adição de NaCl.

10. Estabilidade com NaCl
3. Estudos de estabilidade coloidal Estabilidade com Na dCel n anoestrelas
Imagens T.E.M.* de AuNSs após a adição de NaCl
AuNS
3/4 nm NaBH4 seeds
AuNS
3/4 nm NaBH4 seeds
NaCl
AuNS
3/4 nm NaBH4 seeds
0 M 0,5 M 3 M
0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl
0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl
0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl
Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão
lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!)
mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda?
Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão
lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!)
mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda?
Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão
lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!)
mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda?
* Imagens T.E.M. cedidas gentilmente pela Mestre Leonor Soares

11. 4. Funcionalização de nanoestrelas
Determinação da concentração e área
Permissas
superficial das AuNSs
1.A reação de síntese de AuNSs é completa.
2.O ouro adicionado distribui-se igualmente por todas as partículas.
3.Crescimento esférico.
Esta equação prevê o raio final da
partícula (esférica) após o seu
crescimento.

12. 4. Funcionalização de nanoestrelas
Funcionalização com CALNN e 11-MUA:
• 6 moléculas / nm2
HS N
H
H
N
NH2
O NH2
O
N
H
O
O
H
N
O
OH
OH
O
O
NH2
Cis Ala Leu Asn Asn
O
SH OH
CALNN 1 CALNN 2 MUA 1 MUA 2
Potencial ζ inicial / mV - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0
Potencial ζ após / mV -33,03±24,9 -19,87±29,6 -9,00±10 -10,93±10,7
Potencial ζ (6dias) / mV -15,67 ±12,2 -21,97±21,8
- -
Potencial ζ 10mL / mV
-33,47 ±26,8 -29,13±30,4
- -
CALNN
11- MUA

13. 4. Funcionalização de nanoestrelas
1
0.8
0.6
0.4
0.2
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
AuNPs
AuNPs + CALNN
AuNPs + CALNN (pH 3,80)
0.8
0.6
0.4
0.2
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
AuNPs
AuNPs + CALNN
AuNPs + CALNN (pH 3,85)
AuNPs + CALNN (após 6 dias)
AuNPs + 11-MUA
AuNPs + 11-MUA (pH 3,82)
Espect ro de ext inção de 1,5 mL AuNSs
funcionalizadas antes e após a diminuição do pH.
Espectro de extinção de 10 mL de AuNSs
funcionalizadas antes e após a diminuição do pH.

14. 5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase
tirosinase de Agaricus bisporus
(PDB - 2Y9W)
• Massa atómica : 119500 Da
• Raio: 3,25 nm
• Diâmetro: 6,50 nm
195 enzimas por partícula
(1,6 ng / mL de AuNSs)

15. 5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase
0 100 200 300 400 500 600
TYR (μL)
0
-5
-10
-15
-20
-25
Potencial % (mV)
100
80
60
40
20
Diâmetro médio (nm)
Potencial %
D.L.S.

16. Considerações Finais
Conclusões:
• A centrifugação diferencial de seeds permite um maior controlo do tamanho e forma final de AuNSs e
uma maior reprodutibilidade;
• As AuNSs são estáveis numa gama de pH entre 3 e 10
• A diminuição do pH permite ter uma ideia se a funcionalização ocorreu;
• A AuNSs são passíveis de serem funcionalizadas.
Perspetivas futuras:
• Verificar a funcionalização por técnicas mais sensíveis (XPS);
• Estudar a influência do NaCl na alteração das forma das AuNSs;
• Realizar estudos aprofundados sobre interação entre as AuNSs e a tirosinase:
‣ Alterar as concentrações do tampão;
‣ Alterar as concentrações de enzima.