O documento descreve uma pesquisa sobre microdeleções nas regiões cromossômicas 22q11.2 e 8q23.1 em pacientes com malformações cardíacas conotruncais. Foram analisados 69 pacientes e encontrados 8 com deleção 22q11.2, sendo 3 sindrômicos e 5 não sindrômicos. O estudo correlacionou os achados clínicos e laboratoriais para caracterizar os tipos de malformações cardíacas e anomalias associadas.

1. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
“Investigação de Microdeleções das Regiões
Cromossômicas 22q11.2 e 8q23.1 em Pacientes com
Malformações Cardíacas Conotruncais”
Aluna:Viviana Rita Rodríguez
Orientador: Prof. Dr. João Monteiro de Pina Neto
Ribeirão Preto
2008
________________________________________________________________Resumo

2. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
“Investigação de Microdeleções das Regiões
Cromossômicas 22q11.2 e 8q23.1 em Pacientes com
Malformações Cardíacas Conotruncais”
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Genética.
Aluna:Viviana Rita Rodríguez
Orientador: Prof. Dr. João Monteiro de Pina Neto
Ribeirão Preto
2008
________________________________________________________________Resumo

3. A minha mãe.
________________________________________________________________Resumo

4. AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. João Monteiro de Pina Neto por ter me acolhido no laboratório e pela
dedicação a mim concedida durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos pacientes e suas famílias por fazer possível e dar sentido a esta pesquisa.
À Daniela, Maria e Ana, pelo auxilio técnico incondicional brindado durante tudo o
doutorado.
Ao médico Charles Marques Lourenço, à estagiária Polyana Tiozzoto e a Renata
Aquino, da Sta. Casa de Araraquara, pela participação ativa no presente trabalho.
Aos médicos residentes do serviço de genética do HCMRP que contribuíram no
diagnóstico clínico dos pacientes.
Aos Dr. João Antônio Granzzotti e Victor Evangelista Ferraz pelo incentivo,
disponibilidade e assistência inestimável.
Aos meus queridos companheiros de pós-graduação, em especial a Liliam, Marcelo,
Yara, Daniela, Analía, Ricardo, Aline, Diana.
Aos técnicos do laboratório, Luis Fernando, Daniela e Marcos.
A minhas amigas, Analía, Fernanda, e Lorena que mesmo longe sempre estão presentes,
incentivando-me e fazendo com que a distância não seja uma carga tão pesada.
Às secretárias do Departamento de Genética, Cleusa, Maria Aparecida e Susie.
A CNPQ, CAPES, FAEPA, PCARP/USP e secretaria do departamento pelas bolsas e
auxílios concedidos
________________________________________________________________Resumo

5. INDICE
1. RESUMO......................................................................................................................1
2. ABSTRACT..................................................................................................................2
3. INTRODUÇÃO.............................................................................................................3
4. OBJETIVOS................................................................................................................9
5.CASUÍSTICA E MÉTODOS...................................................................................10
3.1 CASUÍSTICA...........................................................................................................10
3.2. MÉTODOS..............................................................................................................10
3.2.1. Métodos Clínicos..............................................................................................10
3.2.2. Métodos Citogenéticos......................................................................................11
3.2.3. Métodos Moleculares........................................................................................13
6. RESULTADOS.....................................................................................................19
7. DISCUSSÃO.........................................................................................................31
5.1. O Protocolo clínico e a Síndrome da Microdeleção 1p36...................................31
5.2. Correlação clínico-laboratorial............................................................................32
8. CONCLUSÕES....................................................................................................34
7. RESUMO...............................................................................................................35
ANEXOS....................................................................................................................41
________________________________________________________________Resumo

6. 1. RESUMO
As patologias cardíacas congênitas afetam cerca de 5.1 de cada 1000 crianças
nascidas vivas, constituindo uma das anomalias congênitas maiores mais comuns
em humanos. As malformações cardíacas conotruncais correspondem a 50-60% das
malformações cardíacas observadas durante o período neonatal e ocorrem com uma
freqüência aumentada em síndromes associadas com microdeleções da região
cromossômica 22q11.2. O propósito deste estudo é descrever a prevalência e o
espectro clínico das monossomias 22q11.2 e 8p23.1 em uma amostra de 69
pacientes a maioria deles do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) apresentando
malformações cardíacas conotruncais. Para isto se utilizaram marcadores de
microsatelites (Short Tandem Repeat) para a região de 1,5Mb, de 3Mb e para
regiões onde a deleção 22q11 é pouco freqüente e para o cromossomo 8 foram
pesquisados marcadores correspondente á região crítica 8p23. Foram encontrados 8
pacientes positivos para a deleção, três deles sindrómicos, três não sindrómicos e
dois com cardiopatia não conotruncal um com características extracardíacas da
síndrome da deleção 22q11.2 e outro não. Foi analisado o tipo de malformação
cardíaca e a presença ou ausência de anomalias extracardíacas detectáveis no exame
morfológico e em exames subsidiários.
________________________________________________________________Resumo

7. 2. ABSTRACT
Congenital cardiac patologies affect about 5.1 of each 1000 live birth, constituting one
of more common congenital anomalies in human beings. Conotruncal cardiac
malformations correspond to 50-60% of the observed cardiac malformations during the
neonatal period and occur with a frequency increased in syndromes associates with
microdeletions of the chromosomic region 22q11.2. The intention of this study is to
describe the prevalence and the clinical variability of the 22q11.2 and 8p23.1
monosomy in a sample of 69 patients the majority of them of the Hospital of the Clinics
College of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (HCFMRP-USP) being
presented conotruncais cardiac malformations. For this we had used polymorphic
markers (Shorts Tandem Repeat) for the region of 1,5Mb, 3Mb and for regions where
the deleção 22q11 is little frequent and on chromosome 8 we used markers
correspondent to the critical region 8p23. eight positive patients for 22q11.2 deletion
had been found, three of them had extra cardiac anomalies, three of them without
dimorphic characteristics and two with not conotruncal cardiopathy one with extra
cardiac characteristics of 22q11.2 microdeletion syndrome and another one not. The
type of cardiac malformation and the presence or absence of detectable extracardiac
anomalies in the morphologic examination and subsidiary examinations were analyzed.
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8. 3. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações Gerais
As cardiopatias congênitas constituem a classe mais freqüente de defeitos ao
nascimento. Sua investigação foi beneficiada nas últimas décadas pelo desenvolvimento
de métodos diagnósticos e terapêuticos (GELB, 2000) fazendo com que estes achados
cardíacos fossem se incrementando ao longo dos anos. Em 1985, FERENCZ, et al.
concluíram que as anomalias maiores ocorriam em aproximadamente 0,8 a cada 1000
nascidos vivos, observando-se posteriormente em 1 a cada 1000 deles (MALONE,
1988; BURN & GOODSHIP, 1996; BELMONT, 1998; SADLER, 2000).
Investigações posteriores elevaram ainda mais o número de patologias cardíacas
congênitas observadas, evidenciando uma prevalência de aproximadamente 5,1 a cada
1000 crianças nascidas a termo e 12,5 a cada 1000 nascidas pré-termo (TANNER, et al.,
2005) representando uma importante causa de mortalidade na infância.
As malformações cardíacas abrangem aproximadamente 25% de todas as malformações
congênitas. Comumente são observadas como malformações isoladas (80-90%),
entretanto há também pacientes que apresentam malformações extracardíacas que
geralmente envolvem o sistema musculoesquelético (9%), sistema nervoso central (8%),
trato urinário ou rins (5%) ou trato gastrintestinal (4%), e 1,8% tem fissura palatina
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9. (MUSTACCHI, 2006). Em algumas síndromes, tipos específicos de cardiopatia
congênita estão representados em excesso quando comparados a sua incidência na
população geral (GOLDMUNTZ et al., 1993).
Segundo CUNHA PONTES JUNIOR (2006) quando mais grave for a cardiopatia
congênita, mais precoce será sua manifestação clínica, sendo esta detectada comumente
nos períodos de mudanças hemodinâmicas do dia zero até os doze meses.
O ultra-som se mostrou uma importante ferramenta para o diagnóstico pré-natal de
malformações cardíacas. Os primeiros estudos foram feitos na vigésima semana da
gestação, porém SLEURS, et al., 2004 observaram melhores resultados no final do
primeiro trimestre, analisando dois pacientes com síndrome agenesia de válvula
pulmonar e tetralogia de Fallot, sendo um deles portador da deleção 22q11. No mesmo
ano, MOORE, et al., (2004) observaram del 22q11.2 em 3% dos pacientes com
cariótipo normal cujo defeito cardíaco foi observado pelo ultra-som. Ao contrário do
que se poderia esperar, a translucência nucal aumentada não é indicadora de deleção
22q11.2, não sendo observada em nenhum dos pacientes estudados (DONNENFELD, et
al., 2006). Estes autores salientam a importância da detecção precoce das malformações
cardíacas, responsabilizando as mesmas por mais de 60% das mortes perinatais.
1.2. Origem das cardiopatias
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10. As cardiopatias congênitas ocorrem normalmente como malformações esporádicas e de
etiologia multifatorial. Cerca de 10% estão associadas com síndromes clínicas definidas
podendo ser autossômicas dominantes, recessivas ou ligadas ao sexo, 5-8% resultam de
anormalidades cromossômicas; 3-5% são defeitos gênicos isolados e 2-3% relacionam-
se a fatores ambientais (MUSTACCHI, 2006).
Durante o período embrionário, entre o vigésimo e o qüinquagésimo dia após a
fertilização, tem início a formação do sistema circulatório. Neste período, as células
progenitoras do coração migram do mesoderma esplênico à região cefálica do embrião
(MOORE & PERSAUD, 2004).
Na quarta semana de gestação, o disco embrionário se dobra e as extremidades do tubo
primitivo se unem, formando um tubo cardíaco ventral. Pequenas constrições na parede
do tubo darão origem às câmaras primitivas: seio venoso, átrio primitivo, ventrículo
primitivo, cone e tronco arterioso. O dobramento do tubo à direita cria uma assimetria
esquerda direita, levando à orientação espacial própria das câmaras e ao correto
alinhamento dos tratos de saída do coração. O canal atrioventricular é separado nos
canais direito e esquerdo. Os átrios e ventrículos comuns são separados pela formação
dos septos interatrial e interventricular, respectivamente (MOORE & PERSAUD, 2004;
MUSTACCHI, 2006, SADLER, 2000,).
No embrião de 5 semanas, pares de cristas opostas aparecem na região do cone e tronco
arterioso e, futuramente, formarão o septo aórtico-pulmonar (SADLER, 2000).
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11. As patologias podem ser agrupadas em seis classes de acordo com alterações nas etapas
do desenvolvimento cardíaco (CLARK, 1996):
1) defeitos de dobramento;
2) defeitos de matriz extracelular (de septação do canal atrioventricular);
3)defeitos de crescimento do tecido alvo (anomalias de retorno nas veias pulmonares
levando a um crescimento do átrio);
4) morte celular programada;
5) fluxo sanguíneo alterado (hipoplasia de câmaras) e
6) defeitos de migração do tecido ectomesenquimal (células da crista neural), que por
sua vez podem ser subdivididos em nomalias conotruncais, posição anormal do coxim
conotruncal e defeitos dos arcos faríngeos.
As células da crista neural originam o septo da região conotruncal. Essas células
participam também na formação dos quarto e sexto arcos faríngeos os quais antecedem
a formação das estruturas da face e da região cervical. Essa origem embrionária comum
pode ser evidenciada na associação com essas estruturas em diversas síndromes como,
por exemplo, na síndrome da deleção 22q11.2 (MOORE & PERSAUD, 2004).
1.3. Malformações cardíacas conotruncais
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12. As malformações cardíacas conotruncais incluem comunicação interventricular (CIV),
atresia pulmonar com comunicação interventricular (AP+CIV), truncus arteriosus (TA),
interrupção do arco aórtico tipo B (IAA,B), tetralogia de Fallot (TF), dupla via de saída
do ventrículo direito (DVSVD), transposição de grandes artérias (TGA) e malformações
do arco aórtico (DI GILIO, et al., 2005 & GELB, 2000). Essas malformações
conotruncais correspondem de 50 ao 60% das malformações cardíacas observadas
durante o período neonatal, comprometendo o desenvolvimento das vias de saída do
coração e envolvendo anomalias do arco aórtico (BONNET et al., 1997; ISERIN et al.,
1998).
A CIV representa o defeito cardíaco congênito mais freqüente (25%), podendo ocorrer
tanto na parte membranosa como na parte muscular do septo. Com base nos limites de
suas bordas, as CIVs foram classificadas em três grupos: CIVs observadas na área do
septo membranoso foram chamadas de CIVs perimembranosas, que encontram-se na
região anterior do coração e são somente estas consideradas de origem conotruncal; as
completamente circundadas por músculo foram chamadas CIVs musculares, e aquelas
localizadas na área do septo subjacente às valvas arteriais, as quais formam o teto do
septo interventricular, foram chamadas de CIVs justa-arteriais duplamente relacionados
(MOORE & PERSAUD, 2004 & CARMELO SILVA, M.C.,2006).
A AP é uma condição em que existe uma abertura entre a aorta e o tronco pulmonar
próximo à válvula aórtico-pulmonar (MOORE & PERSAUD, 2004).
________________________________________________________________Resumo

13. O TA é conseqüência da deficiência das cristas do tronco e do septo aórtico pulmonar
em se desenvolver normalmente e dividir o tronco arterial em aorta e tronco pulmonar,
representando um único tronco arterial que supre as circulações sistêmica, pulmonar e
coronária (MOORE & PERSAUD, 2004).
A IAA é uma malformação incomum consistente na ausência total de continuidade
anatômica e luminal entre os segmentos do arco aórtico. Dificilmente ocorre como
anomalia isolada, freqüentemente é acompanhada por persistência do canal arterial
(PCA) ou CIV. O IAA,B é de origem conotruncal e é determinada pela obstrução no
nível do segmento entre a emergência da artéria carótida comum esquerda e a
emergência da artéria subclávia esquerda (BARIONI BEMBOM & DOS SANTOS,
2006).
A TF consiste em quatro achados clínicos simultâneos: estenose pulmonar (obstrução
do fluxo do ventrículo direito), defeito do septo ventricular, dextroposição da aorta e
hipertrofia do ventrículo direito (MOORE & PERSAUD, 2004).
O termo DVSVD deve ser empregado para um tipo anômalo de conexão ventrículo-
arterial em que mais da metade de ambos os orifícios sigmóides estejam conectados
com o ventrículo morfologicamente direito. Não é uma malformação isolada, devendo
ser analisada levando-se em conta a posição das grandes artérias em associação com
diferentes defeitos cardíacos comportando-se fisiologicamente como CIV, TGA, TF,
ventrículo único ou atresia atrioventricular (BOSISIO, et al., 2006).
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14. A TGA está tipicamente representada pela localização anterior da aorta à direita do
tronco pulmonar e se origina anteriormente ao ventrículo direito. É ocasionada
possivelmente pela interrupção do prosseguimento do septo aórtico-pulmonar, em um
curso espiral durante a septação do bulbo cardíaco e do tronco arterial, podendo causar
um desenvolvimento anormal do cone arterial durante a incorporação do bulbo cardíaco
aos ventrículos (MOORE & PERSAUD, 2004).
Os defeitos cardíacos conotruncais são achados de grande importância clínica e estão
presentes na síndrome de deleção 22q11.2. As síndromes derivadas dessa deleção
possuem sinais clínicos que se sobrepõem e serão abordadas em separado.
1.4. Síndromes da deleção 22q11
A incidência de deleções em 22q11.2 tem variado de 1 em 5950 nascidos vivos
(BOTTO et al., 2003) a 1-2,3 em cada 1000 da população geral (NATHANIEL, et al.,
2005, KYBURZ, et al., 2008). Ela se encontra em 90% dos pacientes com SDG, em
81% dos pacientes com SVCF e em 84% de pacientes com SACF (BURN, et al.;
DRISCOLL, et al.; GOLDMUNTZ, et al.; HALL, et al. & WILSON , et al., 1993,
DEMCZUK et al.; KURAHASHI, et al. & MATSUOKA et al., 1994; TAKAHASHI, et
al., 1995, MOMMA, et al. & WULFSBERG, et al., 1996; BONNET, et al.; CARLSON,
et al. & RYAN, et al., 1997, BELMONT; DEVRIENDT, et al., MATSUOKA, et al. &
RAUCH, et al., 1998; BURN, et al., 1999; EDELMANN, et al., 1999a; MORAVA, et
________________________________________________________________Resumo

15. al. & SCAMBLER, 2000). Estas estatísticas confirmam a hipótese de que a deleção
22q11.2 tornou-se o denominador causal comum para síndromes historicamente
separadas (FOKSTUEN et al., 1998).
Inicialmente consideradas síndromes diferentes, atualmente se classificam como
variações do espectro clínico da deleção 22q11.2 as Síndrome de DiGeorge (SDG),
Síndrome Velocardiofacial (SVCF) e de Síndrome de Anomalias Faciais e Conotruncais
(SAFC), apresentando sobreposição de fenótipo e expressividade variável
(McDONALD-GINN et al., 1999).
A literatura relata uma grande variabilidade fenotípica na segregação da deleção
22q11.2 e esses três fenótipos podem ser vistos em uma mesma família, encontrando
pais com características da SVCF que têm filhos diagnosticados como DGS (HOLDER
et al., 1993; MORROW et al., 1995). Isto levou WILSON et al. (1993) a propor o
acrônimo CATCH22 (anomalia cardíaca com face anormal, déficit de células t como
conseqüência da hipoplasia do timo, fenda palatina e hipocalcemia devido a
hipoparatireoidismo resultante de deleção de 22q11), discordando com SHPRINTZEN
que, em 1978, fez a objeção de que a SVCF e a SDG fossem agrupadas numa mesma
entidade, argumentando que não havia evidências válidas de que a SVCF fosse
heterogênea, enquanto que a SDG o era.
O espectro de características clínicas da deleção 22q11 foi definido rigorosamente em
um estudo colaborativo europeu (RYAN et al., 1997), no qual 72% dos pacientes
________________________________________________________________Resumo

16. possuíam deleções de novo, enquanto que o restante apresentava deleções herdadas.
Vinte e cinco por cento dos pacientes não tinham anomalias cardíacas ou tinham
anomalias sem repercussão (por exemplo, arco aórtico à direita isolado).
BURN (1999), um dos que propuseram originalmente o acrônimo CATCH22, revisou a
discussão da nomenclatura. Ele propõe que o termo SDG fosse reservado para aqueles
casos com apresentação neonatal, particularmente com hipoplasia/aplasia do timo e
hipocalcemia, e que a designação SVCF fosse usada para crianças com apresentação
dominada por fala nasal devido a insuficiência velopalatal. Ele também sugeriu que a
síndrome de SACF fosse substituída por síndrome de Takao (ST) e coloca em questão o
termo “síndrome de deleção 22q11”. Finalmente, este autor propôs que o “fenótipo
CATCH” poderia ser usado em lugar de CATCH22 e que o acrônimo representaria
anormalidade cardíaca, deficiência de células T, fenda palatina e hipocalcemia. No
entanto, como essas síndromes têm sido associadas à presença da microdeleção da
banda q11.2 do cromossomo 22 (TAKAHASHI et al., 1995; WULFSBERG et al., 1996;
GELB, 2000) atualmente, prefere-se o uso do termo “síndrome da deleção 22q11.2”
(McDONALD-Mc GINN et al., 1999).
1.4.1 Síndrome de DiGeorge
A SDG (OMIM#188400) é um defeito do campo do desenvolvimento envolvendo o
terceiro e o quarto arcos faríngeos. Supõe-se que a migração anormal de células da
________________________________________________________________Resumo

17. crista neural para os derivados dos arcos e bolsas faríngeas seja responsável pelo
fenótipo (BUDARF et al., 1995).
Inicialmente descrita por DiGeorge em 1965, esta síndrome apresentou-se em uma
criança com hipoparatireoidismo e infecções recorrentes. Os pacientes apresentam no
período neonatal hipocalcemia devido à aplasia ou hipoplasia da glândula paratireóide,
o que pode levar à tetania e a convulsões. Outros sinais clínicos são: suscetibilidade à
infecções, devido à deficiência de células T, resultante de aplasia ou hipoplasia do timo
e malformações cardíacas, principalmente as conotruncais (TAKAHASHI et al., 1995;
GELB, 2000).
VAN MIEROP & KUTSCHE (1986) delinearam as malformações cardíacas em um
estudo de 161 necrópsias de pacientes com SDG. Eles encontraram AAI,B em 32%, TA
em 23%, TF em 21%, CIV isolada em 6%, arco aórtico direito isolado em 5%, TGV em
4%, ductus arteriosus patente em 3%, outras lesões em 6% e ausência de malformações
cardíacas em 3% (GELB, 2000).
Outros achados clínicos podem ser observados nesses pacientes como anomalia de
grandes vasos, micrognatia, anomalias auriculares, anomalias da face e da tiróide
(DRISCOLL et al, 1992, DRISCOLL, 1994; McDONALD-McGINN et al., 1999).
1.4.2. Síndrome velocardiofacial
________________________________________________________________Resumo

18. A SVCF (OMIM#192430) foi caracterizada em princípio por SHPRINTZEN em 1978.
As principais manifestações clínicas observadas são anormalidades do palato,
representadas por fendas palatinas completas ou submucosas, insuficiência velo-palatal
associada à fala hipernasal, dismorfias faciais incluindo raiz nasal quadrada com base
alar estreita, retrognatia, hipoplasia de face média e malformações cardíacas
(GOLDMUNTZ et al., 1993; GELB, 2000).
A SVCF teve sua freqüência estimada em 1 em 4000 nascidos vivos (BURN &
GOODSHIP 1996). Na maioria dos casos, apresenta-se em forma esporádica, mas,
quando herdada, apresenta um padrão de herança dominante (CARLSON et al., 1997).
As anomalias cardíacas estão presentes em 81-85% dos pacientes com SVCF e incluem
CIV em 56% dos pacientes, especialmente defeitos septais ventriculares septais conais,
TF em 19% e arco aórtico direito isolado em 11% (YOUNG et al., 1980). Apresenta,
assim, uma sobreposição clínica com a SDG.
1.4.3. Síndrome de Anomalias Faciais e Conotruncais.
No ano 1980, dois pesquisadores japoneses descreveram independentemente um
fenótipo reconhecível, compreendendo uma variedade de anomalias da via de saída
cardíaca e face característica com hipertelorismo, telecanto, ponte nasal baixa, fendas
palpebrais estreitas, pálpebras inchadas, voz nasalada e anormalidades menores das
________________________________________________________________Resumo

19. orelhas (KINOUCHI, 1980; TAKAO, 1980). Esta desordem ficou conhecida como
Síndrome de Anomalia Conotruncal Face (OMIM#217095).
Alguns desses pacientes também apresentam hipocalcemia, especialmente no período
neonatal (algumas vezes associado com hipoparatireoidismo) e aplasia ou hipoplasia do
timo (BURN et al 1993; MATSUOKA et al., 1994; 1998).
2.8. Alterações cardíacas conotruncais em pacientes com deleção 22q11.2.
A deleção 22q11.2 é observada em 1,5% dos pacientes com defeitos cardíacos
congênitos na população geral (BOTTO, et al., 2003) No entanto, alguns pesquisadores
consideram que ainda não está bem definida, como também não está claro qual
característica cardiovascular particular está relacionada com a deleção nos pacientes
com defeitos cardíacos congênitos (ZIOLKOWSKA et al., 2007).
Defeitos cardíacos congênitos são observados em 75-95% dos pacientes com deleção
22q11, e os mais freqüentes, chegando até 63%, são os conotruncais, incluindo CIV,
AP+CIV, TA, IAA,B, TF, DVSVD e TGA (BOTTO, et al., 2003 & ZIOLKOWSKA,
et al., 2007).
O estudo específico do “fenótipo cardíaco” em pacientes com deleção 22q11 mostra que
pode ser identificada uma anatomia particular e que pacientes com defeitos cardíacos
________________________________________________________________Resumo

20. conotruncais têm, freqüentemente, defeitos cardíacos adicionais como padrão de
reconhecimento (DIGILIO, et al., 2005) como também podem apresentar características
dismórficas e anomalías menores em 80% dos casos analisados (BOTTO, et al., 2003).
Foram também observadas em 7–11 % de pacientes não sindrômicos (BOTTO, et al.,
2003), mas sua exata prevalência permanece desconhecida. Numerosos estudos não
encontraram deleções em casos de defeitos cardíacos congênitos conotruncais isolados.
Uma possível explicação é que essa característica ocorra em menos do 10% dos
pacientes com a deleção e que os critérios clínicos e laboratoriais na seleção dos
marcadores moleculares variam grandemente. Por outro lado, pacientes que foram
diagnosticados como portadores de malformações cardíacas conotruncais isoladas
poderiam atualmente se classificar como sindrômicos (VOIGT, et al., 2002).
A pesar de saber-se que os defeitos cardíacos congênitos conotruncais são comuns em
crianças com del 22q11.2, pouco se sabe da freqüência da deleção 22q11.2 em pacientes
com defeitos conotruncais. Em 2007, ZIOLKOWSKA, et al., relataram que a del
22q11.2 estava presente em 7% dos casos de anomalias conotruncais por eles estudados.
Dados da literatura mostram que a deleção ocorre em 20-30% dos casos com TA, 7,6-
40% dos casos com TF-AP/CIV. Também é observado o fato que IAA,B não ocorre em
crianças sem del 22q11, confrontando dados anteriores sugere uma forte relação entre
esta anomalia e a deleção.
Fazendo uma análise retrospectiva da relevância de uma anatomia cardíaca específica
em pacientes com deleção 22q11, podemos mencionar o primeiro estudo colaborativo
europeu que analisou 558 pacientes portadores da deleção 22q11, observando 36%
________________________________________________________________Resumo

21. deles com TF, 19% com CIV, 19% com IAA,B e 12% com TA (RYAN et al., 1997).
Um ano depois, usando a técnica de FISH, a deleção foi encontrada em 50% dos
pacientes com IAA,B, em 34% dos pacientes com TA e em 15% de pacientes com TF
(GOLDMUNTZ, et al., 1998). São raros os casos com TGA relatados, enquanto que
uma prevalência aumentada de duas anomalias anatômicas incomuns, a má posição do
ramo das artérias pulmonares e o arco aórtico cervical, tem sido associada com deleções
22q11. No mesmo estudo em 251 pacientes apresentando malformações conotruncais,
os autores relataram que 18% dos pacientes tinham deleções de 22q11 quando
analisados com FISH (GELB, 2000).
Esses achados têm sido alvo de novas pesquisas, assim DIGILIO, et al. (2005)
encontraram 26% com TF, 24% com AP+CIV, 19% com CIV, 10% com IAA,B e 10%
de TA nos 136 pacientes por eles analisados. Porém, KHOSITSETH, et al., (2005)
observaram, em 61 pacientes, 100% com IAA,B, 50% com TA, 33,3% com AP+CIV e
3,1% com TF, freqüências bem desiguais quando comparadas às anteriores. No entanto,
outro estudo mostra que de 49 criaças portadoras da deleção se observa 44,9% com TF,
20,4% com IAA,B, 16,3% com CIV e 12,2% com TA revelando, assim, uma grande
heterogeneidade nas freqüências das manifestações cardíacas conotruncais nos pacientes
com deleção 22q11 (KYBURZ, et al., 2007). A TF se apresenta como a manifestação
mais relevante encontrada em 27% dos 222 casos analisados com deleção 22q11.2 em
um estudo realizado na Coréia. Eles observaram uma maior freqüência dessa anomalia
em pacientes asiáticos em relação aos caucasianos, concordando assim com estudos
________________________________________________________________Resumo

22. anteriores (MOMMA, K, 2006). Nesses quatro trabalhos, as anomalias extracardíacas
estiveram presentes na maioria dos pacientes analisados.
Em um estudo em 104 pacientes, BEAUCHESNE et al. (2005) encontram poucos
adultos com o fenótipo da microdeleção 22q11, e sugerem que eles podem ter
dificuldades de aprendizado, desordens psiquiátricas e anomalias do palato, mas poucas
anomalias cardíacas congênitas observáveis quando comparados com crianças com a
microdeleção. Os adultos relatados foram diagnosticados por essas anomalias cardíacas
observadas quando eram crianças, estes pesquisadores postulam que o adulto que
deveria ser estudado é aquele com doença cardíaca congênita, especialmente anomalia
conotruncal, lesão cardíaca de alto risco e anomalias cardíacas e extracardíacas típicas.
BERELY, (2007), delineando o espectro clínico da SVCF, observou a elevada
prevalência de cardiopatias congênitas conotruncais nos pacientes estudados,
principalmente IAA,B, TA e TF em pacientes com malformações extracardíacas
variáveis, e comenta que, devido a este fato, muitos centros pesquisam para a deleção
22q11.2 quando uma malformação cardíaca congênita conotruncal é encontrada.
O estudo de WEBBER, et al., em 1995 propõe que somente pacientes dismórficos com
malformações cardíacas conotruncais requerem triagem por técnicas de citogenética
molecular ao apresentar uma análise retrospectiva que 9 de 17 pacientes dismórficos
com malformações conotruncais tinham deleções 22q11, enquanto que nenhum paciente
dos 19 não dismórficos analisados as apresentavam. No entanto, quase
________________________________________________________________Resumo

23. simultaneamente, o trabalho de JOHNSON et al., (1995) indica que deleções 22q11 são
comuns entre pacientes com TF e síndrome da valva pulmonar ausente. No ano
seguinte, DIGILIO et al., (1996) levando em consideração cardiopatia conotruncal
isolada relatou deleções em 6% dos pacientes com TF e estenose pulmonar e em 55%
dos pacientes com TF e atresia pulmonar.
DIGILIO, et al. (2005) geram controvérsias novamente ao sugerir que várias
observações indicam que a deleção 22q11 poderia estar associada com defeitos
cardíacos congênitos não sindrômicos, entretanto 80% desses pacientes classificados
apresentando defeitos isolados têm, de fato, características extracardíacas concordantes
com o fenótipo da síndrome da deleção 22q11 (WILSON, et al., 1991 &
GOLDMUNTZ, et al., 1993). Outras pesquisas têm demonstrado que nunca foram
encontrados pacientes não sindrômicos com defeitos cardíacos congênitos conotruncais
isolados (DREBUS, et al., 1996, AMATI, et al., 1997 e DIGILIO, et al., 1997 a,b
). No
trabalho de DREBUS, et al., (1996), por exemplo, foram estudados 36 pacientes com
defeitos cardíacos congênitos conotruncais isolados pertencentes a 16 famílias com uso
de FISH e técnicas moleculares sem encontrar a deleção.
No entanto, um estudo com 105 pacientes com malformações cardíacas isoladas
analisados por citogenética convencional e FISH na população da Índia, observou
5,71% dos pacientes com deleção 22q11.2, levando aos autores a concluírem que a
análise deve ser feita nestes casos ainda não se tenham observado malformações
extracardíacas ( GAWDE, et al 2006).
________________________________________________________________Resumo

24. RAUCH et al., no 2004, em 23 amostras de tecido cardíaco provenientes de cirurgia,
não observaram evidências de del 22q11.2 somáticas em pacientes com defeitos
conotruncais com ou sem mutação germinal 22q11.2 e concluem que deleções 22q11.2
somáticas em tecidos derivados dos arcos faríngeos não são a causa de defeitos
cardíacos conotruncais.
Os geneticistas pediátricos são os responsáveis por 53,9% dos pedidos de testes para del
22q11.2, tendo estes, em 60,7% resultados positivos quando a TF e o retardo no
desenvolvimento são as principais causas da suspeita dessa deleção (KATZMAN, et al.,
2005). Após a análise de 305 pacientes com malformações cardíacas congênitas
conotruncais isoladas “verdadeiras”, foi encontrado somente um caso positivo para a
deleção. DIGILIO, et al., (2005) sugerem que, na prática clínica, análises genéticas para
a deleção 22q11 não teriam de ser indicadas em todos os pacientes com defeitos
cardíacos congênitos conotruncais, mas sim naqueles com características fenotípicas da
síndrome da deleção 22q11. Sugerem também que as características levemente
representativas da síndrome são uma ferramenta fundamental para a indicar a análise
laboratorial quando combinadas com defeitos cardíacos congênitos conotruncais.
1.5. Anomalias extracardíacas em pacientes portadores da deleção 22q11.2
________________________________________________________________Resumo

25. No ano 2005, NATHANIEL, et al., definiram a deleção 22q11 como a mais variável das
síndromes genéticas conhecidas até agora, com mais de 180 características clínicas
associadas. Eles também observaram duas contradições, na primeira delas pacientes que
têm a mesma deleção podem ter síndromes diferentes como os SVCF, SDG, SACF,
levando a discussões freqüentes entre geneticistas clínicos e moleculares, a outra é a
possibilidade de sevter a síndrome sem a deleção da região 22q11.2.
De fato, sempre foi relatada uma grande variabilidade fenotípica nas famílias nas quais
a deleção 22q11.2 estava sendo segregada. Uma prova disso está é que pais com
diagnóstico de SVCF têm filhos diagnosticados com SDG (HOLDER, et al., 1993 &
MORROW, et al., 1995). Entretanto, considera-se que essas manifestações constituem
um único espectro clínico e que a classificação diagnóstica depende da idade de
apresentação e da manifestação clínica predominante. Embora cada fenótipo mantenha
seu nome estabelecido. Como mencionamos anteriormente, prefere-se o uso do termo
“síndrome da deleção 22q11.2” (McDONALD-McGINN, et al., 1999).
Entre as características descritas para a Síndrome de deleçaõ 22q11.2, NATANIEL, et
al., (2005) consideram importantes os achados craniofaciais, orais, e oculares,
malformações nas orelhas e achados auditivos, malformações nasais, cardíacas e na
vascularização torácica, anomalias vasculares, neurológicas, cerebrais e de ressonância
magnética, manifestações faríngeas, laríngeas e das vias aéreas, anomalias abdominais,
do rins e do intestino, alterações nos membros, problemas na infância como, por
exemplo, dificuldades alimentares e vomito nasal, problemas geniturinários, dificuldade
________________________________________________________________Resumo

26. de fala (voz anasalada), problemas cognitivos e de aprendizado, anomalias psiquiátricas
e psicológicas, imunológicas (aplasia ou hipoplasia do timo e glândulas paratiroides
com anormalidades funcionais das células T), endócrinas (hipocalcemia), problemas
esqueléticos, musculares e ortopédicos, de pele e anomalias menores.
Todas estas características mencionadas anteriormente foram observadas em 1997, por
RYAN, et al., as quais definiram o aspecto clínico da deleção em um estudo com 558
pacientes, no qual 75% deles apresentavam cardiopatia congênita, 68%
desenvolvimento psicomotor anormal, 60% hipocalcemia, 46% palato fendido ou
insuficiência velofaríngea, 36% anormalidades genito-urinária e 17% anormalidades
esqueléticas, entre outras características. Essa freqüência diferedos achados encontrados
por DIGILIO, et al., (2005) (tabela 1) em um estudo com 165 pacientes, possivelmente
devido ao acelerado desenvolvimento dos métodos laboratoriais nos últimos anos.
Anormalidades pouco comuns, como as malformações anorretais, têm sido observadas
nos últimos anos em pacientes com deleção 22q11.2, entre elas observam-se: estenose
anal, ânus imperfurado e, em menor proporção, ânus anteriorizado. São portanto,
achados esporadicamente associados com malformações cardíacas conotruncais. Alguns
pesquisadores sugerem considerá-las como característica de relevância no espectro
clínico da deleção 22q11.2 (WORTHINGTON, et al., 1997, ROSTI, L., 2002,
MUDAFFER, A., et al., 2006 & STOLL, C., et al., 2007).
________________________________________________________________Resumo

27. Tabela 1. Características clínicas em pacientes com deleção 22q11.2. Modificada de
DIGILIO, et al., (2005).
Características clínicas Porcentagem nos pacientes
Anormalidades da face 100%
Defeitos cardíacos congênitos 82%
Dificuldades na fala e do aprendizado 80%
Hipocalcemia neonatal 73%
Deficiência de células T 69%
Anormalidades esqueléticas 32%
Anormalidades no palato 31%
Dismorfismo facial 21%
Malformações renais 15%
Anormalidades genitais 11%
É de especial importância ressaltar a necessidade do diagnóstico precoce dessas doenças
já que as crianças com SVCF apresentam altas proporções de problemas
comportamentais, psiquiátricos, neurofisiológicos e lingüísticos, além de problemas
afetivos e de ansiedade que nos adultos geram graves distúrbios psicóticos,
especialmente esquizofrenia, os quais poderiam ser tratados com antecedência, ou
simplesmente melhorar a qualidade de vida destes pacientes (MURPHY, 2005).
1.6. Deleção 22q11.2
As anormalidades cromossômicas identificadas em uma minoria dos pacientes com
SDG (GELB, 2000) e as translocações balanceadas entre os cromossomos 20 e 22,
resultando em monossomia para 22q11 (DE LA CHAPELLE et al., 1981), foram
cruciais na identificação de potenciais loci genéticos responsáveis por essas desordens.
As técnicas citogenéticas de bandeamento de alta resolução, de hibridação in situ
________________________________________________________________Resumo

28. fluorescente (FISH) e moleculares contribuíram para a identificação da deleção
(CAREY et al., 1992, DRISCOLL et al., 1992, DRISCOLL et al., 1993; DEMCZUK et
al., 1994 e GREENBERG et al., 1988).
O delineamento da extensão das deleções 22q11 de 61 pacientes com SVCF usando
marcadores polimórficos de DNA compreendendo a região comumente deletada,
revelou que 82% dos pacientes tinham deleções de dois marcadores (MORROW et al.,
1995). 97% dos pacientes com SDG/SVCF possuíam a região de 3 Megabases (Mb)
comumente deletada ou uma região crítica menor de 1,5Mb. Ambas deleções ocorrem
aparentemente como resultado de recombinações não alélicas localizadas entre regiões
LCRs (low copy repeats) em 22q11(GELB, et al., 2000). Estes pesquisadores
observaram que a região de 3Mb de deleção é franqueada por LCRs de 250 Kb
contendo genes e pseudogenes. A região menor de 1,5 Mb de deleção compartilhava a
região centromérica de poucas cópias com a deleção de 3 Mb e continha outra região de
repetição de poucas cópias sem quaisquer genes na sua extremidade telomérica.
Também postularam que o fenótipo pode não estar relacionado com o tamanho da
deleção ou, em casos familiais, com a origem parental, o que descartaria um efeito de
imprinting na expressão da SVCF.
O mapeamento dos pontos de quebra nas deleções e translocações balanceadas
definiram uma região crítica de 250 Kilobases (Kb) (MORROW et al., 1995; JAQUEZ
et al., 1997). Entretanto, análises de mutações de genes dentro da região crítica em
pacientes com fenótipo SDG/SVCF sem deleções 22q11 tem sido negativas, o que
________________________________________________________________Resumo

29. levou a DALLAPICCOLA et al (1996) a propor que efeitos posicionais são
provavelmente relevantes na etiologia molecular da SDG/SVCF.
O grupo de MORROW, et al., em 1995, investigou os mecanismos moleculares
subjacentes às deleções de 3 e 1,5 MB em 22q11 (EDELMANN et al., 1999a in
GELB, 2000).
CARLSON et al., (1997) com o intuito de definir a extensão da deleção, utilizou 15
marcadores polimórficos da região 22q11.2 em pacientes com características clínicas da
SVCF. Em 83% dos casos observou-se a deleção, em 90% dos casos a deleção
compreendia a região de 3Mb, sugerindo que as seqüências que flanqueiam os pontos
de quebra são susceptíveis a rearranjos. Com o mesmo objetivo, SAITTA, et al., (2004)
verificaram, em 277 pacientes, a presença da deleção de 3Mb e em 241, deleção de 1,5
Mb, mas seis pacientes apresentavam deleções atípicas.
A região 22q11 tem sido mapeada, clonada e seqüenciada, sendo verificado que 85-
90% dos pacientes com estas síndromes têm uma deleção de 3MB e 10 a 12% têm uma
região de deleção de 1,5-2Mb, e o restante apresenta deleções menores (MURPHY,
2005).
RAUCH et al., (2005) observaram que pacientes com defeitos cardíacos conotruncais e
fenótipo típico de SVCF, apresentavam deleções tanto na região comum de 3Mb quanto
________________________________________________________________Resumo

30. na região menor de 1,5Mb em 18,5% e 78,6%, respectivamente, mas nenhuma deleção
atípica. No entanto, 5% dos pacientes com características sugestivas da SVCF sem
anomalias conotruncais mostraram deleções atípicas na região distal (Fig. 1).
Fig. 1. Marcadores polimórficos na região 22q11.2. Observa-se a região menor de
1.5Mb e a comum de 3Mb, as regiões atípicas, a proximal (intervaloI) e as distais
(intervalos VI e VII). Modificada de RAUCH, et al., 2005.
Em 189 amostras de necropsias em parafina de pacientes com malformações
conotruncais, KATZMAN, et al., (2005) assumiram que quando 3 loci consecutivos
mostraram homozigose, os mesmos apresentavam deleção. Encontraram assim, 18% de
mutação, dos quais seis casos eram DiGeorge e dez eram não sindrómicos quatro deles
apresentando atresia aórtica e três Tetralogia de Fallot. Esses autores destacam a
importância da análise de PCR como alternativa do FISH.
Um estudo brasileiro não observou diferenças estatisticamente significativas quando
comparou índices de etnia entre pacientes caucasianos, pretos e mulatos (PEREIRA, et
________________________________________________________________Resumo

31. al., 2003). No entanto, McDONALD-McGINN, et al., (2005) observaram uma baixa
representatividade de afro-americanos na sua amostra de pacientes com deleção
22q11.2, consistindo em 79,5% de caucasianos, 12% de afro-americanos, 4% de
hispânicos 1% de asiáticos e 3,5% com mistura étnica, sugerindo que, além das
diferenças alélicas entre os diferentes grupos, o problema se encontra na dificuldade de
discriminar as características clínicas nos pacientes afro-americanos. Em ambos os
trabalhos, as diferenças étnicas foram baseadas unicamente na história familial obtida na
consulta clínica.
1.7. Formação da deleção 22q11.2
O primeiro estudo com ênfase nos mecanismos que originam a deleção 22q11 data de
1998, em 10 famílias apresentando a deleção na região de 3Mb, 8 das quais possuíam
rearranjos intercromossômicos e 2 intracromossômicos (BAUMER, et al., 1998).
Alterações intracromossômicas foram observadas em dois pacientes em 1999
(EDELMANN et al., 1999b) e, no ano seguinte, TROST, et al., encontraram três
pacientes com alterações intercromossômicas (TROST, et al., 2000).
Segundo RAUCH, et al., (1999), parece provável que duas deleções na região comum
em 22q11 que causam SDG/SVCF resultem em eventos de recombinação homólogos
intracromossômicos e que a terceira repetição de poucas cópias resida teloméricamente
________________________________________________________________Resumo

32. na porção distal da deleção na região de 3Mb, sugerindo que um mecanismo similar
poderia explicar uma deleção distal não sobreposta.
Em 19 das 20 famílias analisadas por SAITTA et al (2004), encontraram-se trocas
meióticas intercromossômicas, no mesmo trabalho, relatam que em 35 famílias com
dados provenientes da literatura com deleções de novo de 3Mb, observam 30 com trocas
intercromossômicas. O número de crossing-overs observado neste estudo foi maior do
que o esperado ao acaso para o cromossomo 22, o que sugere que a região
pericentromérica de 22q11.2 apresenta uma arquitetura que predispõe a rearranjos
possivelmente relacionada às LCRr que se alinhem em forma desigual antes da troca
meiótica.
Num estudo de pedegree, apresentando um mapa de recombinação da região 22q11.2
observam-se 5 pontos de quebras com alto potencial de recombinação de 50 Kb ou
menos, os quais levam a deleções e duplicações mediante recombinações alélicas
homólogas. As manifestações clínicas observadas nessa família não se explicam
somente devido à baixa freqüência de recombinação meiótica. O mesmo cromossomo
se recombina duas vezes, a primeira vez por recombinação alélica homóloga e a
segunda por recombinação alélica não homóloga, resultando assim, no fenótipo da del
22q11.2 (TORRES-JUAN, et al., 2007).
1.8. Genes candidatos ao fenótipo da deleção 22q11.2
________________________________________________________________Resumo

33. O principal gene candidato à doença é o TBX1, cuja deleção poderia ser responsável
pelas alterações cardiovasculares das síndromes das SDG e SVCF (JEROME &
PAPAIOANNOU, 2001 & MERSCHER, et al., 2001).
Vários pesquisadores estudaram o ortólogo de camundongos o Tbx1 do gene TBX1 e
descobriram que o mesmo pertence a uma família que codifica fatores de transcrição
com uma região T-box altamente conservada (BOLLAG, et al., 1994, KISPERT, et al.,
1995).
Os estudos feitos em camundongos revelaram que o Tbx1 se expressa durante a
embriogênese, nos arcos faríngeos, bolsas faríngeas e vesícula ótica. Logo após, sua
expressão continua na coluna vertebral e no botão dentário (CHIEFFO, et al, 1997).
LINDSAY & BALDINI 2001, verificaram que este gene é necessário para o
desenvolvimento normal das artérias dos arcos faríngeos e que é um gene “dose
dependente” já que a deleção de uma cópia afeta o desenvolvimento das artérias do
quarto arco faríngeo e a mutação em homozigose leva a defeitos graves do sistema
arterial dos arcos.
Num estudo com 235 pacientes com fenótipo das SDG e SVCF sem a deleção 22q11.2,
observaram-se três mutações do TBX1, duas de sentido trocado e uma de mudança de
leitura. Estas observações revelam um papel central deste gene nas síndromes
mencionadas já que estes pacientes evidenciavam anomalias faciais, defeitos cardíacos,
hipoplasia de timo, insuficiência velofaríngea e disfunção de paratireóide (YAGI, et al.,
________________________________________________________________Resumo

34. 2003). Mas este foi somente o princípio dos estudos de mutações no gene TBX1, já que,
recentemente, STOLLER & EPSTEIN (2005) encontraram a mutação 1223delC na
região C-terminal em pacientes sem a deleção.
A haploinsuficiência do Tbx1 em camundongos transgênicos pode não somente levar a
alterações cardiovasculares e hipoplasia do timo, como também a defeitos no ouvido
médio e interno presentes nas SDG e SVCF (FUNKE, et al., 2001ª). Estudos de
VITELLI, et al., (2002), observaram que a deleção deste mesmo gene leva não só a
alterações no ouvido médio, mas também na orelha e regiões vestibulares, vias
neurossensoriais, cardíacos e vasculares levando a crer-se nas funções múltiplas desse
gene no desenvolvimento, especialmente no sistema cardiovascular na formação dos
arcos faríngeos, crescimento e septação das vias de saída do coração, septação
interventricular e alinhamento conal.
Em camundongos hemizigóticos para a região de 1,5Mb da deleção 22q11.2,
MERSCHER, et al., (2001) observaram mortalidade perinatal, defeitos conotruncais e
paratiróideos, os quais foram corregidos parcialmente quando um cromossomo artificial
de bactéria com o gene Tbx1 foi inserido, chegando à mesma conclusão que LIAO et al
no ano 2004 ao sugerir que alterações na dose desse gene eram responsáveis pela
maioria das manifestações clínicas.
TBX1 apresentou-se historicamente como o principal gene candidato para as doenças
estudadas contudo, há registros na literatura de pacientes com características das
________________________________________________________________Resumo

35. SDG/SVCF ou com defeitos cardíacos isolados que não apresentam mutações (GONG,
et al., 2001). Também não apresentam estas características as mutações que alteram a
transcrição da proteína tbx1, mediante a interação proteína-proteína ou proteína-DNA
como a mutação H194Q, mutação sem sentido de ganho de função que reproduz as
características fenrotípicas da SVCF, mas sem alterações cardíacas (ZWEIER, et al.,
2007).
Analisando especificamente 41 pacientes com defeitos conotruncais isolados, CONTI,
et al, (2003) não observaram alterações no gene TBX1, foram vistos somente poucos
polimorfismos. Estes estudos parecem confirmar que o gene TBX1 poderia não estar
envolvido nas cardiopatías observadas, como foi sugerido por vários autores (GONG, et
al., 2001; LINDSAY, et al., 2001 & VOELCKEL, et al., 2004).
Estudos recentes revelaram que o TBX1 mantém um equilíbrio entre a proliferação
requerida para a morfogênese cardíaca ativando os genes Isl1, Nkx2-6, e Hod, e a
inibição dos genes Raldh2-Gata4, Tbx5-Actc1, Myh6 e Myl7f, encarregados da
diferenciação miocárdica (LIAO, et al., 2008).
No ano 2002, VITELLI, et al., sugeriram que o lócus FGF8 pode afetar a penetrância de
defeitos cardiovasculares em pacientes com a doença modificando, assim, o gene TBX1.
Como em outros trabalhos (GARG, et al., 2001 & YAMAGISHI, et al., 2003) estudou-
se também não somente o gene ortólogo, mas também outros genes e fatores envolvidos
na sinalização para o desenvolvimento dos arcos e das bolsas faríngeas, como o Fgf10 e
________________________________________________________________Resumo

36. o Shh (este último é o responsável pela expressão de Tbx1 nos arcos faríngeos de
camundongos). Com todas essas evidências, YAMAGISHI et al. (2003), propõem que,
em pacientes com as características clínicas, mas sem deleção 22q11.2, o fenótipo possa
ser explicado por mutações nos fatores que regulam TBX1, como os enhancers e os
fatores de transcrição (famílias SHH e FOX, respectivamente).
Até o ano 2000, 27 genes foram identificados na região crítica para as SDG/SVCF e
mais de 30 na região de 3Mb (PUECH, et al., 2000), alguns deles foram relacionados
com características fenotípicas da deleção. Entre eles observa-se:
-GCSL, um fator de transcrição (homeobox) relacionado com o desenvolvimento
craniofacial e presente em altos níveis na embriogênese do sistema nervoso (LINDSAY,
et al., 1998 & WAKAMIYA, et al., 1998),
-ZNF74, um regulador da expressão gênica, cuja expressão foi observada nas paredes
das artérias pulmonar e aorta e na valva aórtica que são derivadas das células da crista
neural (RAVASSARD, et al., 1999),
-E2F6, um regulador do ciclo celular (KHERROUCHE, et al., 2001),
-TUPLE1/HIRA, um fator de transcripção que codifica uma proteína nuclear que se liga
às histonas (MAYNARD, et al., 2002). Sua expressão se observa no mesênquima de
membros, estruturas craniofaciais e coração.É superexpresso em células em divisão e
leva a uma parada do ciclo na fase S (HALL, et al., 2001). Este gene tornou-se como
possível candidato ao evidenciar replicação tardia em pacientes sem deleção na região
crítica 22q11.2 (D’ANTONI, et al., 2004),
________________________________________________________________Resumo

37. -UFD11, observou-se que seu gene ortólogo no rato (Ufd11) codifica uma proteína da
via da degradação proteolítica ubiquitina dependente (YAMAGISHI, et al., 1999 &
2003). Em embriões de galinha expressa-se no tubo neural em desenvolvimento, nas
células da crista neural, no mesênquima de cabeça e arcos faríngeos e na região
conotruncal (YAMAGISHI, et al., 2003),
-CDC45L, codifica para uma proteína expressa nos testículo e timo adulto, fígado fetal e
em níveis baixos nos arcos faríngeos, cérebro e rins fetais. Esta proteína dá inicio à
replicação do DNA, e parece não ter grande importância no fenótipo da deleção
(YAMAGISHI, et al., 1999),
-PNUTL1, GP1BB, WDR14, estudos com camundongos transgênicos portadores de
genes superexpressos revelaram que estes genes têm relevância no sistema auditivo, nas
malformações cardiovasculares e na hipoplasia de timo (FUNKE, et al., 2001ª, 2001b),
-PNUTL1 (ou CDCrel-1) é um gene da família das septinas que pode ser substituído por
outras septinas quando removido, alterando padrões de expressão (PENG, et al., 2002)
O estudo destes genes candidatos foi mais acessível após LINDSAY, et al., (1999)
desenvolverem um modelo animal carregando uma deleção de 1,2 Mb com 18 genes
ortólogos humanos presentes na região de 1,5 MB que, em heterozigose, apresentavam
letalidade perinatal, defeitos conotruncais e paratiróideos. Em 2000, PUECH et al.
concluíram que uma deleção de 500kb com grande sobreposição à região deletada de
1,2 Mb não apresentava anomalias conotruncais, excluindo, assim, 13 genes como
responsáveis destes achados clínicos.
________________________________________________________________Resumo

38. Uma deleção de 150 kb da região de 1.5Mb da deleção 22q11.2 contendo os genes
Znf741, Idd, Tsk1, Tsk2, Es2, Gsc1 e Ctp de camundongo leva à esquizofrenia em
heterozigotos sendo letal em homozigose, mas não suficiente para produzir SDG/SVCF
(PUECH, et al., 2000).
Assim como estes, outros genes têm sido observados na região 22q11.2 por exemplo
T10, que codifica uma pequena proteína de função desconhecida e se expressa no
coração e face do embrião (GOLDMUNTZ, et al., 1997), os genes COMT, ProDH2,
Ufd1L, GP1bB e PCQAP associados à esquizofrenia e com anatomia do cérebro não só
na região frontal, mas também no cérebro em desenvolvimento (LAZIER, et al., 2001
& MAYNARD, 2003, VAN AMELSWOORT, et al., 2007). O gene BCR conhecido
pela fusão BCR-ABL na leucemia mielóide crônica, os genes ARVCF, DGCR2,DGCR6
e TMVCF que atuam como reguladores nas junções e na aderência celular (SIROTKIN,
et al., 1997 & DEMCZUK, et al., 1996), genes de funções metabólicas como o da
gamaglutamiltransferase (GGT) e o gene GSC1 (SAINT-JORE et al., 1998) que, assim
como a maioria dos genes desta região, são expressos durante o desenvolvimento
cerebral (MAYNARD, et al., 2003).
Entre os muitos genes mapeados na região de 3 Mb da deleção, encontram-se o Crk1,
associado à sinalização e diferenciação na embriogênese e o Bid, um possível promotor
da apoptose celular necessária no processo de desenvolvimento do crânio, face e
coração (MAYNARD, et al., 2002).
________________________________________________________________Resumo

39. 1.9. Herdabilidade, aconselhamento genético e origem parental da deleção 22q11.2.
Na maioria dos pacientes, a deleção 22q11.2 ocorre de novo, mas a recorrência familiar
com um dos pais afetados é observada em aproximadamente 15% dos casos estudados
(McDONALD-McGINN et al., 2001 & SWILLEN, et al., 2005).
Se um casal tem um filho portador da deleção 22q11.2, o aconselhamento genético vai
depender se eles possuem ou não a deleção ou uma translocação. Desta forma, ambos os
pais têm de ser testados para verificar alterações cromossômicas presentes que podem
implicar em risco reprodutivo (McDONALD-McGINN, et al., 1999).
Se um dos pais apresenta a deleção, há um risco de 50% de transmissão (NORA, 1983;
WILSON, et al., 1993 & GELB, 2000). Porém a identificação de uma deleção de novo
implica um risco de recorrência de 1-3%, semelhante ao risco observado na população
geral. O mosaicismo gonadal poderia explicar recorrência entre irmandades de pais
normais (NORA, 1983).
EVERS L J. et al. (2006) destacaram a variabilidade fenotípica da SVCF reportada
como de herança autossômica dominante.
WILSON, et al., (1993) alertam para o risco de utilizar o diagnóstico pré-natal da
deleção como única base para interrupção da gestação, já que o fenótipo é muito amplo
podendo ser desde letal até manifestações brandas.
________________________________________________________________Resumo

40. Em um estudo de 1510 casos de diagnóstico pré-natal de fetos com anomalias cardíacas
congênitas observadas mediante ultrasonografia, 41.3% apresentavam anomalias
cromossômicas e 58.6% cariótipo normal com técnicas convencionais. No entanto, ao
realizar a técnica de FISH observou-se a deleção 22q11.2, em 3% dos casos sugerindo
que somente estas técnicas de citogenética molecular e as técnicas moleculares
oferecem a garantia de um resultado adequado (MOORE, et al., 2004).
MATSUOKA, et al ( 1998) encontraram deleção familiar em 13% dos 180 pacientes
com SACF e deleção 22q11, sendo as mães o genitor afetado em um 84% e, nos casos
de deleção de novo, 24 de 37 eram de origem materna. Em pacientes com SDG, 64%,
tinham deleção do alelo paterno levando a sugerir que a origem parental da deleção
determinaria o fenótipo do paciente.
Para verificar a origem parental da deleção em pacientes com TF, LU, et al (1999)
usaram cinco marcadores polimórficos e observaram uma prevalência de desvio
materno da origem da deleção.
Recentemente, DIGILIO, et al. (2005) observaram cinco linhagens de pacientes com
deleção 22q11, mostrando ocorrência de defeitos cardíacos congênitos não sindrômicos
em um parente de primeiro grau do afetado. Nas famílias observaram agregação
familiar de defeitos cardíacos congênitos sindrômicos e não sindrômicos, chegando a
um padrão de herança não usual. Buscando uma explicação para esses fatos, consideram
________________________________________________________________Resumo

41. a probabilidade da ação de diversos genes e fatores ambientais ou predisposição familiar
de sofrer cardiopatias específicas.
Numerosos estudos têm sugerido a origem parental da deleção (SEAVER, et al., 1994,
DEMCZUK, et al., 1995, RYAN, et al., 1997, entre outros já mencionados. No entanto,
em 2004, SAITTA, et al., observaram em 20 pacientes com deleção 22q11 de novo,
sendo 13 de origem materna e 10 de origem paterna. A soma desses dados aos da
literatura descrita resultaram em 68 deleções de origem materna e 60 de origem paterna,
as quais não representaram diferenças significativas para falar de origem parental da
deleção.
Continuando nessa direção, MAYNARD, et al (2006) reforçaram a idéia de ausência de
imprinting ou silenciamento gênico, estudando genes ortógolos de ratos com deleção
22q11 utilizando SNP na análise de entrecruzamentos interespecíficos e quantificação
de mRNA em modelo animal.
1.10. Outras etiologias sugeridas em casos com cardiopatias congênitas
conotruncais
MORAVA, et al., no ano 2000, estudou 24 crianças com cardiopatias congênitas.A
SVCF foi diagnosticada em 8 delas, mas a deleção 22q11.2 somente foi encontrada em
duas, concluindo que muitos pacientes podem ser de outra etiologia além da deleção
22q11.2.
________________________________________________________________Resumo

42. Relatam-se na literatura casos de microduplicação e triplicação de 22q11.2 com
fenótipo diverso, variando desde o normal até pacientes com alterações de
comportamento e defeitos múltiplos apresentando poucas características semelhantes às
das síndromes de deleção 22q11.2 (YOBB, et al., 2005). As semelhanças entre as
manifestações clínicas nos pacientes com duplicação 22q11.2 e deleção da mesma
região cromossômica foram alvos de um estudo para avaliar a incidência das
duplicações em pacientes com características VCF/DG em hospitais da Espanha,
encontrando entre outras anomalias cromossômicas, pacientes com microdeleções
22q11.2. No entanto, nenhum apresentava microduplicação, fato pelo qual os autores
sugerem que a microduplicação manifesta-se como um evento casual em pacientes com
características das SVCF e SDG.
Uma linha de investigação em expansão é a que defende que não somente o
envolvimento do gene TBX1 mas também a seus possíveis modificadores. Um estudo
apresenta o gene VEGF, que afeta a penetrância dos defeitos cardiovasculares em
camundongos knockout, camundongos Vegt deficientes manifestaram uma expressão
reduzida de Tbx1 (STALMANS, et al., 2003).
Esta região, não somente está envolvida em microdeleções e microduplicações, mas
também em rearranjos cromossômicos que provocam alterações de dosagem gênica,
como na trissomía 22q11.2 -derivado da translocação (11;22)- e na tetrassomía 22q11.2,
a mesma que causa a Síndrome do Olho de Gato que pode ou não conter a Região
Crítica da Síndrome de DiGeorge. Apesar de ter fenótipo diferente há uma grande
sobreposição de características entre essas síndromes (McDERMID & MORROW,
________________________________________________________________Resumo

43. 2002) . Um rearranjo pouco comum foi observado em um feto de 12 semanas,
encontrando-se um anel do cromossomo 22 derivado de uma inversão materna (inv 22),
com deleção do gene Tuple I causando DiGeorge. Essa aparente deleção instersticial foi
na verdade uma deleção terminal no cromossomo materno (Mc CLARREN J. et al
2006).
DEVRIENDT et al. (1994) relataram o caso de uma criança com características
fenotípicas da SVCF com deleção 8p23.1-8pter apresentando dificuldades de
aprendizagem, problemas comportamentais (agressividade e hiperatividade),
microcefalia, nariz proeminente, fala hipernasal com palato mole imóvel, defeito do
septo atrial e estenose de valva pulmonar. Estudos com FISH não detectaram deleção
em 22q11, sugerindo que deleção de genes em 8p23.1-8pter poderiam causar o fenótipo
similar ao da SVCF.
Pelo menos 40 casos com deleções de diversos tamanhos do braço curto do
cromossomo 8 foram relatados, 25 dos quais estavam associados a malformações
cardíacas (VAN KARNEBEEK & HENNEKAM, 1999). Anomalias cromossômicas
com um ponto de quebra proximal a 8p23.1, eram as mais freqüentemente associadas
com cardiopatias congênitas (WU et al., 1996). Tal associação repetida entre uma
pequena deleção e anomalias cardíacas não pode ser simplesmente aleatória, indicaria
uma relação causal (VAN KARNEBEEK & HENNEKAM, 1999: JOHNSON et al.,
1997). De fato, sabe-se que o gene GATA4, gene de um fator de transcrição zinc finger,
está localizado em 8p23.1-p22 (HUANG et al., 1996). Estudos com modelos animais
________________________________________________________________Resumo

44. implicaram este fator de transcrição como um regulador crítico da expressão gênica e
desenvolvimento cardíaco (PEHLIVAN et al., 1999). As anomalias do canal
atrioventricular são as malformações mais freqüentemente encontradas nos casos de
deleções terminais de 8p. No entanto, também foram encontradas anomalias
conotruncais, particularmente a TF, e outras malformações, incluindo estenose de valva
pulmonar, defeitos do septo atrial, defeitos do septo ventricular e síndrome do coração
esquerdo hipoplásico foram descritas (GIGLIO et al., 2000).
Uma anomalia cromossômica particular envolvendo 8p distal associada com cardiopatia
congênita em mais de 90% dos casos é o produto desbalanceado de uma inversão inv(8)
(p23;q22) , com deleção das bandas distais 8p23-pter e uma duplicação de bandas 8q22-
qter (DEVRIENDT et al., 1999). A deleção 8p envolve parte da região comumente
deletada em pacientes com del8p23.1. Entretanto, as cardiopatias congênitas são
tipicamente defeitos conotruncais, tal como a TF (Gelb et al. Apud DEVRIENDT et al.,
1999) sugerindo que o gene ou genes responsáveis pela cardiopatia congênita na del8p
sejam centroméricos ao ponto de quebra. Alternativamente, a cardiopatia pode ser
resultado dos efeitos combinados da duplicação 8q/deleção 8p associada a essa
anomalia (GELB, et al., em 2000).
Em 2005, WU et al., descreveram 3 casos com deleção 8p23.1 estudados com bandas G,
R, e FISH e relacionaram os pontos de quebras proximais a 8p23.1 aos defeitos
cardíacos congênitos observados nesses pacientes. Este grupo de pesquisadores
encontraram estes três pacientes num período de três anos. Somados aos cinco casos
________________________________________________________________Resumo

45. encontrados na literatura, supôs-se que a deleção distal 8p é relativamente comum, mas
frequentemente não observada em uma análise de rotina já que dois destes três casos
analisados foram reportados como normais para a deleção quando feita a amniocentese.
Fazendo diagnóstico pré-natal em fetos com hérnia diafragmática e defeitos cardíacos
congênitos, LOPEZ, et al (2006) encontraram dois casos positivos com o uso da técnica
de FISH, um dos quais apresentava deleção 8p23.1 com CIV.
Outros autores observaram a presença da deleção 10p13 em pacientes com
características clínicas da SDG (FISHER & SCAMBLER, 1994; SCHUFFENHAUER,
et al, 1998) e em um estudo com 27 pacientes com clínica sugestiva da SDG,
encontraram três casos com deleção 22q11.2, um caso com deleção 10p13 e um outro
caso com deleçãp 8p21.3 (GREENBERG et al., 1988). Em 2000, BEREND, et al, entre
412 casos, encontraram somente um indivíduo com deleção 10p, a baixa freqüência
dessa deleção também foi evidenciada no estudo de 100 pacientes com defeitos
cardíacos conotruncais, encontrando quatro deles com a deleção 22q11.2, dois com
defeito cardíaco isolado e outros dois associados com dismorfias, mas nenhum com
deleção 10p13-14 (VOIGT, et al., 2002).
Outra anomalia geralmente relacionada à malformação cardíaca conotruncal é a
trissomía do cromossomo 21 quando há defeito do septo atrioventricular
(KORENBERG, et al., 1992).
________________________________________________________________Resumo

46. TSAI, et al., (1999) reportaram um paciente com defeitos cardíacos congênitos (defeitos
septais, atriais e ventriculares e estenose pulmonar) e características extracardíacas
semelhantes à SVCF com deleção 4q34.2, fato que os levou a enfatizar a procura de
outras anomalias cromossômicas em pacientes sem a deleção 22q11.2.
Em 2005, uma nova síndrome foi reconhecida analisando pacientes com microdeleções
subteloméricas no cromossomo 9q. Eles tinham em comum deficiência mental grave,
hipotonía, braquicefalia, rosto achatado com hipertelorismo, sinofre, narinas
antevertidas, lábio inferior delgado, boca com macroglossia e defeitos conotruncais. A
região crítica responsável por esta síndrome definiu-se como 9q2 de aproximadamente
1.2 Mb e com 14 genes estimados (KLEEFSTRA, et al., 2005).
ABUSHABAN, et al (2003) observaram recorrência familiar de TA em crianças não
sindrômicas sem deleção 22q11. Esses achados e o tipo de segregação em famílias
altamente consangüíneas os levaram a sugerir herança mendeliana autossômica
recessiva dessa cardiopatia congênita e, juntamente com a ação de causas multifatoriais,
talvez esteja provocando um fenótipo semelhante ao da deleção 22q11.2.
Continuando com esta linha de investigação, outro estudo apresenta o gene VEGF, no
cromossomo 6, como possível modificador do TBX1, afetando a prenetrância dos
defeitos cardiovasculares em camundongos knockout. Camundongos Vegt deficientes
manifestaram uma expressão reduzida de Tbx1 (STALMANS, et al., 2003).
________________________________________________________________Resumo

47. Mutações no gene TBX20 um fator de regulação encontrado no cromossomo 7, estão
associadas com diversas patologias cardíacas, incluindo CIV, valvulogênese e
cardiomiopatia (KIRK, et al., 2007).
Em pacientes com suspeita de deleção 22q11.2, recomenda-se a análise citogenética
clássica, além das técnicas moleculares e de citogenética molecular (FISH), já que uma
pequena porcentagem apresenta rearranjos cromossômicos envolvendo 22q11.2, como
translocações entre cromossomos 22 ou outros cromossomos (McDONALD-McGINN,
et al., 1999).
________________________________________________________________Resumo

48. 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Proceder ao estudo genético-clínico em pacientes com malformações cardíacas
congênitas no intuito de verificar a presença de microdeleções nos pacientes com
malformações conotruncais isoladas.
2.2. Objetivos específicos
Verificar a freqüência de casos com microdeleções de novo e herdadas no cromossomo
22q11.2;
Analisar os pacientes com resultado negativo para a deleção 22q11.2 com marcadores
para a região 8p23.1;
Relacionar a presença de deleções nas regiões 22q11.2 e 8p23.1, com os achados
clínicos, tamanho e origem parental da deleção;
________________________________________________________________Resumo

49. Determinar a freqüência das deleções observadas nos pacientes com anomalias
congênitas conotruncais sindrômicas e nos pacientes com anomalias congênitas
conotruncais isoladas;
Auxiliar às famílias dos afetados estabelecendo o risco de recorrência e providenciando
os dados para o aconselhamento genético.
________________________________________________________________Resumo

50. 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1. Casuística
No presente trabalho, estudamos os pacientes com malformações cardíacas congênitas
conotruncais sindrômicas e não sindrômicas acompanhados no Ambulatório de
Genética Clínica e no Ambulatório de Cardiologia Infantil do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP) e
em menor número, pacientes de outras instituições, no período compreendido entre
janeiro de 2000 a dezembro de 2007.
Os pais dos pacientes foram convidados a participar da pesquisa. A inclusão no estudo
somente foi feita após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(ANEXO 1) e o projeto foi submetido a julgamento pela Comissão de Ética Médica do
HCFMRP-USP e foi aprovado mediante o oficio nº 3334/2006 – Processo HCRP Nº
1344/2001.
Previamente foram selecionados 110 pacientes por apresentar as malformações
cardíacas de interesse. Em 51 desses, foi impossível coletar amostra dos pais para o
estudo molecular.
________________________________________________________________Resumo

51. Para a análise molecular, a amostra foi constituída por 69 casos, selecionados por
possuir material dos trios completos (paciente-pai-mãe). Em um dos casos também foi
considerado analisar o irmão do paciente por apresentar características extracardíacas de
interesse. Na medida da disponibilidade e condições das amostras dos pacientes, foram
feitas análises citogenéticas das mesmas.
3.2. Métodos
3.2.1. Métodos Clínicos
Foram elegíveis para o estudo pacientes com uma das seguintes malformações
cardíacas: CIV, TF, IAA,B, TA, TGA, DVSVD+CIV sub aórtica, DVSVD+CIV sub
pulmonar, DVSVD+TGA e AP+CIV. Os pacientes foram recrutados somente com base
nos achados cardíacos. Foram incluídos somente alguns pacientes com achados
extracardíacos, os quais fizeram a consulta de rotina no ambulatório de genética durante
o período da pesquisa.
O protocolo de investigação realizado a partir de dados da literatura (Anexo 2) envolveu
os seguintes aspectos:
________________________________________________________________Resumo

52. - História clínica (antecedentes pré-natais, perinatais, morbidade, evolução clínica
e neuromotora e antecedentes familiares). Nos antecedentes pré-natais, as
informações referem-se às intercorrências durante a gestação, doenças agudas ou
crônicas, movimentos fetais, exposição a drogas, radiação e agentes infecciosos,
exames realizados. Para a avaliação dos antecedentes neonatais foi considerada a
duração da gestação, o tipo de parto, as condições do recém-nascido, dados
antropométricos ao nascimento e morbidade. Foi revista a evolução clínica e
neuromotora, bem como os exames realizados em vida; nos antecedentes
familiares foram avaliadas as condições de saúde, a presença de
consangüinidade entre os pais e a existência de casos semelhantes ao propósito
na família. Estas informações foram colhidas das anotações realizadas no
prontuário e de entrevista com a família.
- Estudos das famílias: através de anamnese fazendo uso de método escrito e
gráfico de heredograma, até a terceira geração, avaliação clinica e exames
complementares dos familiares, quando necessários.
- Exame físico: foram avaliados os dados antropométricos e os valores
comparados com os valores normais correspondentes para o sexo e a idade
utilizando as curvas apropriadas, além do exame físico geral.
- Documentação clínica: os pacientes foram fotografados.
- Avaliação de anormalidades: cardíacas, otorrinolaríngeas, craniofaciais,
oculares, das orelhas, aprendizado e cognição, da pele e tegumento, função da
paratireóide, malformações do sistema nervoso central (SNC), anomalias renais,
estado imunitário e outros exames realizados nos diferentes serviços do
________________________________________________________________Resumo

53. HCFMRP-USP, quando pertinentes, de acordo com os achados clínicos, também
foram registrados.
-
3.2.2. Métodos laboratoriais
Métodos moleculares
O DNA genômico foi isolado mediante a técnica padrão com proteinase K. Procedeu-
se de acordo com o tipo de amostra enviada ao laboratório. Para sangue total, transferiu-
se 100µl em um tubo de 1,5ml. No entanto, quando o material recebido era tecido
proveniente de necropsia ou da cirurgia, colocou-se a amostra em uma placa estéril e,
com o auxilio de dois bisturis, picotou-se e transferiu-se para um tubo de 1,5ml. Os
passos seguintes foram comuns, independentemente do tipo de amostra coletada (as
soluções se apresentam em detalhe no Anexo 3):
- Adicionar 1 ml do tampão de lise de eritrócitos (LISE I) e homogeneizar.
- Centrifugar a 6000 G durante 2 minutos e descartar o sobrenadante.
Os dois passos anteriores foram repetidos até que o precipitado ficou claro indicando
ausência de contaminação com a hemoglobina. Normalmente dois vezes eram
suficientes.
________________________________________________________________Resumo

54. - Ressuspender o precipitado em 300µl de tampão de lise de leucócitos (LISE II) e 5µl
de proteinase K (10 mg/ml). Deixar pelo menos 1 hora a 65°C, para finalizar aquecer a
94 °C durante 10 minutos para inativar a proteinase K e estocar a -20 °C.
Análise dos polimorfismos de microssatélites através de PCR (reação em cadeia da
polimerase).
Reação de PCR.
Em um tubo de 0,2 ou 0,5 ml, colocou-se 1 µl de DNA genómico. A seguir em um tubo
de 1,5ml, preparou-se o mix da reação:
Água estéril: 10 µl
Tampão com MgCl2: 1,5 µl
DNTP (20mM): 1 µl
DNA: 1,5 µl
Primers F (forward) e R (reverse): 0,5 µl de cada um
Enzima Taq polimerase: 0,5 µl
Volume total do mix por reação: 14 µl
Colocam-se os tubos no termociclador, o qual foi programado segundo as condições
descritas abaixo, para cada conjunto de primers utilizado:
1- 94°C.....................................................................4 minutos
2- 94°C......................................................................1 minuto
3- Temperatura de pareamento “Annealling”.............40 segundos
4-72°C........................................................................1 minuto
5- Repetir 30 vezes os passos 2 ao 4.
6- 72°C.....................................................................10 minutos
7- 4°C.........................................................................5 minutos
________________________________________________________________Resumo

55. As informações sobre os primers utilizados nas regiões 8p23 e 22q11.2, tais como
seqüência, tamanho do produto amplificado, número de alelos e temperatura de
Annealling encontram-se na Tabela 3.
Tabela 2. Seqüência dos primers utilizados para PCR, tamanho dos fragmentos
amplificados, quantidade de alelos e temperatura de “annealling”. TA= temperatura de
annealling; F= forward; R= reverse, pb= pares de base.
________________________________________________________________Resumo

56. Na etapa de padronização dos primers, verifica-se se a reação de PCR foi adequada.
Para isso, faz-se uma eletroforese em gel de agarose a 1% com brometo de etídio,
aplicando 5µl do produto da reação de cada amostra e 2µl de corante. Em um
poço no canto do gel, colocar 3,5µl do marcador de peso molecular diluído
segundo condições padrões. O gel corre por 40 minutos a 80W e a qualidade da
reação se verifica sob luz UV.
________________________________________________________________Resumo
Primers Seqüência Produto de PCR (pb) Alelos TA
D22S1648 F: CAGATGCTTCAGGACAAGTG
R: AGTTGTCAGATGCCTAAGAGA
152 5 55
D22S264 F:ATTAACTCATAAAGGAGCCC
R:CACCCCACCAGAGGTATTCC
190-210 11 55
D22S1623 F:AGGTAAATCTCATACCATGTAAAT
R:CACAACTCCTGGGCTCAAGCT
110 6 63
D22S944 F:CATGTGAAAGATGCTACTTCC
R:ATCCCATGCTCCTCCCCAT
158-178 11 57
D22S941 F:CAGGTTACAAAGTACATTAACTT
R:CAAGAAATGGTTGGAGCTGGT
224 5
D22S1638 F:TCACGCCACTACCCTCCAG
R:GACAACAGCAAATTGCACATT
93 9 55
D22S308 F:TCCTGCAACAGCACTAGACC
R:GATGCCTCCTTTTTCCTTTAGC
196-200 3 55
D22S311 F:GCTAGTGTGAGATAACGAAGCC
R:TTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGG
262-276 8 55
D22S306 F:GCCATTTATACAGTCTGGACC
R:CTCTTTCGCTGGAACATCAAA
103-109 4 57
D22S303 F:AGGACCTCAGACTGGTCAGTC
R:CTCCCATGAGAAGGTACACTCC
220-233 7 56
D22S301 F:CAACTACTCCGAGGCTGAGG
R:GGACACCTGAAGCCAAGG
198-205 4 55
D22S427 F:TGCTGTTTTGTAGAGTGTTTAGAC
R:GTGCCCAGCCGTATTT
130-146 6 56
D22S926 F:GCCGGCAATTTCTAATAAAC
R:GGTGGGTCAAACCAGA
299-310 6 55
D22S420 F:ATGTGGTCGCTGTGTTCTAC
R:AGTTCAGTGGGACCTACGTT
139 9 54
D8S265 F:ACCTCTTTCCAGATAAGCCC
R: CCAATGGTTTCGGTTACTGT
208-231 12 55
D8S1721 F: GACTTTCCTAAAAGCCCAGC
R: GCATCTTGCATGGTGTATTG
170-212 22 57
D8S1825 F:GAGATGGGGTTTCTCTATGTTGC
R:TGGGATTTCATTTTTAACCTGTG
119-143 13 60

57. Preparo do gel de poliacrilamida ao 12%
1-No momento do uso preparar: 28,8gr de Uréia, 24ml de Acrilamida:Bisacrilamida,
Solução 29:1, 6 ml de 10xTBE e 12ml de água destilada estéril até o volume final de
60ml.
3-Misturar e deixar em agitador para dissolver completamente.
4-Adicionar 32ul de N,N,N’,N’ tetrametiletilenodiaina (TEMED) e 200µl de persulfato
de amônio 1,5%.
5-Aplicar o gel entre as placas de vidro sem deixar formar bolhas.
6-Após isso, colocar 2 pentes, com os dentes para dentro, na parte da frente das placas e
deixar em repouso 1 hora.
Eletroforese vertical
1- Colocar o gel com a placa maior para fora um a cada lado da cuba e apertar com
grampos
2-Colocar 500ml de 1xTBE na parte superior do tanque mais 300ml de 1xTBE na parte
inferior.
3-Antes de correr, tirar os pentes.
4-Após, fazer uma pré-corrida de 30 minutos a 40W, para difundir o tampão no gel.
5- Enquanto ocorre a pré-corrida, colocar em tubos pequenos (um para cada amostra),
2ul de corante e 5ul do produto da PCR.
________________________________________________________________Resumo

58. 6-Colocar os tubos de cada amostra no termociclador para desnaturar o DNA, por 5
minutos a 95°C.
7-Logo após este tempo, retirar os tubos do termociclador e coloca-los em gelo.
8-Colocar os pentes de aplicação na parte superior do gel e fazer o esquema de
aplicação das amostras na seguinte ordem: paciente, pai e mãe (escrevendo com caneta
hidrográfica na placa de vidro anterior os números das amostras).
9-Aplicar cada amostra, uma em cada canal e anotar o esquema em uma folha.
10-Correr o gel por aproximadamente 3-4 horas de acordo com tamanho do fragmento
de DNA amplificado.
Coloração do gel com nitrato de prata
1. Em um pirex colocar 200mL de solução fixadora por gel.
2. Adicionar 3mL da solução de prata.
3. Deixar agitando por 5minutos.
4. Lavar com H2O.
5. Acrescentar 200ml do revelador previamente aquecido em microondas a 37°
6- Adicionar rapidamente 1 ml de formaldeído.
6. Agitar até o aparecimento das bandas.
7. Desprezar o revelador, cortar a reação com a solução fixadora.
8- Colocar o gel entre folhas de papel celofane transparente e deixar secar por um tempo
mínimo de dois dias.
9- Ler os resultados
________________________________________________________________Resumo

59. Métodos citogenéticos
Cultura de linfócitos (Rooney and Cepulkowsky, 1986; modificada no Laboratório de
Citogenética da FMRP-USP).
1.- Pingas 15 gotas de sangue total no “kit”de cultura
2.- Homogeneizar e deixar 72 horas em estufa a 37°C, 30 minutos antes (71 horas)
pingar 1 gota de colchicina.
3.- Homogeneizar e colocar em tubo de ensaio.
4.- Centrifugar 10 minutos à 800rpm.
5.- Retirar o sobrenadante com pipeta Pasteur.
6.- Colocar 5ml de solução hipotônica (KCl) a 37°C.
7.- Homogeneizar bem e colocar em estufa ou banho María (37°C) por 10 minutos.
8.- Pingar 10 gotas de fixador (metanol:ácido acético,3:1).
9.- Homogeneizar bem e centrifugar 5 minutos.
10.- Retirar o sobrenadante.
11.- Colocar 5ml de fixador e homogeneizar bem.
12.- Deixar em repouso por 10 minutos em temperatura ambiente.
13.- Centrifugar por 10 minutos.
14.- Retirar o sobrenadante.
15.- Colocar 5ml de fixador e homogeneixar bem.
________________________________________________________________Resumo

60. 16.- Centrifugar por 10 minutos.
17.- Repetir a operação anterior mais uma vez.
18.- Centrifugar por 10 minutos e retirar o sobrenadante.
19.- Pingar algumas gotas de fixador e fazer a lâmina teste com coloração convencional.
Coloração Convencional
Corar as lâminas com Giemsa (Merck) em tampão fosfato 0,06M, na proporção
1ml de corante:30ml de água destilada, durante 5 minutos.
Bandeamento GTG (SCHERES, 1972, modificada no Laboratório de Citogenética da
FMRP-USP).
1- Diluir um frasco da solução mãe de tripsina 5ml em 45ml de tampão fosfato 0,06M
pH 6,8 solução final de tripsina 0,1%.
2- Colocar a solução recém preparada em banho Maria a 37°C.
3- A lâmina é colocada na solução de tripsina por um tempo variável (alguns segundos).
4- Neutraliza-se com H2O destilada.
5- A lâmina é corada com solução de giemsa por 5 minutos.
6- Lava-se, após, em água corrente.
O tempo na tripsina é calculado a partir do dia em que foram feitas as lâminas: lâminas
em temperatura ambiente, conta-se 2 segundos por dia de envelhecimento, lâminas em
geladeira, conta-se 1 segundo por dia de envelhecimento.
________________________________________________________________Resumo

61. Análise Cromossômica
Foram analisadas por bandeamento GTG 11 metáfases por paciente.
As melhores metáfases foram selecionadas através de microscopia óptica,
desenhadas, fotografadas e analisadas. A partir de tais preparações realizou-se o
cariótipo de cada paciente, utilizando-se a classificação e nomenclatura estabelecidas
pela ISCN (1995)
.
Citogenética molecular
FISH para investigação da deleção
A citogenética molecular para investigar a microdeleção 22q11.2, foi realizada em outro
serviço para cinco pacientes com a sonda para a região cromossômica DGS
(DiGeorge/VCFS Region Probe-Cytocell ®). Essa sonda de DNA tem
aproximadamente 120 Kb incluindo o gene TUPLE1 e detecta a maioria das deleções
em 22q11.2
4. RESULTADOS
4.1. Amostra estudada
________________________________________________________________Resumo

62. Os pacientes com malformações cardíacas congênitas estudados no presente trabalho
foram acompanhados no Ambulatório de Genética Médica e no Ambulatório de
Cardiologia Infantil do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Em menor número os pacientes
provinham de outras instituições, dois deles da APAE de Campo Grande (MTGS) e dois
da APAE de Limeira (SP).
Sessenta e nove pacientes e suas famílias foram analisados dos quais, 35 pertencem ao
sexo feminino e 34 ao sexo masculino. A idade dos mesmos variou entre recém-nascido
e 23 anos (Tabela 3).
Dos 69 pacientes que participaram da análise molecular em 38 (55,1%) observamos
malformações cardíacas conotruncais isoladas. 17 (24,7%) apresentaram malformações
cardíacas e fenótipo sindrômico; entre estes, 14 mostram malformações cardíacas
conotruncais e 3 malformações cardíacas não-conotruncais e fenótipo sindrômico. Nove
(13%) apresentaram outras cardiopatias isoladas e, em 5 (7,2%) dos casos analisados,
observamos somente malformações extracardíacas. Esses últimos grupos de pacientes
sem malformações conotruncais foram analisados molecularmente para se ter uma
comparação com grupos controles (Tabelas 4, 5 e 6 ).
Tabela 3. Dados gerais dos pacientes estudados. += presença da anomalia, - = ausência da anomalia. NR= não realizado
Paciente Sexo Cardiopatia
conotruncal
Outras
cardiopatias
Outras
alterações
Citogenética
22q11.2
FISH
22q11.2
Molecular
22q11.2
1 F + + + 46,XX NR -
2 F + + + NR NR +
3 M + + - 46,XX - -
4 M + - - NR NR -
5 F + - - 46,XX NR -
6 M + + - NR NR -
________________________________________________________________Resumo

63. 7 M + - - NR NR -
8 M + + - NR NR -
9 M + + - NR NR -
10 M + + - NR NR +
11 F + + - NR NR -
12 M + - + NR NR -
13 F + - - NR NR +
14 M + + + NR NR -
15 M + - - NR NR -
16 F + + + NR NR -
17 M + - - 46,XY NR -
18 F + + - NR NR -
19 M + + - NR NR -
20 F + + - 46,XX NR -
21 M - + - NR NR +
22 F + + + 46,XX + +
23 M + + + 46,XY - -
24 F - - + 46,XX NR -
25 M + - - NR NR -
26 F - + + 46,XX + +
27 M + - + NR NR -
28 F + + + 46,XX + +
29 M + + - NR NR -
30 F + + - NR NR +
31 F + + - NR NR -
32 F + + - 46,XX NR -
33 F - - + 46,XX NR
34 F + - - NR NR -
35 M - - + 46,XY NR -
36 F + + + NR NR -
37 F + + - NR NR -
38 M + - + 46,XY +2cel
comfrag
NR -
39 M + - - NR NR -
40 F - - + NR NR -
41 M + - - NR NR -
42 M + - + NR NR -
43 F - + + NR NR -
44 F + + - NR NR -
45 M + + - NR NR -
46 M - + - NR NR -
47 F + - + NR NR -
48 F + + - NR NR -
49 M + + - NR NR -
50 F + + - NR NR -
51 F + + - NR NR -
52 F + + - NR NR -
53 F + + - NR NR -
54 F - + - NR NR -
55 M - + - NR NR -
56 M - + - NR NR -
57 M + + - NR NR -
58 F + - - NR NR -
59 M - + - NR NR -
60 M - + - NR NR -
61 M + + - 46,XY NR -
62 F + + - NR NR -
63 M + + - NR NR -
64 M + + + NR NR -
65 M + + - NR NR -
66 M - + - NR NR -
67 F - + - NR NR -
68 F - - + NR NR -
69 F + - + NR NR -
________________________________________________________________Resumo

64. Tabela 4. Descrição das malformações cardíacas conotruncais e defeitos cardíacos associados em
pacientes não sindrômicos (sub a = sub aórtica, sb p= sb pulmonar, V= ventrículo, CoAo= coartação da
aorta, CIA= comunicação inter ventricular, EP= estenose pulmonar, VE= ventrículo izquerdo, EA=
estenose arterial, PCA= persistência do canal arterial; P= paciente
P TF TA IAA,B CIV TGA DVSVD +
CIVsb a
DVSVD +
CIVsb p
DVSVD
+ TGA
AP +
CIV
Defeitos cardíacos
associados
3 + CIA,PCA, AT,EP,V único
4 +
5 + PCA
6 +
7 +
8 +
9 + CIA, CoAo
10 + PCA
11 + + PCA,AT,CIA
13 +
15 + + PCA
17 +
18 + + PCA,CIA
19 +
20 + PCA
25 + +
29 + PCA,CIA, CoAo
30
+
+ PCA,CIA, AT
31 + CIA,PCA
32 + CIA, CIV muscular em
tercio médio VE
34 +
37 + + PCA,EP,AP
39 +
41 +
44 + EA,CoAo
45 + + + EP,PCA
48 + PCA,CIA,AT,CoAo.
49 + + PCA,CoAo
50 + +
51 + CIA,PCA
52 + CIA,CoAo
53 + + CIA,PCA
57 + + CIA
58 +
61 + + CIA,PCA
62 + + CIA,
63 +
65 + + + PCA
Total 12 2 1 17 12 1 1 15
Tabela 5. Descrição das malformações cardíacas congênitas em pacientes com fenótipo sindromico (sb a
= subaórtica, sub p= subpulmonar, CIA= comunicação inter ventricular, AT= atresia tricúspide, PCA=
persistência do canal arterial; CoAo= coartação de aorta, P= paciente
P TF TA AAI,B CIV TGA DVSVD +
CIV sb a
DVSVD +
CIV sb p
DVSVD
+ TGA
AP +
CIV
Outros defeitos cardíacos
associados
Pacientes com malformações cardíacas congênitas conotruncais
1 + PCA, CIA, CIV muscular
________________________________________________________________Resumo

65. 2 + AP, AT, anastomose
cavopulmonar
12 +
14 + PCA
16 + + PCA
22 + CIA,PCA,CIV muscular
mínima
23 + + PCA
27 +
28 + PCA
36 + CIA,PCA
38 +
42 +
47 +
69 +
total 2 1 1 6 4 2
Pacientes com outras malformações cardíacas e fenótipo sindrômico
26 CIA ostium secundum,
bloqueio e aumento do átrio
direito
43 CIA
46 CoAo, PCA, CIA
Total
geral
14 3 1 23 16 1 2 4
Tabela. 6. Descrição das malformações cardíacas congênitas não conotruncais isoladas em pacientes não
sindrômicos. , CIA= comunicação inter ventricular, AT= atresia tricúspide, PCA= persistência do canal
arterial; CoAo= coartação de aorta, AP= atresia pulmonar, EA= estenose aórtica,
Paciente Malformações cardíacas não conotruncais isoladas observadas
21 Obstrução do ventrículo esquerdo próximo a válvula mitral
46 CoAo, Circulação colateral proeminente
54 AT, AP, PCA, ventrículo direito hipoplásico
55 EA
56 CoAo, EA e cortical. Estenose anular (sub-valvar)
59 Provável isomerismo atrial EA, CIA, PCA
60 PCA, AT
66 AP, AT, PCA, hiperplasia do ventrículo direito
67 CoAo, CIA, PCA.
Dos 69 casos analisados, em 8 (11.6%) observamos a deleção 22q11.2. Como 5 dos
casos analisados, correspondem somente a malformações extracardíacas (a descrição
das malformações extracardíacas de todos os pacientes encontram-se na tabela. 1 do
Anexo.B) Observa-se que a deleção está presente em 12,5% dos casos (64) com
malformações cardíacas estudadas (tabela 7).
________________________________________________________________Resumo

66. Tabela 7 Ocorrência da deleção 22q11.2 na amostra analisada
Malformações observadas Número de casos
analisados
Deleções observadas (%)
Cardiopatia congênita 64 8 (12,5%)
Anomalias extracardíacas 5 0
Total 69 8 (11.6%)
Observam-se que a deleção 22q11.2 está presente em 6 (11,5%) dos 52 pacientes com
malformações cardíacas conotruncais, correspondendo a mitade (5,75%) em pacientes
sindrómicos e a outra mitade (5,75%) em pacientes não sindrômicos e, em 2 (22.2%)
dos 12 pacientes com malformações cardíacas não conotruncais analisados, um deles
com fenótipo sindrômico e o outro não.
Em 14 pacientes com malformações cardíacas conotruncais e fenótipo sindrômico, 3
(21,3%) apresentam a deleção 22q11.2, 3 pacientes com características conotruncais
não sindrômicas (8%) (Tabela 8)
Tabela. 8. Ocorrência da deleção 22q11.2 em pacientes com malformações cardíacas
congênitas.
Características clínicas observadas Número de casos
analisados
Deleções observadas
(%)
Cardiopatia conotruncal e outros
defeitos cardíacos associados
38 3 (8%)
Cardiopatia conotruncal, outros
defeitos cardíacos associados e
características extracardiacas
14 3 (21,3%)
Cardiopatias não conotruncais isoladas 9 1 (11,1%)
Cardiopaticas não-conotruncais e
características sindrômicas
3 1 (33,3%)
Características extracardiacas 5 0
Total 69 8 (11,6%)
A TF está presente em 75% dos pacientes com fenótipo conotruncal não sindrômico
positivo para a deleção e o 25% restante corresponde a CIV+TGA. Assim mesmo, CIV
isolada representa 25% dos casos de deleção 22q11.2 e DVSVD+TGA no 75% dos
casos em pacientes com fenótipo sindrômico, (Tabela 9).
________________________________________________________________Resumo

67. Dos 12 pacientes com TF isolada estudados, 2 (16.6%) se apresentaram resultados para
a deleção 22q11.2. Considerando a amostra total de pacientes com malformações
conotruncais (sindrômicas e não sindrômicas) a deleção 22q11.2 está presente em 2
(14,3%) dos 14 pacientes com TF estudados (Tabela 9).
Tabela 9. freqüência da deleção 22q11.2 nas malformações cardíacas conotruncais
observadas.
Malformação
conotruncal
Freqüência em
pacientes sindromicos
Freqüência em
pacientes não sindromicos
Freqüência na
amostra total
TF - 16,6% (2/12) 14,3% (2/14)
CIV 5,8% (1/17) 4,3% (1/23)
TGA 8,3% (1/12) 6,2% (1/16)
CIV 16,6% (1/6) - 4,3% (1/23)
DVSVD+TGA 100% (2/22) - 75%(2/3)
O paciente 26 positivo para a deleção 22q11.2 apresenta CIA tipo ostium secundum,
bloqueio e aumento do átrio direito, malformações cardíacas consideradas não
conotruncais, e características extracardíacas. As características extracardíacas
apresentadas nos pacientes positivos para a deleção se encontram na tabela 10.
O paciente 21, apresentando característica cardíaca não conotruncal tem resultado
positivo para a deleção 22q11.2.
Nenhum dos pacientes com características extracardíacas sem malformações cardíacas
apresenta a deleção.
Tabela 10. .Malformações extracardíacas observadas nos pacientes sindrômicos
portadores da deleção 22q11.2. + = presença da malformação, - = ausência da
malformação.
OBSERVAÇÕES CLÍNICAS Paciente 2 Paciente 22 Paciente 26 Paciente 28
Malformações cardíacas + + +
________________________________________________________________Resumo

68. conotruncais
Outras malformações cardíacas +
Irritabilidade - + -
Voz anasalada - - + +
Troca de fonemas - - - +
Baixa estatura pós-natal - - - +
Dentes frágeis - - + -
Fenda palatina - - + +
Obstrução das vias aéreas - - + -
Má funcionamento do palato - - + -
Adenóides pequenas/ausentes - - - +
Ponte nasal proeminente - - + +
Fendas palpebrais estreitas + + + -
Alterações nos olhos - - - +
Estrabismo - - + -
Cabelo abundante - - + +
Maxilares verticais grandes - - + +
Área malar deficiente - - + +
Face assimétrica - - + +
Face alongada - - - +
Face achatada - - + -
Retro e micrognatia - - + -
Microcefalia - - - +
Fendas palpebrais obliquas
para cima
+ - - +
Epicanto + + - +
Telecanto - - + -
Raiz nasal baixa + + - -
Raiz nasal alta - - + +
Ponta nasal globosa - - + -
Narinas antevertidas - + - -
Base nasal alargada - + - -
Lábios grossos - - + -
Comissuras bucais para baixo - - + -
Orelhas assimétricas - + + +
Orelhas baixo implantadas - + + -
Dobramento hélix horizontal - - - +
Perda auditiva condutiva - - + +
Mãos e dedos delgados e
Longos
- + - +
Mãos e dedos hipotônicos - - + -
Clinodactilia V quirodáctilo
Bilateral
- - - +
Superposição III sobre o II
Pododáctilo
- - - +
Anûs anteriorizado - + - -
________________________________________________________________Resumo

69. 4.2. Análise Citogenética e FISH para a investigação da deleção 22q11.2
A análise citogenética mediante cultura de linfócitos e bandeamento G foi realizada em
15 (21,7%) dos 69 (100%) pacientes incluídos neste estudo.
Quatorze cariótipos apresentaram resultados normais com nível de resolução de 550
bandas e compatíveis com o sexo fenotípico numa análise de 11 células (Tabela 4).
Um dos casos (38) apresentou resultado 46.XY+frag em 2 de 100 células analisadas
com um nível de 550 bandas.
Em 5 pacientes foi possível realizar a técnica de FISH em amostras de sangue enviadas
a outro serviço, onde 3 deles (pacientes 22, 26 e 28) evidenciaram resultado positivo
com a sonda Cytocell® para região 22q11.2 envolvendo o gene Tuple1 (Tabela 4)
4.3. Análise molecular
A análise molecular foi feita em 69 famílias por meio dos marcadores STRPs (Short-
tandem-repeat polimorphism) da região 22q11.2 nos loci D22S1638, D22S1648,
D22S941, D22S944 e D22S1623 correspondentes ao intervalo de 1,5Mb, nos loci
D22S264, D22S311, na região comum de 3Mb e nos loci D22S308, D22S306,
D22S301, D22S303,D22S926, D22S427, D22S420, D22S1266 onde foram encontradas
deleções atípicas em pacientes com fenótipo levemente sugestivo da deleção. Estes 22
marcadores cobrem uma região de aproximadamente 8Mb incluindo as microdeleções
no cromossomo 22 associadas com malformações cardíacas (RAUCH et. al., 2004 (b))
Fig (....) .
________________________________________________________________Resumo

70. Fig 2. Distribuição dos marcadores STRPs na região 22q11.2 estudada. (I, II, IIIa, IIIb,
IV, V, VI e VII intervalos descritos por RAUCH et al., (2004).
Para realizar o estudo, em 4 dos 69 pacientes foi necessário fazer extração de DNA de
material da necropsia, sendo em um caso amostra de sangue e nos outros três de pele e
fascia, nos restantes 65 casos o DNA foi extraído a partir de sangue periférico.
Todos os marcadores estudados para o cromossomo 8 se encontram dentro da região
considerada crítica para a deleção.
Para os marcadores da família foram atribuídos números aos diferentes alelos de acordo
ao tamanho do fragmento amplificado. O alelo 1 tem menor tamanho, corre mais
rapidamente no gel aparecendo como sendo a banda mais baixa. Os alelos de tamanhos
maiores aparecem acima na corrida do gel. Esta comparação é feita dentro das famílias
analisadas num mesmo gel.
Quando o paciente apresenta dois alelos diferentes (heterozigota) ele é considerado
normal para esse marcador, não apresentando a deleção. Se apresenta apenas um
fragmento, pode representar tanto uma homozigose como uma hemizigose por deleção.
Caso os dos genitores possuam fragmentos do mesmo tamanho que o filho não é
possível identificar se a criança é homozigota ou hemizigota, por isso a família é
________________________________________________________________Resumo
Região de 3Mb
Região de 1,5Mb

71. considerada não informativa. Se apenas um dos genitores possuem o fragmento do
mesmo tamanho da criança, e esta não tenha recebido nenhum alelo do outro progenitor,
temos caracterizada uma deleção.
Os resultados do estudo molecular com os marcadores para o cromossomo 22 se
encontram na tabela. 11 y os resultados do estudo molecular para o cromossomo 8 se
encontram na tabela 12.
Nenhuma deleção foi encontrada nos pacientes pesquisados para o cromossomo 8, na
figura 3, se encontra uma representação das regiões deletadas observadas no
cromossomo 22.q11.2
Fig 3. Representação das regiões deletadas observadas no cromossomo 22q11 segundo
os pacientes analisados.
DESCRIPÇÕES DOS CASOS
Caso 2
________________________________________________________________Resumo
Região de 3Mb
Região de 1,5Mb
Paciente 26
Paciente 2
Paciente 10
Paciente 21
Paciente 22
Paciente 13
Paciente 28
Paciente 30