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DIVERSIDADE DE RIZÓBIOS ISOLADOS DA RESERVA PARTICULAR DO
PATRIMÔNIO NATURAL EM SERRA DAS ALMAS - CE...
Introdução

A interação entre leguminosas e rizóbio é um exemplo de associação biológica intensamente
estudada,  cujos ben...
Os nódulos foram coletados por volta de 45 dias após a semeadura e estocados em sílica gel a
temperatura ambiente. 
Caract...
trabalhos já evidenciaram que rizóbios de crescimento rápido também são capazes de induzir
nódulos em caupi (ZHANG et al. ...
Desenvolvimento Cientifico Regional (DCR) FACEPE/ CNPq UFRPE-UAG,  Garanhuns (PE), 

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Diversidade de Rizóbios Isolados da Reserva Particular do Patrimônio Natural em Serras das Almas CE

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Leguminosas são capazes de formar nódulos com ampla faixa de rizóbios, realizando a "Fixação Biológica de Nitrogênio". Este trabalho analisa a diversidade rizobial em uma área de proteção ambiental no semiárido brasileiro.

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Diversidade de Rizóbios Isolados da Reserva Particular do Patrimônio Natural em Serras das Almas CE

  1. 1. Área: Microbiologia DIVERSIDADE DE RIZÓBIOS ISOLADOS DA RESERVA PARTICULAR DO PATRIMÔNIO NATURAL EM SERRA DAS ALMAS - CE c. G. F. cosTAl, w. L. BORGESZ, c. M. MARTINS3 Resumo- Em geral, leguminosas são capazes de formar nódulos com ampla faixa de rizóbios, realizando a “Fixação Biológica de Nitrogênio". Este trabalho teve por objetivo analisar a diversidade da população rizobial da área da Reserva Particular do Patrimônio Natural-Serra das Almas, localizada no município Crateús (CE). Foram caracterizados 278 isolados, onde 122 isolados foram coletados na estação seca e os demais 156 coletados na época chuvosa do ano. Os isolados foram cultivados em meio YMA para avaliar as características culturais das colônias como produção de acidez ou alcalinidade, velocidade de crescimento, cor, forma, elevação e produção de muco. A caracterização cultural dos isolados obtidos de amostras de solos, mostrou em sua maioria predominância de isolados com hábito de crescimento rápido e reação de pH neutro em meio de cultivo. Palavras-chave: Fixação Biológica de Nitrogênio, Simbiose, Semi-árido DIVERSITY OF RHIZOBIA ISOLATED FROM THE PRIVATE RESERVE OF THE NATURAL HERITAGE IN SERRA DAS ALMAS - CE Abstract- Legume plants are generally capable of forming nodules with a broad rhizobia range, acting in order to realize biological nitrogen fixation activity. This work had the objective of studying the diversity of rhizobia population associated with cowpea in a region in the Private Reserve of Natural - Serra das Almas, Crateús (CE). Two hundred and seventy-eight bacteria isolates were characterized, one hundred and twenty-two were collected in the dry season and the others, one hundred fifty-six collected, in the raining season of the year. isolates were cultivated in YMA media to evaluate colonie characteristics as acidity or alkalinity production, growing velocity, color, shape, elevation and mucus production. The cultural characteristics of isolates obtained from samples of soil, most ofthem showed a predominance of isolates with growth habit and quick reaction of neutral pH in the midst of growing. Key words: Biological Nitrogen Fixation, Symbiosis, Semi-arid. 1 Universidade Federal do Ceará, Mestrando do Curso de Pós-graduação em Ecologia e Recursos Naturais, Centro de Ciências, AV. Humberto Monte s/ n, Campus do PICI, Fortaleza, CE, CEP 60356-000. e-mail: carlos ermano ' mai| .com Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Doutorando do Curso de Pós-graduação em Ciência do Solo, Km 47 da antiga Rodovia Rio-São Paulo, Seropédica, Rio de Janeiro. email: wardsson@gmail. com 3 Universidade Federal do Ceará, Professora Adjunta II do Departamento de Biologia, AV. Humberto Monte s/ n, Campus do PICI, Fortaleza, CE, CEP 60356-000. e-mail: claudiamartins@ufc. br Anais do II CONAC: Congresso Nacional de Feijão-Caupi 507
  2. 2. Introdução A interação entre leguminosas e rizóbio é um exemplo de associação biológica intensamente estudada, cujos benefícios para a sustentabilidade agrícola são reconhecidos devido ao processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) (XAVIER et al. , 2006). O feijão-caupi, devido a sua adaptabilidade às severas condições climáticas, é uma cultura típica de regiões semi-áridas do nordeste brasileiro, além do seu valor nutricional, também apresenta alta variabilidade genética, produtividade e alta capacidade de se beneficiar da simbiose com rizóbios (ZILLI et al. , 2004). No Brasil, é cultivado, predominantemente, na região Nordeste, representando uma fonte alternativa de proteína (SILVA et al. , 2007). Atualmente, segundo Jesus et al. (2005) a avaliação da diversidade de bactérias tem sido fortemente influenciada pelo uso de técnicas moleculares, em geral de alto custo, entretanto, existem várias outras técnicas disponíveis para a caracterização de microrganismos, as quais levam em consideração tanto características fenotípicas, quanto genotípicas, como por exemplo, a avaliação de caracteristicas culturais e morfológicas dos microrganismos. A avaliação dessas características e' o primeiro passo para a identificação de novos grupos taxonômicos de microrganismos, e muito útil, por ser de baixo custo. As características morfológicas e culturais dos rizóbios fornecem informações importantes para sua identificação e agrupamento. São informações oportunas, uma vez que permitem um esboço da diversidade de espécies e dão base ao conhecimento e possibilitam a continuidade dos estudos das estirpes identificadas. Este trabalho buscou caracterizar a diversidade cultural de rizóbios nativos isolados de nódulos de feijão-caupi cultivado em solos provenientes da Reserva Particular do Patrimônio Natural na Serra das Almas, localizada no município de Crateús (CE). Material e Métodos Coleta de solo As coletas de solo na área da Reserva Particular do Patrimônio Natural na Serra das Almas, no município de Crateús (CE), foram realizadas em onze pontos, onde se identificaram oito espécies de leguminosas arbóreas plenamente estabelecidas, a saber: Anadenanthera macrocarpa (Benth. ) Brenan (Angico), Bauhinia cheilantha (Mororó), Caesalpinia pyramidalis Tul. (Catingueira), Erythrina fusca (Mulungu), Mimosa caesalpinifolia (Sabiá), Mimosa acustistípula (Jurema-branca), Mimosa tenuiflora (Jurema-Preta), Toresia cearensis Fr. All. (Emburana). O solo rizosférico, tomado de uma faixa de O a 20 cm de profundidade, foi coletado e homogeneizado para posterior utilização em vasos com plantas-isca de feijão-caupi. Cultivo das Plantas Isca Para capturar os rizóbios presentes nas amostras de solo foram realizados experimentos em casa-de-vegetação, utilizando proporção de areia esterilizada e solo (1:1; v/ v) e plantas de feijão- caupi (Vigna unguiculata). As sementes dessas plantas foram previamente lavadas com etanol e desinfestadas superficialmente com peróxido de hidrogênio e 10 lavagens sucessivas com água esterilizada. As sementes de feijão-caupi livres de contaminantes foram semeadas nos vasos (300mL) previamente preparados. A irrigação foi realizada com água esterilizada, e os nutrientes foram fornecidos semanalmente através de 250 mL. vaso'1 da solução nutritiva Norris e Dõbereiner. Anais do II CONAC: Congresso Nacional de Feijão-Caupi 508
  3. 3. Os nódulos foram coletados por volta de 45 dias após a semeadura e estocados em sílica gel a temperatura ambiente. Caracterização cultural de isolados de rizóbio Os nódulos obtidos foram reidratados por 10 minutos, lavados com etanol a fim de reduzir a tensão superficial, em seguida, foi realizada desinfestação superficial com hipoclorito de sódio e lavagens sucessivas com água destilada estéril. Em seguida, os nódulos foram macerados e riscados na superficie da placa de Petri, contendo meio de cultura YMA. Para a obtenção de colônias puras de rizóbios a caracterização cultural foi realizada em meio Vermelho-Congo. As placas foram incubadas à 28°C até o aparecimento de colônias, então foram repicadas e novamente incubadas. Posteriormente à obtenção de colônias puras de rizóbios, em Vermelho-Congo, se realizou a riscagem das estrias na superficie da placa de Petri, contendo meio de cultura YMA com indicador azul de bromotimol (O,5%) (FRED; WAKSMAN,1928). As placas foram observadas do primeiro dia após o plaqueamento até o aparecimento de colônias isoladas. As caracteristicas culturais avaliadas em meio YMA foram: tempo de crescimento em dias para visualização das colônias; modificação do pH pela alteração da coloração do meio YMA para diferencia-las, se amarelo - ácidas, verde - neutras, e se azul - alcalinas ; coloração das colônias, que varia de branco a tons de amarelo devido à absorção do indicador de pH (azuI-de-bromotimol), diâmetro das colônias (mm) quando isoladas, borda (inteira ou irregular), aparência da colônia (homogênea ou heterogênea), forma (circular ou irregular) e transparência (translúcida ou opaca). O muco produzido pelas células foi avaliado pelos aspectos: quantidade (muito ou pouco - avaliação visual) do muco na superfície do meio de cultivo e elasticidade (sim ou não), determinado pela aderência à alça de platina depois da remoção observada pela formação ou não de fio, no momento da remoção das colônias do meio de cultura (VINCENT,1970). Resultados e Discussão Foram obtidos 278 isolados com caracteristicas típicas de rizóbio, onde 156 isolados referentes à estação chuvosa e 122 referentes á estação seca, obtidos através de plantas-isca de feijão-caupi. Cerca de 85,9% de isolados formaram colônias em até 2 dias de crescimento a 28°C, caracterizando estirpes de crescimento rápido. Medeiros et al. (2009) avaliaram a diversidade cultural de 304 isolados obtidos de feijão-caupi em solos do estado do Rio Grande do Norte. Todos os isolados apresentaram crescimento rápido e acidificaram o meio de cultura. Segundo Sprent (1994), rizóbios de crescimento rápido são mais comuns em regiões áridas. Esta caracteristica constitui uma estratégia de sobrevivência, já que são mais tolerantes à seca do que os de crescimento lento e se multiplicam rapidamente em curto espaço de tempo úmido, o que explicaria sua maior freqüência nos solos das regiões semi-áridas (SANTOS et al. , 2007). Os isolados obtidos a partir de solos coletados no periodo seco apresentaram maior percentual de colônias formadas em até 2 dias, 96,7%, corroborando com dados obtidos por Santos et al. (2007), que obtiveram um total de 433 isolados de rizóbio, por meio de nódulos de espécies de Arachis, Stylosanthes e Aeschynomene, em que cerca de 90% dos isolados formaram colônias com até dois dias de crescimento, caracterizando estirpes de crescimento rápido. A maior parte dos estudos desenvolvidos até o momento mostra que o grupo de rizóbio que nodula caupi apresenta crescimento lento, caracteristica do gênero Bradyrhizobium (ZILLI et al. , 2006). Entretanto, alguns Anais do II CONAC: Congresso Nacional de Feijão-Caupi 509
  4. 4. trabalhos já evidenciaram que rizóbios de crescimento rápido também são capazes de induzir nódulos em caupi (ZHANG et al. , 2007). A maior parte dos isolados tiveram a capacidade de neutralizar o meio de cultura Esta característica estava presente em 53,09% dos isolados. Segundo Martins (1996), a habilidade de alcalinizar o meio pode representar uma vantagem seletiva em relação à temperatura. Foi observado o desenvolvimento de maior número de colônias de coloração amarela, 56,34%. A caracterização quanto ao diâmetro das colônias apresentou os seguintes resultados: 46,25% puntiformes, relacionado às colônias que não formam muco. Observou-se maior percentual de colônias puntiformes durante a estação chuvosa, 62,18% do total, em relação a apenas 30,33% durante a estação seca. Por sua vez, colônias entre 1 e 2 mm foram as seguintes mais presentes, somente durante a estação seca com 42,60% do total. A análise do tipo de borda formada pelas colônias apresentou uma marcante dominância de formação de bordas inteiras, 72,13%. Observando-se a elevação apresentada pelas colônias, 43,06% apresentaram a caracteristica planas. Esse percentual se mostrou mais expressivo nas colônias formadas durante a estação chuvosa 61,54°/ o. Outros tipos de elevação mais presente são: elevado 30,48%, seguido do tipo convexo, 22,12% dos isolados, ambos predominantes na estação seca. A quantidade de muco formada pelas colônias, foi observada em 40,02% dos isolados, com formação de pouco muco, com maior presença nas colônias dos isolados da estação seca 46,72%, estes dados corroboram com os obtidos por Medeiros et al. (2009), onde a maioria dos isolados obtidos de feijão-caupi apresentaram pouco muco. Em 35,78% não houve formação de muco. De acordo com Coutinho et al. (1999), acredita-se que a produção de muco pode representar uma adaptação para proporcionar a sobrevivência dos rizóbios em diferentes condições de solo e clima. Por último, foi avaliada a elasticidade do muco formado pelas colônias, quando presente. Observou- se que 76,20 % dos isolados não apresentaram elasticidade no muco. Segundo Xavier et al. (2006) é possivel que isolados de muco seco e que, em conseqüência não apresentam elasticidade, sejam mais resistentes à altas temperaturas, fator que garanta a sobrevivência em condições áridas. Em geral, os isolados que apresentaram crescimento em apenas 1 dia, com reação ácida do meio de cultura e produtores de muco podem sugerir maior capacidade de adaptação às condições do semi-árido. Sendo provável que essas caracteristicas desempenhem papel importante para a sobrevivência e eficiência de rizóbios nessas regiões. Conclusões A caracterização cultural dos isolados obtidos de amostras de solos da Reserva do patrimônio natural da Serra das Almas (CE), mostrou em sua maioria predominância de isolados com hábito de crescimento rápido e reação de pH neutro em meio de cultivo. Revisores Lindete Míria Vieira Martins, Professora Adjunta da Universidade do Estado da Bahia, Av. Edgard Chastinet s/ n, Juazeiro (BA), mirialind@yahoo. com. br; Erika Valente Medeiros, bolsista de Anais do II CONAC: Congresso Nacional de Feijão-Caupi 510
  5. 5. Desenvolvimento Cientifico Regional (DCR) FACEPE/ CNPq UFRPE-UAG, Garanhuns (PE), evmbio@gmail. com Referências COUTINHO, H. L. C. ; OLIVEIRA, V. M. ; MANFIO, G. P. ; ROSADO, A. S. Evaluating the microbial diversity of soil samples: methodological innovations. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 71, p. 491-503,1999. FRED, E. B. ; WAKSMAN, S. A. Laboratory manual of general microbiology with special reference to the microrganisms of the soil. New York: Mc-GawHiII, 1928. JESUS, E. C. ; MOREIRA, F. M. S. ; FLORENTINO, L. A. ; RODRIGUES, M. I. D. ; OLIVEIRA, M. S. Diversidade de bactérias que nodulam siratro em três sistemas de uso da terra da Amazônia Ocidental. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasilia, DF, v. 40, n. 8, p. 769-776, 2005. MARTINS, L. M. V. Características ecológicas e fisiológicas de rizóbio de caupi (Vigna unguiculata (L) Walp) isolados a partir de solos da região nordeste do Brasil. 1996. 213 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. MEDEIROS, E. V. ; MARTINS, C. M. ; LIMA, J. A. M. ; FERNANDES, Y. T. D. ; OLIVEIRA, V. R. ; BORGES, W. L. Diversidade morfológica de rizóbios isolados de caupi cultivado e solos do Estado do Rio Grande do Norte. Acta Scientiarium Agronomy, Maringá, v. 31, n. 3, p. 529-535, 2009. SILVA, V. N. ; SILVA, L. E. S. F. ; FIGUEIREDO, M. V. B. ; CARVALHO, F. G. ; SILVA, M. L. R. B. ; SILVA, A. J. N. Caracterização e seleção de populações nativas de rizóbios de solo da região semi- árida de Pernambuco. Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 37, n. 1, p. 16-21, mar. 2007. SPRENT, J. I. Evolution and diversity in the Iegume-rhizobium symbiosis: chaos theory? Plant and soil, Dordrecht, v.161, p.1-10.1994. STRALIOTTO, R. ; RUMJANEK, N. G. Biodiversidade do rizóbio que nodula o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L. ) e os principais fatores que afetam a simbiose. Seropédica: Embrapa CNPAB, 1999. 51p. (Embrapa Agrobiologia. Embrapa- CNPAB. Documentos, 94). VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root nodule bacteria. Oxford: Blackwell Scientific, 164 p. 1970. XAVIER, G. R. ; MARTINS, L. M. V. ; RIBEIRO, J. R. A. ; RUMJANEK, N. G. Especificidade simbiótica entre rizóbios e acessos de feijão-caupi de diferentes nacionalidades. Revista Caatinga, v. 19, n.1, p. 25-33, 2006. ZILLI, J. E. ; RUMJANEK, N. G. ; XAVIER, G. R. ; COUTINHO, H. L. C. ; NEVES, M. C.P. Diversidade microbiana como indicador de qualidade do solo. Cadernos de Ciência & Tecnologia, v. 20, n. 3, p. 391-411. 2003. Anais do II CONAC: Congresso Nacional de Feijão-Caupi 511

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