Este estudo construiu um vetor contendo o gene repórter LacZ sob a ação da região 3' UTR do gene GPC-4, que contém sítios-alvo para miRNAs, com o objetivo de testar o controle pós-transcricional da expressão de GPC-4 por miRNAs em células foliculares bovinas. Ferramentas de bioinformática identificaram sítios-alvo de miRNAs na região 3' UTR do GPC-4. O gene LacZ e a região 3' UTR foram clonados no vetor pCDNA3 para an

1. Estudo da regulação da expressão gênica do gene GPC-4
por meio de miRNAs.
Oliveira, A.G.G e Melo, E.O.
INTRODUÇÃO
Recentemente, foi descrito que os miRNAs maternos presentes no
citoplasma dos ovócitos são fundamentais para o desenvolvimento
embrionário em camundongos e capazes de regular vários genes
fundamentais na transição Materno-Ziogótica (Tang et al., 2007 e Schier.,
2007). Em experimentos do nosso laboratório, o gene GPC-4 teve sua
expressão reduzida na população de células de folículos maiores
(competentes) em relação à população de células provindas de folículos
menores (incompetentes). O Glipicano-4 é um proteoglicano evidenciado por
modular os sinais de FGF-2, este sinal atua nos processos de divisão celular,
sobrevivência da célula, migração, diferenciação e adesão celular (Hada et
al., 2009 e Gonzalez et al., 2005). Baseado nessas informações, temos como
hipótese que o GPC-4 pode ser regulado por miRNAs e que sua regulação é
fundamental para o processo de desenvolvimento folicular e/ou
embrionário. Para testar essa hipótese, um vetor (~10300bp) foi construído
com o gene repórter LacZ, que codifica a enzima β-galactosidase, sob ação
da região 3’ UTR do gene GPC-4 onde se encontram os potenciais sítios-alvo
para regulação pós-transcricional por miRNAs.
OBJETIVO
Construir um vetor com o gene repórter LacZ sob ação da região 3’ UTR do
gene GPC-4 onde se encontram os potenciais sítios-alvo para regulação por
miRNAs com o intuito de testarmos o controle pós-transcricional da
expressão de GPC-4 via miRNAs em células do cumulus e da granulosa de
folículos ovarianos de bovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Inicialmente foram utilizadas as ferramentas de bioinformática (miRANDA,
TargetScan, PicTar, RNAhybrid, DIANAMicroT, e MicroInspector) para
identificações dos potenciais sítios-alvo de miRNAs presentes na região 3’
UTR do gene GPC-4 de bovino. O Webcutter 2.0 foi utilizado para confecção e
análise dos mapas de restrição dos vetorespCMVβGal, pGEM-Teasy e
pCDNA3.
A região 3’UTR do gene GPC-4 contendo os potenciais alvos para ligação a
miRNAs foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico bovino e clonada
no vetor pGEM-Teasy. Paralelamente, o vetor pCMVβGal foi digerido com
BamHI e o fragmento de 3594bp contendo a ORF do gene LacZ foi purificado
do gel.
Por fim, o vetor pCDNA3 foi digerido com BamHI para a clonagem do gene
repórter LacZ e posteriormente o vetor resultante digerido numa segunda
etapa de clonagem com EcoRI para a clonagem da região 3’UTR do gene GPC-
4 que estava no pGEM-Teasy para a posição 3’UTR do gene repórter LacZ.
Para confirmação das clonagens, o vetor final (~10300bp) pCDNA3 + LacZ + 3’
UTR do GPC-4 foi sequenciado na EMBRAPA recursos genéticos e
biotecnologia.
RESULTADOS
CONCLUSÃO
Esperamos que no futuro possamos confirmar o controle pós-transcricional da
expressão do gene GPC-4 via miRNAs em células do cumulus e da granulosa de
folículos bovinos (ensaio in vivo) em comparação a folículos competentes e
incompetentes, assim como em experimentos in vitro usando extratos das
células do cumulus e granulosa.