Nocions bàsiques de turbidimetria i nefelometria

1. NEFELOMETRIA I TURBIDIMETRIA

2. Principis bàsics
• Espectroscòpies d’absorció molecular en la zona d’espectre
visible
• Comportament de la matèria al incidir una radiació
electromagnètica (fenòmens de reflexió, dispersió, bloqueig i
transmissió de la resta de radiació fins el detector)
• Característiques de la mostra: són partícules no transparents
en un líquid (precipitats, suspensions col·loïdals,..)
• La nefelometria estudia la radiació dispersada per la mostra
en angles diferents al d’incidència de la radiació
• La turbidimetria estudia la radiació no dispersada
• Mètodes analítics qualitatius i quantitatius

3. Nefelometria
• La dispersió de la radiació és un fenomen físic resultant de la
interacció entre aquesta i les partícules en suspensió en un
medi adequat.
• Els angles de mesura de la radiació dispersada oscil·len entre
15 i 90
• Aquesta dispersió està influïda per:
– La concentració de l’analit
– Volum, mida, pes i nombre de partícules
– Longitud de l’ona de la radiació incident
– Distància del detector a la cubeta

4. Nefelometria (II)
El grau d’influència d’aquests factors està reflectit en la
teoria de Rayleigh:
1. La intensitat de llum dispersada és:
- Directament proporcional a la concentració de les partícules
en la mostra
- Directament proporcional al pes molecular de les …
- Inversament proporcional al quadrat de la distància entre el
detector i la cubeta
- Inversament proporcional a la quarta potència de la λ

5. Nefelometria (III)
2. La distància entre el detector i la cubeta és relacionen
directament amb la sensibilitat dels mètodes aplicats
3. El model de dispersió depèn de la relació entre la mesura de
la partícula i la longitud d’ona de la radiació incident. Quan
són del mateix ordre, es produeix una dispersió de la
radiació en diferents angles, fet que facilita la seva mesura.

6. Nefelometria (IV)
L’equip de mesura és específic per a aquestes determinacions
i està dissenyat de manera quel detector pot variar de posició
respecte a la direcció de la radiació incident en uns angles
preestablerts

7. Nefelometria (V)
Si en un principi la mostra és transparent i al aplicar els
reactius apareixen les partícules en suspensió, per a ajustar
l’espectrofotòmetre utilitzarem un blanc-mostra, que
elimina el bloqueig de la radiació incident per causes alienes a
l’analit i degudes a la mostra.

8. Tipus de dispersions
Es mostren per a tres
mides de partícula,
corresponents a les
dispersions de Rayleigh,
Rayleigh-Debye i Mie.
L’angle de dispersió θ és el
que existeix entre els rajos
incident i dispersat. Així, θ
és 0° per a la dispersió directa
i 180° per a la dispersió que es
dirigeix cap a enrere.

9. D. Rayleigh D. R-Debye D. Mie
7000-40000 nm

11. Dispersió de la llum per diverses
molècules i cèl·lules a 340 i 630nm
Al augmentar la mida de les partícules respecte a la λ del raig
incident, la radiació dispersada es distribueix asimètricament
Partícules Mida
(nm)
λ (nm) Dispersió
IgG 8 340 - 630 Rayleigh / R
IgM 35 340 - 630 R-Debye / R
Immunocomplexos 20-100 340 - 630 R-Debye / R
α-Lipoproteïna 5-15 340 - 630 Rayleigh / R
β-Lipoproteïna 15-30 340 - 630 R / R-Debye
Quilomicrons 200-450 340 - 630 R-D / R-D
E. Coli 500 340 - 630 Mie / R-Debye
Eritròcits 7500 340 - 630 Mie / Mie

12. Turbidimetria
Mesura la radiació bloquejada per part de la mostra,
relacionant la intensitat del feix incident i del resultant
d’atravessar la cubeta
La detecció de la radiació transmesa es realitza en la mateixa
direcció quel feix incident ( = 0 ) i el senyal potθ ⁰
expressarse com absorbància o com transmitància

13. Turbidimetria(II)

14. Turbidimetria (III)
Aquest fenomen es regeix per la llei de Lambert-Beer: la
intensitat de radiació bloquejada per la mostra és directament
proporcional a la concentració de l’analit
L’equip de mesura en general és el mateix que en
espectroscopia d’absorció molecular en el rang del visible

15. Nefelometria i Turbidimetria
Estudi comparatiu (diferències i similituds)
Turbidimetria Nefelometria
Mesura Radiació no dispersada Rad. Dispersada
Equip Espectrofotòmetre Aparell específic
Sensibilitat Depèn de l’equip Depèn del blanc
Límit detecció Depèn de l’equip Depèn del blanc
Interferències Existeixen
de matriu
320-380 nm i des de 500 a 600nmλ
Mètodes A punt final Quantitatius
Cinètics Qualitatius
Recta patró
Aplicacions Determinació de proteïnes: Det. del calci
(mètode del ATCA) (precipitació amb
sals de P i S)
Cost Menor Major (cal aparell)
Angle feix incident 0 15-90⁰ ⁰