Trabalho de conclusão de curso.

1. CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA
INMETRO/SEEDUC-RJ/UFRJ/CECO
VINÍCIUS JOSÉ SIMÕES DE CARVALHO
Prospecção de microorganismos e enzimas celulolíticas na
microbiota intestinal do bicho-preguiça Bradypus variegatus
Xerém, Duque de Caxias
2016

2. Resumo
O crescimento da população e o desenvolvimento tecnológico vêm implicando
em um aumento da demanda energética. Atualmente, 80% da matriz energética global é
baseada em combustíveis fósseis e, como estes não são renováveis, há a necessidade de
se encontrar alternativas sustentáveis, evitando uma crise energética mundial. A
biomassa da cana representa 15,4% das energias renováveis no Brasil, é uma das
energias mais produzidas, porém não é explorado todo seu potencial, refletindo no
elevado custo de produção. Apenas o caldo da cana é aproveitado para a fermentação e
produção do etanol (denominado etanol de 1ª geração) e o bagaço da cana, que constitui
2/3 do total da biomassa é descartado ou usado de maneira ineficiente no aquecimento
de caldeiras. A utilização desses açúcares para a fermentação e produção de etanol é
muito difícil, sendo a obtenção de enzimas capazes de degradar celulose uma das
melhores maneiras de tornar esses glicídios aproveitáveis para a indústria de
biocombustíveis. Por isso, enzimas que sejam capazes de degradar celulose e xilana em
carboidratos fermentáveis têm grande importância na produção de etanol a partir de
lignocelulose, denominado etanol de segunda geração e estima-se que a utilização do
bagaço de cana como fonte de açucares para a produção de etanol seria capaz de dobrar
a produção deste biocombustível sem o aumento de área cultivada, o que oferece uma
vantagem ao etanol de segunda geração: a diminuição do conflito entre o uso da terra
para produção de alimentos e combustíveis. A segunda vantagem consiste em emissões
menores de gases de efeito estufa em relação ao etanol de primeira geração. No entanto,
os biocombustíveis produzidos a partir de celulose ainda não são produzidos a um nível
competitivo financeiramente, principalmente por causa dos elevados custos de produção
das enzimas celulolíticas.
Uma das principais maneiras de identificar tais enzimas é procurando na
natureza, em organismos onde a utilização de celulose como fonte de energia é
utilizada. O bicho preguiça (Bradypus variegatus) é um animal exclusivo das Américas
do Sul e Central que se alimenta apenas de folhas e é um herbívoro pouco estudado. Os
micro-organismos presentes em seu intestino podem ser capazes de digerir celulose e
xilana utilizando enzimas ainda desconhecidas. Portanto, este projeto teve como
objetivo a descoberta de novos microrganismos presentes na microbiota do B.
variegatus capazes de fornecer enzimas celulolíticas.

3. 1. Introdução
O século XX marcou a consolidação da industrialização, o consumo e a
produção em massa. Da mesma forma, nunca a natureza foi tão abundante em prover o
crescimento de matérias-primas para as indústrias e para a geração de energia. Nesse
período, o conceito de desenvolvimento tinha como meta apenas o progresso
(MIOTTO, 1996). Portanto, crescimento e desenvolvimento econômico eram conceitos
análogos. A ideia geral era que o crescimento provocava automaticamente o processo de
desenvolvimento econômico. Toda essa evolução econômica começou, entretanto, a
gerar problemas, pois o consumo e a produção em massa suscitaram consumo em massa
de matérias-primas e poluição em grandes proporções. Esse progresso era econômica e
ambientalmente insustentável a longo-prazo (AMSTALDEN, 1996).
81% (oitenta e um porcento) da oferta energética mundial, estimada em 11.435
milhões de toneladas equivalentes de petróleo, é baseada nos combustíveis fósseis (IEA,
2007). Além disso, a combustão de tais combustíveis libera grande quantidade de gases
do tipo estufa na atmosfera, especialmente o CO2, com grande influência no aumento
do aquecimento global, ocasionando impacto ambiental. Por isso, antes mesmo do
esgotamento de fontes fósseis de energia, é necessário encontrar alternativas para a
transição da matriz energética.
O Brasil é um país com grande investimento em energias renováveis. O etanol é
utilizado no Brasil como combustível desde a primeira metade do século 20. A partir da
década de 1930 foi iniciada a primeira política pública nacional visando à mistura do
álcool anidro à gasolina (OLIVEIRA, 2002), mas sua utilização em larga escala teve
início bem mais tarde, em 1975, quando o governo brasileiro criou o Programa Nacional
do Álcool (Proálcool). Reconhecidamente, a principal razão do Proálcool foi o aumento
dos preços do petróleo no mercado internacional, em 1973 e 1979, que demandaram
ações eficazes por parte do governo na substituição do petróleo e de seus derivados na
matriz energética nacional. À época das crises, os especialistas previam que os preços
do petróleo iriam continuar a crescer nos anos seguintes e o Brasil, que passava por um
período de notável crescimento econômico, tinha grande dependência externa de
petróleo (LEME, 2004). O etanol produzido desde o início do Proálcool é produzido a
partir da fermentação do caldo da cana-de-açúcar, esse tipo de produção do etanol é
também conhecido como etanol de 1ª (primeira) geração.

4. Biocombustíveis de primeira geração são derivados de açúcar ou amido, que são
facilmente extraídos e fermentados em etanol. Os biocombustíveis de segunda geração
são produzidos a partir de substratos lignocelulósicos ou a partir de resíduos agrícolas.
Sendo o principal obstáculo a conversão de celulose em etanol. Atualmente, o
biocombustível líquido à base de biomassa predominante é o etanol a partir de grãos de
milho e de caules da cana-de-açúcar (STICKLEN, 2006). No entanto, a produção de
biocombustíveis de primeira geração, muitas vezes compete com as culturas alimentares
por terra e só pode atender a uma fração limitada da exigência de combustível mundial
(FIELD et al., 2008). Lignoceluloses, como as mais abundantes matérias-primas
orgânicas, são consideradas como a melhor matéria-prima para a produção do
combustível etanol (CARROLL; SOMERVILLE, 2009). A Lignocelulose, por
proporcionar característica altamente energética das biomassas tem despertado o
empenho e atenção para a mesma com a finalidade de produzir o bioetanol de 2º
geração, como uma fonte de energia limpa e sustentável. Porém, sua produção apresenta
algumas dificuldades, principalmente na degradação da celulose. Para que sejam
gerados açúcares fermentáveis, é necessário quebrar os polissacarídeos e as enzimas são
a melhor estratégia para isso, por serem específicas e não gerar resíduos de complexo
tratamento.
Por isso tornou-se necessário a procura por enzimas que apresentem um
potencial biotecnológico para a degradação destas moléculas, (LYND, 1991), as
celulases. O custo de produção e o baixo rendimento dessas enzimas são os maiores
problemas para aplicações industriais (KANG et al., 2004). Surge então a necessidade
da prospecção de novas enzimas, com o objetivo de baratear e, por conseguinte
aumentar a produção de etanol de 2ª (segunda) geração.
As celulases são um conjunto de enzimas produzidas principalmente por
fungos, bactérias e protozoários que realizam a quebra da celulose e alguns
polissacarídeos relacionados. A qualquer complexo de várias enzimas que atuam em
sinergia para decompor material celulósico também é chamado de celulase
(Worthington Biochemical Corporation, 2014). Segundo Barkalow, as celulases
quebram a molécula de celulose em monossacarídeos, tais como beta-glucose, ou
polissacarídeos e oligossacarídeos mais curtos. A quebra da celulose é de considerável
importância econômica, porque torna o principal constituinte das plantas disponíveis
para o consumo e uso em reações químicas. A reação específica envolvida é a hidrólise
das ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, hemicelulose, lignina e beta-D-

5. glucanas. Como as moléculas de celulose ligam-se fortemente umas às outras, a quebra
de celulose é relativamente mais difícil comparada com a composição de outros
polissacarídeos, tais como amido. A maioria dos mamíferos só tem a capacidade de
digerir fibras alimentares, mas em muitos animais herbívoros, a celulose é digerida por
bactérias que atuam em simbiose produzindo celulases (BIGNELL. et al., 2011);
(WATANABE. et al., 1998)
Por isso, neste projeto focamos o trabalho com o bicho preguiça (Bradypus
variegatus) que é um animal exclusivo das Américas do Sul e Central que se alimenta
apenas de folhas e frutas além de ser um herbívoro muito pouco estudado. Os
microorganismos presentes em seu intestino podem ser capazes de digerir celulose e
xilana utilizando enzimas ainda desconhecidas. Dessa forma, procuramos
microorganismos capazes de degradar esses açúcares para avaliar a sua possível
utilização para degradação da lignocelulose.
2. Objetivos
2.1 Objetivos gerais
O objetivo do presente trabalho é, utilizando diversas ferramentas de biologia
molecular e bioquímica, buscar na microbiota intestinal do bicho preguiça
microorganismos e enzimas capazes de degradar celulose em açúcares fermentáveis.
Isso poderá, em última instância ajudar a aumentar a eficiência da produção de
bioetanol de segunda geração.
2.2 Objetivos específicos
- Isolar e identificar por meio de ensaio de coloração de gram microorganismos
da flora intestinal do Bradypus variegatus.
- Realizar ensaios de halo para detectar atividade celulolítica nos isolados.
- Avaliar a atividade dos compostos celulares por meio de zimografias e
comparação de bandas com SDS-Page.

6. - Purificar as amostras com métodos de precipitação por salting out.
3. Materiais e Métodos
3.1 Obtenção das amostras
As amostras deste trabalho foram obtidas com a ajuda da Professora Shery
Duque Pinheiro, da Universidade de Barra Mansa (UBM), situada no Estado do Rio de
Janeiro. Elas foram recolhidas no Parque Centenário de Barra Mansa (também
conhecido popularmente como Jardim das Preguiças) logo após o animal defecar, sendo
mantidas a -20°C por um mês em Barra Mansa e, posteriormente levado ao Laboratório
da Divisão de Metrologia Aplicada às Ciências da Vida (Dimav) no INMETRO e
armazenadas à -80°C até o uso.
3.2 Preparo de meio mínimo contendo Carboximetilcelulose (CMC),
xilana e celulose cristalina como fontes exclusivas de carbono
O meio mínimo foi feito usando uma vidraria do tipo Erlenmeyer de 1L, com
os reagentes e suas quantidades descritos na tabela 1. No preparo do meio liquido
não foi adicionado Agar.
Reagente Quantidade
Na2HPO4 5,2 g/L
KH2PO4 2,6 g/L
(NH4)2 SO4 2,4 g/L
Extrato de Levedura 0,4 g/L
MgSO4 7.H2O 0,2 g/L
CaCl2 0,2 g/L
CMC 6,2 g/L
Xilana 1,6 g/L
Avicel (Celulose cristalina) 0,2 g/L

7. NaCl 0,2 g/L
Agar 20 g/L
Tabela 1. Reagentes usados na confecção do meio mínimo.
3.3 Isolamento de microorganismos utilizando o meio mínimo como
substrato
O isolamento de microorganismos foi realizado de forma asséptica, com o
intuito de não agregar contaminantes oriundos de outras fontes que não a flora intestinal
do Bradypus variegatus.
Com o objetivo de eliminar os contaminantes ainda presentes nas amostras
recolhidas das fezes do bicho-preguiça, uma pequena fração das mesmas foi lavada duas
vezes com tampão fosfato-salino (em inglês, PBS). Após a lavagem das fezes, foi feita a
ressuspensão em 15mL de PBS e, depois de ser feita a homogeneização foi realizada
uma centrifugação a 4000 rotações por minuto (RPM) a 25ºC durante 5 minutos. O
sedimentado da centrifugação foi descartado e o sobrenadante foi recolhido para a
preparação das diluições. As diluições foram feitas usando a seguinte metodologia: na
primeira diluição a amostra foi diluída 100.000 vezes (10−5
), na segunda foi diluída a
1.000.000 vezes (10−6
) e na terceira a 10.000.000 vezes (10−7
).
As diluições foram inoculadas em placas de petri contendo meio mínimo de
acordo com a tabela 1. O procedimento foi realizado assepticamente em uma cabine de
segurança biológica (CSB), já estéril devido a exposição a raios ultravioletas (UV)
durante 20 minutos. Aos materiais que foram utilizados dentro da CSB, foram limpos
com álcool a 70%, sendo eles: pipetas, ponteiras para pipeta e alça de platina. Para a
esterilização completa da alça de platina, houve a flambagem ao rubro com o auxilio de
uma lamparina. Em seguida, a alça foi mergulhada em cada uma das diluições
(separadamente, a fim de evitar contaminações) e em seguida com o intuito de uma
cultura pura, foi usado o método de esgotamento por estrias. A cada inserção nos tubos
com as diluições houve a flambagem da alça de platina, e após esfriar a mesma coletou-
se parte do material das diluições. Em seguida, esse material foi espalhado ao longo da
placa, formando as estrias em placas de petri, lembrando sempre de manter as placas ao
redor da chama da lamparina. Em seguida, as placas inoculadas foram incubadas em
uma estufa a 37ºC durante 48hrs.

8. Com o surgimento das colônias, os inóculos foram mantidos na geladeira
(abaixo de 10ºC). Foram selecionadas as colônias que cresceram de forma isolada em
cada uma das três placas para serem replicadas em meio líquido. Os isolados foram
desenvolvidos em 10 mL de meio líquido (conforme a tabela 1) em tubos de
polipropileno do tipo Falcon de 15 mL por pelo menos 48 horas à 37ºC e 100 RPM no
shaker New Brunswick™ Innova® 42. Para o armazenamento dos isolados obtidos, 1,5
mL do meio de cultura foi dispensado em criotubos e acrescentado de 0,5 mL de
glicerol 100%, obtendo uma concentração final de 25% de glicerol. Os tubos foram
homogeneizados e mantidos em ultrafreezer a -80ºC.
3.4 Identificação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
utilizando coloração de Gram
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular,
sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicana e ácido
teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicana, sobre a qual se
encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e
lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool extrai os
lipídeos, originando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular
das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser
retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias
gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o
complexo CVI não pode ser extraído. (Ribeiro, et al., 1993); (Pelczar Jr, et al., 1993).
A metodologia consistiu em primeiramente realizar um esfregaço, que consiste
em estriar, com o auxilio de uma alça de platina, uma colônia da cultura desejada no
centro de uma lâmina de microscópio. Seguidamente, as lâminas contendo os esfregaços
foram levadas a chama de uma lamparina, até que os esfregaços estivessem secos. A
cada etapa realizada abaixo foram intercaladas lavagens com água destilada, com o
objetivo de retirar o excesso dos reagentes. Então, para a primeira etapa da coloração de
Gram foi aplicado o corante cristal-violeta por 60 segundos e, em seguida o lugol por
60 segundos. O lugol é utilizado como fixador (mordente) por se ligar ao corante
criando um composto insolúvel. Nesta etapa, o cristal-violeta cora células que

9. apresentam os dois tipos de membrana. Na etapa seguinte, foi feita a descoloração
usando o álcool 45% durante 10 a 20 segundos. O álcool age dissolvendo a membrana
externa das bactérias Gram-negativas, permitindo assim a saída do composto cristal-
violeta e lugol. Sendo assim, o composto continua na membrana das bactérias Gram-
positivas, deste modo, ao final desta etapa, apenas as bactérias Gram-positivas
permaneceram coradas. Por último, foi aplicado um contra-corante, a fim de corar as
bactérias Gram-negativas. Para isso, aplicou-se fucsina às lâminas durante 20 segundos.
Novamente foi realizada uma lavagem com água destilada e as lâminas foram secas
com o auxilio de papel-toalha. Para a manutenção dos esfregaços foi aplicado uma
lamínula sobre a lâmina e a mesma foi selada com esmalte incolor. Com isto, as lâminas
foram levadas a um microscópio óptico para identificação de quais isolados continham
bactérias Gram-positivas (coloração roxa) ou Gram-negativas (coloração vermelha ou
rosa).
3.5 Detecção de atividade celulolítica por meio de ensaios de halo
Esta etapa foi realizada com o intuito de detectar atividades celulolíticas nos
isolados. Este processo é baseado na visualização de halos revelados pela adição de
corante vermelho Congo 0,1% na presença de enzimas celulolíticas. A formação do halo
ocorre, pois, para o desenvolvimento das colônias, as bactérias necessitam de açúcares
mais simples (preferencialmente, monossacarídeos), por isso acabam por degradar a
celulose presente no substrato. A região da placa apresenta um tom avermelhado
quando o polímero não foi degradado, já quando há a degradação do polímero o local
assume uma coloração amarelada. Inicialmente, as bactérias já estavam em cultura
liquida conforme o substrato descrito na tabela 1, então foi feito o inóculo em placas de
petri com meio sólido. Logo após, foram deixadas em uma estufa a 37ºC durante 48hrs.
Posteriormente, as placas foram lavadas com água destilada, tendo como
objetivo a retirada do excesso das colônias. Logo após, foram coradas com vermelho
Congo a 0,1%, adicionando-se 10mL por placa durante 30 minutos. Para retirar o
corante que não se ligou aos polissacarídeos, foram realizadas 2 lavagens com cloreto
de sódio (NaCl) a 1M durante 30 minutos, intercalando-se com lavagens com água
destilada.

10. Reagentes Stacking gel 4% (µL) Resolving gel 10% (µL)
Água Deionizada 1463 µL 1550 µL
Tris-HCl 1.5M pH 8.8 - 1250 µL
Tris-HCl 0.5M pH 6.8 625 µL -
SDS 20% 12,5 µL 25 µL
40% Acrilamida 244 µL 1218 µL
2% Bis-Acrilamida 130 µL 650 µL
APS 10% 25 µL 50 µL
TEMED 2,5 µL 5 µL
CMC 2% - 250µL
3.6 Avaliação de potencial celulolítico por zimografias
Zimografia é uma técnica eletroforética que permite observar atividade
enzimática. É realizada em gel de poliacrilamida e se diferencia de outras eletroforeses
em proteínas, pois não é realizado sob condições desnaturantes (como o SDS-Page) e
sim sob condições suaves com o intuito de não perder a atividade das enzimas. Tem
como objetivo principal a identificação das bandas com melhor separação e com melhor
degradação do substrato (nesse caso, CMC) para posterior identificação por
espectrometria de massas. O gel é dividido em dois: gel de separação (stacking gel) e
gel de corrida (resolving gel). Os reagentes e o volume utilizado para cada um deles é
descrito na tabela 2. O resolving gel é o primeiro a ser aplicado, seguindo à sua
aplicação é colocado com o auxílio de uma pipeta isobutanol, que por apresentar
densidade mais baixa que a solução do gel de corrida fica na parte superior das placas
de vidro. Após a polimerização, o isobutanol foi removido e foi aplicado o stacking gel.
Então, foi inserido o pente para formação dos poços. Com o gel totalmente
polimerizado, a cuba para a corrida pôde ser montada. Preencheu-se a cuba com o
tampão de corrida Tris-glicina pH 8,3. As amostras foram aquecidas por 10 minutos a
uma temperatura de 70ºC antes de serem aplicadas no gel, com o objetivo de reduzir as
estruturas quaternárias presentes em algumas enzimas. A corrida foi realizada a 4ºC
para minimizar a atividade enzimática das amostras e evitar que iniciassem a

11. degradação dos polímeros de celulose nesse momento. Ao fim da corrida, todo aparato
foi desmontado e o gel passou por algumas lavagens com água destilada e duas
lavagens de 10 minutos cada de tampão acetato de sódio 20mM pH 6,0. Tais lavagens
visam a remoção do detergente SDS, para que as proteínas possam voltar a sua
conformação original. Então, o gel foi incubado em tampão acetato de sódio por
aproximadamente 2 horas a 37ºC em um shaker. Em seguida, foi corado com uma
solução do corante vermelho Congo a 0,1% durante 20 minutos. E depois, descorar com
lavagens em solução de NaCl 1M até aparecerem as bandas, intercalando com lavagens
com água destilada.
3.7 Precipitação proteica por salting out usando Sulfato de Amônio
Para purificações intermediárias das enzimas produzidas nos meios de cultura
foram realizadas precipitações com sulfato de amônio, que provoca o efeito salting out
– precipitação de proteínas com altas concentrações de sal, o sal atrai as moléculas de
água do meio, de modo que uma menor quantidade de água fica disponível para as
proteínas, o que acarreta na diminuição da solubilidade e, por conseguinte, acontece a
precipitação (MARTINS ; BORTOLOTTO, 2011). Os cultivos em meio mínimo
líquido (segundo a tabela 1) das amostras foram centrifugados por 15 minutos a 4.000g
e à temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi transferido para tubos de polipropileno do
tipo Falcon. Os cálculos para estimar a quantidade de sulfato de amônio necessária para
precipitação na concentração de 85% foram realizados através do programa Ammonium
Sulfate Calculator- EnCor Biotechnology Inc. A concentração de 85% foi adotada, pois
garante a concentração de grande parte das proteínas presentes na amostra. Após
adicionar o volume necessário de sulfato de amônio aos tubos, as amostras foram
incubadas no shaker New Brunswick™ Innova® 42 durante 1 hora a temperatura
ambiente. Posteriormente, foram novamente centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a
4ºC. Assim, os sobrenadantes foram descartados e os pellets (onde estavam as
proteínas) foram ressuspendidos em 1 mL de tampão citrato de sódio 20 mM pH 6,0.
4. Resultados

12. 4.1 Isolamento de microorganismos e identificação por ensaio de
coloração de Gram
Por meio do isolamento de microorganismos, trinta amostras foram escolhidas e
nomeadas como: A5’, A51, A52, A10, A10’, A16, A17, A18, A22, A22’, A27, B2, B8,
B8’, B101, B102, B17, B20, C8, C15, ES1, ES2, ES3, IN1, IN2, MA, XA22, XB2, XB8,
XC8.
O método de coloração de Gram também foi realizado para as trinta amostras
acima descritas. O trabalho de Isabella Thomaz da Silva (DA SILVA, 2014) foi
realizado anteriormente ao presente trabalho, sendo assim dispensando a técnica, já que
a classificação das amostras já havia sido realizada. No ensaio realizado foi detectado
que todas as bactérias são Gram negativas.
4.1 Detecção de atividade celulolítica por meio de ensaios de halo
O ensaio de halo também foi realizado com as trinta amostras pelas alunas
Isabella Thomaz da Silva (DA SILVA, 2014) e Camila Neves de Assis (ASSIS, 2015),
ao término do trabalho das mesmas, foram escolhidas oito amostras para seguir com os
demais procedimentos, que foram: A51, A5’, A17, A22, B17, B20 e ES2. No presente
trabalho, as amostras foram restringidas a apenas duas, que são: A5’ e A17. As escolhas
foram baseadas no tamanho do halo de degradação, ou seja, as amostras que
apresentaram um bom potencial celulolítico foram as escolhidas.
5. Dificuldades surgidas

13. 6. Referências Bibliográficas
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