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imobilizadas tem sido considerado        Uma desvantagem é que o estado                  da por causa do aumento da densid...
Figura 1 - Métodos de imobilização de enzimas e célulaslas de maneira natural ou artificial-                utilizados, pe...
Figura 2 - Tipos de reatores para trabalhos com células imobilizadas:(a) reator de mistura; (b) reator de leito empacotado...
de inibição pelo substrato (FUKUDA,                  as fases líquidas e sólidas podem         bém referencia outros traba...
Tabela 1 - Exemplos de suportes utilizados para a imobilização de enzimas                                                 ...
ampliação de escala de produção e a                  poliacrilamida. A poliacrilamida é um    Lactobacillus rhamnosus, par...
células. Os reatores com células imo-        GONZÁLEZ, M.I.S. Lactose                        VA, S.S. Uso de biocatalisado...
surface modified gel (CSMG): An                      Eupergit C â-galactosidase from        Process Biochemistry, v.15, p....
Enzymatic, v.21, p.299-308, 2003.       Microencapsulation of microbial            SANTOS, P.S.; LIMA, U.A.; SANTOS,      ...
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Biocatalizadores 36

  1. 1. BIOCATALIZADORES Pesquisa IMOBILIZADOS Uso de células e enzimas imobilizadas em processos biotecnológicosLarissa Canilha cipais vantagens propiciadas pelaEngenheira Química, Mestre e Doutora em 1 RESUMOBiotecnologia Industrial imobilização (VITOLO, 1988; CAR-Departamento de Biotecnologia VALHO, CANILHA e SILVA, 2006).Escola de Engenharia de Lorena (EEL) A imobilização de células ou Existem dois tipos de leito paraUniversidade de São Paulo (USP)larissa@debiq.faenquil.br enzimas representa uma alternativa a imobilização de células, os que as para a condução de bioprocessos aprisionam fisicamente e os que asWalter de Carvalho uma vez que, teoricamente, os aderem à superfície. No primeiroFarmacêutico, Mestre e Doutor em Biotecnologia biocatalisadores imobilizados ficam caso, são encapsuladas em glóbulosIndustrial - Professor e pesquisador retidos para serem utilizados por tem-Departamento de Biotecnologia ou fibras feitas de polissacarídeos, deEscola de Engenharia de Lorena (EEL) po indefinido. proteínas ou de polímeros sintéti-Universidade de São Paulo (USP) É difícil definir quais os melho- cos. No segundo, as células são fixa-carvalho@debiq.faenquil.br res suportes e técnica de imobiliza- das ao suporte de imobilização dire- ção a serem utilizados na imobiliza- tamente por ligações químicasJoão Batista de Almeida e Silva ção de células ou enzimas específi- (iônicas ou covalentes) (MEERSMAN,Engenheiro Químico, Mestre em Ciência eTecnologia de Alimentos , Doutor em Tecnologia cas, pois há uma ampla variação não 1992). Como exemplo de um mate-Bioquímico-Farmacêutica só nas características dos materiais a rial para adesão superficial de célulasProfessor e pesquisador serem imobilizados, mas também nasDepartamento de Biotecnologia destaca-se DEAE celulose (dietilEscola de Engenharia de Lorena (EEL) condições prevalecentes durante o amino etil celulose), material durá-Universidade de São Paulo (USP) processo. vel, inerte e não poroso, além dejoaobatista@debiq.faenquil.br A presente revisão busca deta- fraco trocador iônico. Suas partículasImagens cedidas pelos autores lhar alguns dos principais suportes têm superfície suficientemente irre- utilizados para a imobilização de cé- gular para formar um traçado perme- lulas ou enzimas, visando à produção ável de alta resistência ao entupi- de insumos de interesse industrial a mento. Este material tem mais afini- partir de diferentes matérias-primas. dade com leveduras do que com bactérias. As leveduras imobilizadas 2 INTRODUÇÃO em DEAE celulose são aplicadas na maturação contínua de cerveja e na 2.1 O que é imobilização? produção de cerveja livre de álcool A imobilização pode ser defini- ou de baixo teor alcoólico da como o movimento não indepen- (MEERSMAN, 1992; Van IERSEL et dente das células ou enzimas na al., 2000). Como exemplos de mate- parte aquosa do sistema, por esta- rial usado para o aprisionamento físi- rem alojadas dentro ou na superfície co de células, destacam-se as mem- do agente imobilizador (TAMPION e branas de alumina, que promovem o TAMPION, 1988). A imobilização tam- alojamento das células no interior de bém é definida como a fixação de seus poros irregulares, formando uma enzimas ou células vivas em um trama permeável de alta resistência ambiente, de maneira que sua ativi- ao entupimento e reduzindo ao mí- dade catalítica não seja afetada ne- nimo as contaminações gativamente (CANTARELLI, 1989). (BORENSTEIN, 2003). O uso em processo contínuo, o au- mento da estabilidade e o 2.2 Imobilização versus reaproveitamento do material bioló- células livres gico são considerados como as prin- O uso de sistemas com células48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006
  2. 2. imobilizadas tem sido considerado Uma desvantagem é que o estado da por causa do aumento da densida-como uma alternativa viável para se fisiológico dos organismos não pode de celular. Assim é possível conduziraumentar a produtividade em razão ser controlado (BORENSTEIN, 2003). a operação contínua com alta taxa dedas elevadas densidades celulares Isto é particularmente prejudicial nos diluição, atingir rendimento especí-normalmente obtidas (RAMA- sistemas em que o metabólito se- fico mais alto, eliminar fermentadoresKRISHNA e PRAKASHAM, 1999). cundário é o produto principal, pois mais caros e exercer controle fácil e A imobilização eleva a atividade é produzido na fase estacionária ou mais eficiente do processofermentativa da levedura, promo- de decréscimo de atividade fermentativo (KOLOT, 1980).vendo a adaptação das células ao (HAMDY, KIM e RUDTKE, 1990). Quando os cofatores são neces-meio e eliminando a fase lag em Resumidamente, há três moti- sários no processo biotecnológico, obateladas sucessivas de fermentação vos básicos para aceitar a imobiliza- uso de células é preferível ao de(DURAN e BAILEY, 1986). Em siste- ção de células: 1-reutilizar o enzimas imobilizadas, pois as célulasmas contínuos, há uma diminuição biocatalisador por mais de um ciclo possuem a capacidade de regenerardo risco de contaminação em opera- fermentativo; 2- usar um processo os cofatores naturalmente, além deções com altas taxas de diluição e contínuo sem reciclo celular; 3- au- não requerer etapas de extração ealta concentração de células, haven- mentar a estabilidade do purificação, apresentar menor custodo também redução da formação de biocatalisador em relação às varia- e maior resistência a perturbaçõessubprodutos por células residuais e ções de pH, temperatura, concen- ambientais. As células podem sereliminando a necessidade de remo- tração de nutrientes ou do meio de imobilizadas sem perda significativação das células ou de reciclo, tornan- fermentação (HAMDY, KIM e de sua atividade catalítica e, portan-do a extração do produto mais efici- RUDTKE, 1990). to, são mais eficazes quando se trataente (WILLIAMS e MUNNECKE, Atualmente, a importância e o de catalisar uma série de reações1981). Em sistemas com células imo- interesse desta tecnologia são ilus- subseqüentes, além de apresenta-bilizadas consegue-se maior massa trados pelo grande número de publi- rem alta estabilidade operacional ede células por unidade de volume de cações observadas nos últimos anos de armazenamento (CORCORAN,trabalho do que em sistemas e também pela estabilização de al- 1985).descontínuos, contínuos e de recu- guns processos em escala industrialperação de células trabalhando com (FREEMAN e LILLY, 1998; 3 MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃOcélulas livres (WILLIAMS e RAMAKRISHNA e PRAKASHAM, E TIPOS DE SUPORTEMUNNECKE, 1981; PILKINGTON, 1999; Van IERSEL et al., 2000; CAR-MARGARITIS e MENSOUR, 1998). VALHO et al., 2005). O método e o tipo de suporte aOutras vantagens do uso de células serem empregados em um determi-imobilizadas em relação ao uso de 2.3 Células imobilizadas nado processo devem ser estabele-células em suspensão no meio de versus enzimas imobilizadas cidos empiricamente, recaindo a es-fermentação são: a facilidade de A dificuldade em se recuperar a colha do binômio suporte-métodoreutilização dos biocatalisadores, o enzima do meio reacional ao final da sobre aquele que apresentar maioraumento da estabilidade destes catálise, aliada à instabilidade e fre- retenção da atividade. A escolha dobiocatalisadores e a redução de cus- qüente inadequabilidade para uso método de imobilização e do tipo detos operacionais (PILKINGTON, em determinados solventes e/ou con- suporte dependerá basicamente deMARGARITIS e MENSOUR, 1998; dições de pH, temperatura e expo- dois fatores: 1- das característicasRAMAKRISHNA e PRAKASHAM, sição a agentes desnaturantes, po- peculiares do material biológico; 2-1999; CARVALHO, CANILHA e SIL- dem ser superadas por meio da imo- das condições de uso do sistemaVA, 2006). O sistema que usa células bilização. A enzima imobilizada pode imobilizado. Face à variabilidadelivres de leveduras em modo contí- ser reutilizada e é normalmente mais destes fatores, pode-se afirmar quenuo de fermentação é limitado, uma estável em relação à enzima livre, não existe um método geral de imo-vez que podem ocorrer perdas de com a vantagem adicional de possi- bilização e nem um suporte univer-células no fermentador. Além disso, bilitar a utilização de um processo sal, adequados para qualquer pro-as células imobilizadas são mais re- contínuo (CARVALHO, CANILHA e cesso (CORCORAN, 1985; VITOLO,sistentes a condições adversas, uma SILVA, 2006). Porém, à medida que 1988).vez que a matriz de imobilização os estudos com células imobilizadasgeralmente resulta em maior prote- avançaram, observou-se que a imo- 3.1 Métodos de imobilizaçãoção a estas células. Por este motivo, bilização de células é mais vantajosa Existem vários métodos para aprocura-se produzir etanol com cé- em relação à imobilização de imobilização de biocatalisadores. Es-lulas imobilizadas (LEE, AHN e RYU, enzimas, pois evita o trabalho de tes métodos podem ser divididos1983). extraí-las dos microorganismos para em quatro grandes grupos, confor- Os reatores com células imobili- fixá-las, em seguida, a um suporte me ilustrado na Figura 1.zadas permitem alto desempenho (CHIBATA, TOSA e SATO, 1983). O método de imobilização porporque trabalham com altas densida- Nos processos onde há imobilização meio de auto-agregação envolve ades de células fixadas nos suportes. de células, a fermentação é acelera- agregação ou a floculação das célu- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 49
  3. 3. Figura 1 - Métodos de imobilização de enzimas e célulaslas de maneira natural ou artificial- utilizados, permitindo a ligação do Como principais desvantagens sãomente induzida. Desta forma, os biocatalisador também à estrutura citadas: o pequeno volume disponí-biocatalisadores são ligados entre si superficial interna. Por outro lado, a vel para a contenção das célulassem a necessidade de uso de um imobilização por meio de ligações imobilizadas, a perda de células parasuporte de imobilização. A floculação covalentes resulta em uma interação o meio de fermentação e a instabili-natural é uma propriedade de relati- biocatalisador-suporte mais forte, dade dos suportes normalmente uti-vamente poucas células. Além disso, sendo a principal desvantagem o lizados, que limita a utilização dosagregados celulares naturais são ge- risco de danos à membrana celular, agregados por longos períodos (PARKralmente instáveis e sensíveis a ten- no caso de imobilização de células e CHANG, 2000; PRADELLA, 2001).sões de cisalhamento, sendo neces- ( G R O B O I L L O T et al., 1 9 9 4 ; O método de imobilização porsária a adição de agentes químicos PRADELLA, 2001). meio de contenção por barreiras en-que formam ligações cruzadas entre A imobilização por meio de apri- volve a utilização de membranascélulas, como glutaraldeído, durante sionamento em matrizes porosas, pré-formadas (reatores do tipoa imobilização (GROBOILLOT et al. , como o alginato e a carragena, nor- hollow fiber) ou a formação in situ1994). malmente envolve a sintetização in da membrana em torno das células a O método de imobilização por situ da matriz porosa em torno dos serem imobilizadas (KAREL, LIBICKImeio de ligação a superfícies pode biocatalisadores a serem imobiliza- e ROBERTSON, 1985). Este método,ser realizado por meio de interações dos. Os poros da matriz formada são também conhecido comoiônicas ou adsortivas, ou através de menores que as células contidas no encapsulamento, tem sido utilizadoligações covalentes entre grupos interior (PRADELLA, 2001). Este como uma tecnologia alternativa aoreativos do suporte e do método tem sido extensivamente aprisionamento em matrizes poro-biocatalisador. A ligação por meio de estudado para a imobilização de cé- sas, uma vez que oferece vantagensadsorção e/ou interações iônicas é lulas viáveis, devido à possibilidade como maior capacidade de conten-um método simples e barato, exis- de uso de polímeros hidrofílicos ção de células e prevenção da perdatindo a possibilidade de regenerar a biocompatíveis como suportes de de células para o meio de fermenta-matriz utilizada, porém apresenta imobilização (GROBOILLOT et al., ção. Devido à ausência de núcleocomo desvantagem a vulnerabilidade 1994). Além disso, as células imobi- gelificado, as limitações à transferên-de perda dos biocatalisadores imobi- lizadas em uma matriz hidrofílica cia de massa também são reduzidaslizados para o meio reacional impe- podem ser protegidas de condições (PARK e CHANG, 2000).dindo o trabalho em condições mui- não adequadas de pH, temperatura, Face ao exposto, todos os mé-to severas. Para aumentar a massa de solventes orgânicos e/ou compostos todos de imobilização apresentambiocatalisadores imobilizados, supor- inibidores presentes no meio de fer- vantagens e desvantagens. Emborates porosos têm sido geralmente mentação (PARK e CHANG, 2000). a estabilidade das células não possa50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006
  4. 4. Figura 2 - Tipos de reatores para trabalhos com células imobilizadas:(a) reator de mistura; (b) reator de leito empacotado; (c) reator de leito fluidizadoser garantida em todos os casos, as custo de imobilização, facilidade de reator para o cultivo de células imo-seguintes vantagens são citadas: operação em grande escala, não apre- bilizadas são: 1- requerimentos deinóculo retido no suporte, possibili- sentar toxidez as células, apresentar transferência de massa (principal-dade de melhor controle das propri- alta capacidade de retenção e ter mente suprimento de oxigênio eedades reológicas do meio, maior resistência mecânica para uma longa remoção de gases), 2- método depureza e rendimento de produtos, vida operacional (NAGASHIMA, imobilização empregado, 3- caracte-não há necessidade de extração e 1984; PRADELLA, 2001). Os supor- rísticas da matriz de imobilizaçãopurificação das enzimas e podem ser tes inorgânicos são mais vantajosos utilizada, 4- natureza do substrato, 5-esperados resultados econômicos que os orgânicos pela durabilidade, requerimentos para o cultivo domais favoráveis (GROBOILLOT et densidade, estabilidade e controle microorganismo utilizado (FUKUDA,al., 1994; PRADELLA, 2001). de porosidade (NAGASHIMA, 1984). 1994; PILKINGTON, MARGARITIS e Segundo MOUEDDEB et al. (1996), MENSOUR, 1998). A escolha inade- 3.2 Tipos de suporte os materiais inorgânicos também quada do reator pode provocar rom- Na literatura são citados inúme- apresentam como vantagem a facili- pimento do suporte de imobilização.ros materiais inertes que podem ser dade de esterilização e limpeza. Desta forma, é importante escolherusados como suportes. A natureza um reator que permita uma adequa-física destes suportes varia desde 3.3 Tipos de reatores da mistura do meio sem provocarmateriais geliformes (alginato, álco- utilizados com células danos a matriz de imobilizaçãool polivinílico, carragena, etc) até imobilizadas (PILKINGTON, MARGARITIS esuperfícies sólidas (vidro poroso, Os reatores para trabalhos com MENSOUR, 1998).Eupergit C, alumina, etc). Os supor- células imobilizadas podem ser divi- Os reatores de mistura repre-tes podem ser classificados em cinco didos em três categorias, de acordo sentam o tipo de reator mais ampla-tipos fundamentais: 1. microporosos com o padrão de fluxo: reatores de mente utilizado para o cultivo deou não porosos (vidro, sílica, nylon); mistura, reatores de leito empacota- células em suspensão, seja em esca-2. microencapsulados (nitrocelulose, do e reatores de leito fluidizado (Fi- la laboratorial, seja em escala indus-triacetato de celulose); 3. polímeros gura 2). Estes reatores podem tam- trial (BARON, WILLAERT, BACKER,com moderado grau de ligações cru- bém ser modificados para melhorar 1996). Embora vários tipos de turbi-zadas (poliacrilamida); 4. polímeros as características de transferência de nas possam ser utilizados, a principalcom baixo grau de ligações cruzadas massa e a capacidade de controle desvantagem relativa ao uso deste(sephadex, DEAE celulose); 5. das condições de cultivo ou para tipo de reator para o cultivo demacroporosos (sílica, alumina) minimizar o estresse imposto ao su- células imobilizadas refere-se à ten-(VITOLO, 1988; GERBSCH e porte de imobilização (FUKUDA, são de cisalhamento imposta a matri-BUCHHOLZ, 1995). 1994; BARON, WILLAERT e BACKER, zes sensíveis (GROBOILLOT et al., Os materiais utilizados como su- 1996). 1994). Este reator apresenta vanta-portes deveriam idealmente ser en- Os fatores que devem ser leva- gens como fácil controle de tempe-contrados com facilidade e abundân- dos em consideração quando da es- ratura e pH, e a sua operação emcia, ter baixo custo, resultar em baixo colha de um determinado tipo de modo contínuo é adequada em casos Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 51
  5. 5. de inibição pelo substrato (FUKUDA, as fases líquidas e sólidas podem bém referencia outros trabalhos que1994). Além disso, oferece as me- estar sendo adequadamente mistu- usaram este suporte para a imobili-lhores características de mistura e radas ou não. Desta forma, depen- zação de enzimas.transferência de oxigênio dendo das condições hidrodinâmicas(GROBOILLOT et al., 1994). do sistema, os agregados celulares 3.4.2 Alumina Nos reatores de leito empacota- podem sofrer limitações de transfe- A alumina é um materialdo, os agregados imobilizados são rência de massa, o que irá prejudicar inorgânico, inerte, poroso, transpa-empacotados em uma coluna, atra- as taxas de produção (GROBOILLOT rente, estável e não tóxico além devés da qual o meio de fermentação é et al., 1994). apresentar boa durabilidadepassado. Apesar da simplicidade de (ALBRAS, 2003). Em ensaios quedesign e baixo custo, este tipo de 3.4 Suportes utilizados para a fizeram uso da alumina para a imobi-reator é mais utilizado em fermenta- imobilização de enzimas lização de enzimas, foi constatadoções anaeróbicas. Para cultivos Existem diversos materiais que que este suporte é um material bas-aeróbios, entretanto, a aeração do podem ser utilizados como suporte tante resistente a altas temperaturasmeio de fermentação geralmente não para a imobilização de enzimas. En- e pHs (COSTA et al., 2001). Confor-é suficiente para oxigenar todo o tre eles, Eupergit C, alumina e sílica me descrito por IDA, MATSUYAMAreator devido à depleção rápida do (Tabela 1) têm sido bastante repor- e YAMAMOTO (2000), a membranaoxigênio no início da coluna tados na literatura. de alumina pode ser usada como(GROBOILLOT et al., 1994). Além suporte para a imobilização dedisso, desvios do comportamento 3.4.1 Eupergit C enzimas, pois ela é mecanicamenteideal de fluxo, do tipo plug flow, são Eupergit C é um suporte que forte e quimicamente estável. Porconstantemente observados durante consiste em microesferas estas e outras características aas fermentações por motivos diver- macroporosas, desenvolvido através alumina vem sendo utilizada na imo-sos (acúmulo de gases como de CO 2, da copolimerização de N,N’- bilização de diversas enzimas:compactação do leito, acúmulo de metileno-bis-metacrilamida, glicidil- catalase de Bacillus sp., para obiomassa suspensa), levando à for- metacrilato, alil-glicidil-éter e tratamento de efluentes têxteis (COS-mação de caminhos preferenciais, o metacrilamida. Este suporte é quimi- TA et al., 2001); glicoamilase de A.que prejudica as taxas de produção camente estável em qualquer valor niger ( I D A , M A T S U Y A M A eatravés de limitações à transferência de pH, ou seja, pode imobilizar uma YAMAMOTO, 2000); lipase dede massa (FUKUDA, 1994). enzima em qualquer faixa de pH Candida antarctica , para síntese de Os reatores de leito fluidizado entre 0 e 14, na qual ela é estável e butil butirato (LOZANO et al., 2002);representam um compromisso entre não perde a sua atividade catalítica. amilase de Bacillus subtilis, utiliza-os reatores de mistura e os reatores Eupergit C também é mecanicamen- da nas indústrias alimentícias ede leito empacotado, aliando as boas te estável, uma vez que não apre- fermentativas (RESHMI, SANJAY econdições de mistura (característica sentou nenhum desgaste após 650 SUGUNAN, 2006).dos reatores de mistura) às baixas ciclos de operação em reatores de A alumina, a quitosana e a celu-tensões de cisalhamento (caracterís- mistura com volumes de substrato lose também foram utilizadas comotica dos reatores de leito empacota- de até 1000L (KATCHALSKI-KATZIR suportes na imobilização da enzimado). Em contraste com os reatores de e KRAEMER, 2000). Este suporte já catalase de A. niger, para a decom-leito empacotado, os reatores de foi avaliado para a imobilização de posição de peróxido. O sistema queleito fluidizado facilitam a mistura várias enzimas: β-galactosidase de resultou em maior atividade foi aentre as fases líquida e sólida, facili- Bacillus circulans, α-galactosidase imobilização em glutaraldeído-celu-tam a remoção de gases e minimizam de Aspergillus oryzae, para transfor- lose. A atividade da catalase ema pressão sobre o leito de agregados mar lactose em glicose e galactose, glutaraldeído-celulose foi aumentan-imobilizados. Para a obtenção de boas ou produzir galacto-oligossacarídeos do após alguns meses de estocagem,características de fluidização, a dife- (HERNAIZ e CROUT, 2000); provavelmente devido à formaçãorença de densidade entre os agrega- ciclodextrina glicosiltransferase de ligações covalentes entre ados celulares e o meio de fermenta- (CGTase) de Thermoanaerobacter enzima e o suporte, desenvolvidosção deve ser a maior possível. Desta sp., para a formação de ciclodextrina com o tempo. Já a enzima imobiliza-forma, géis de hidrocolóides (MARTÍN et al., 2003); β-glicosidase da na alumina ficou inativa e a estru-hidratados, como alginato de cálcio, de Aspergillus niger (Novozyme tura da enzima imobilizada nanão são recomendados devido à se- 188), para produção de etanol a quitosana foi destruída (EBERHARDTmelhança de densidades entre o partir de hidrolisados lignocelulósicos et al. , 2004).polímero e o meio de fermentação (TU et al., 2006); lipase de Candidaaquoso. Dependendo do tamanho e rugosa, para produção de glicerol 3.4.3 Sílicadensidade do suporte, das taxas de (KNEZEVIC et al., 2006). A revisão Sílica é um produto sintético,fluxos de gases e líquidos e da geo- elaborada por KATCHALSKI-KATZIR produzido pela reação de silicato demetria do leito, diversos padrões de e KRAEMER (2000) apresenta uma sódio e ácido sulfúrico. Ao seremmistura podem ser obtidos nos quais visão detalhada do assunto e tam- misturados, forma-se um hidrosol que52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006
  6. 6. Tabela 1 - Exemplos de suportes utilizados para a imobilização de enzimas lentamente se contrai para formar uma estrutura sólida de sílica gel, Suporte Microorganismo E nz ima Referência também chamada hidrogel. A sílica gel é bastante utilizada como supor- Bacillus circulans ß-galactosidase Hernaiz e Crout (2000) te para a imobilização de enzimas Aspergillus oryzae α -galactosidase Hernaiz e Crout (2000) por apresentar as seguintes vanta- Ciclodextrina gens: possui alta resistência mecâni-Eupergit C Thermoanaer obacter sp. Martín et al. (2003) glicosiltransferase ca, estabilidade térmica e química; possui alta resistência à contamina- Aspergillus niger ß-glicosidase Tu et al. (2006) ção e à degradação microbiana; apre- Candida rugosa Lipase Knezevic et al. ( 2006) senta elevada área superficial poro- Bacillus sp. Catalase Costa et al. (2001) sa (PEREIRA e KUBOTA, 2004; DAVID et al., 2006). Conforme des- Ida, Matsuyama e A. niger Glucoamilase Y amamoto (2000) crito na Tabela 1, sílica gel foi utili-Alumina zada como suporte na imobilização Candida antarctica Lipase Lozano et al. ( 2002) das seguintes enzimas: lipase de Reshmi, Sanjay e Candida cylindracea, que catalisa a Bacillus subtilis Amilase Sugunan (2006) hidrólise de triacilglicerol em ácidosAlumina, Quitosana graxos livres e glicerol (MORENO e A. niger Catalase Eberhardt et al. (2004)e Celulose SINISTERRA, 1994; CARVALHO et Saccharomyces cerevisiae Invertase David et al. (2006) al., 2003); cloroperoxidase deSílica gel Caldariomyces fumago, que podem Petr i, Gambicorti e Caldariomyces fumago Cloroperoxidase Salvadori (2004) ser usadas na degradação oxidativa de clorofenóis e compostos fenólicos Moreno e Sinister ra presentes em águas residuais deSílica gel eAlumina Candida cylindr acea Lipase (1994) refinaria (PETRI, GAMBICORTI eTabela 2 - Exemplos de suportes utilizados na imobilização de células. SALVADORI, 2004; HERNANDEZ, 2005); invertase de S. cerevisiae, Suporte Microorganismo Referência utilizada em indústrias alimentícias C andida tropicalis e para produção de adoçantes (DAVID Jamai et al. (2001) Saccharomyces cerevisiae et al., 2006).Alginato de cálcio Kluyveromyces lactis Becerra et al. (2001) 3.5 Suportes utilizados para a C andida guilliermondii Carvalho et al. (2005) imobilização de células Existem diversos materiais que - López, Lázaro e Marques (1997) podem ser utilizados como suporte para a imobilização de células. Géis S. cerevisiae Nigam (2000)Carragena de alginato, carragena e Pseudomonas dacunhae Çahk et al. (1999) poliacrilamida, alumina, terra de Kanuma, caule de cana e sílica são Escherichia coli Leng, Zheng e Sun (2006) alguns exemplos de suportes des- S. cerevisiae Siess e Divies (1981) critos na literatura (Tabela 2). Pundle, Prabhume e SivaramanPoliacrilamida S. uvarum (1988) 3.5.1 Alginato de cálcio O método de aprisionamento S. cerevisiae Norouzian et al. (2003) em gel de alginato de cálcio é uma Hamdy Kim e Rudtke (1990) , técnica extensivamente utilizada para a imobilização de células viá- S. cerevisiae Santos et al. (1998) veis (RAMAKRISHNA e Borenstein (2003) PRAKASHAM, 1999). Como a for- mação do gel ocorre rapidamenteAlumina Zymomonas mobilis Bekers et al. (2001) na presença de íons cálcio, sem Lactobacillus rham nosus Moueddeb et al. (1996) alterações drásticas de temperatura, pH e pressão osmótica, a atividade Bactérias redutoras de sulfato e Bactérias metanogênicas Silva et al. (2006) e a viabilidade dos microorganismos imobilizados são conservadas Levedura/fabricação de vinhos Kourkoutas et al. (2006) (CORCORAN, 1985). VantagensTerra de Kanuma, Carvão como baixo custo, grande disponibi- Levedura/produção de etanol Kumakura, Yoshida e Asano (1992)ativado, Celulose em pó lidade no mercado, possibilidade de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 53
  7. 7. ampliação de escala de produção e a poliacrilamida. A poliacrilamida é um Lactobacillus rhamnosus, para a pro-aceitação das substâncias utilizadas polímero formado pela mistura de dução de ácido lático (MOUEDDEBpara a imobilização (alginato e cloreto dois monômeros, acrilamida e et al., 1996). Segundo BEKERS et al.de cálcio) como aditivos na produ- bisacrilamida, formando uma espé- (2001), desde 1982 a alumina vemção de alimentos têm sido citadas na cie de rede. Células de sendo amplamente utilizada comoliteratura (CORCORAN, 1985; Saccharomyces cerevisiae foram suporte para a imobilização deCHAMPAGNE, BLAHUTA e imobilizadas em gel de poliacrilamida enzimas e microorganismos. A revi-GAGNON, 2000). Entre as desvanta- e foi verificado que dentro das partí- são elaborada por estes autoresgens do uso deste polímero como culas do gel a viabilidade celular se referencia diversos trabalhos que uti-suporte destacam-se a instabilidade comportou de forma heterogênea, lizaram este suporte para imobiliza-química na presença de agentes com um elevado número de células ção de biocatalisadores.quelantes do íon cálcio (como fosfato, não-viáveis. Por outro lado, as célu- SILVA et al. (2006) avaliaramlactato e citrato), a tendência das las que se encontravam na superfície vários tipos de suportes, inclusive aesferas em sofrer dilatação na pre- do gel mantiveram a capacidade de alumina, na imobilização de bactéri-sença de cátions monovalentes e as formar colônias com boa atividade as redutoras de sulfato e bactériaslimitações impostas à transferência fermentativa (SIESS e DIVIES, 1981). metanogênicas. Espuma dede substratos e produtos (FREEMAN Também foi avaliada a estabilidade poliuretano e carbono vegetal forame LILLY, 1998). Este suporte já foi desse suporte para imobilização de os suportes mais indicados para autilizado para a imobilização de célu- células de Saccharomyces uvarum imobilização das bactérias redutorasl a s d e Candida tropicalis e na produção de etanol. A estabilida- de sulfato enquanto que a cerâmicaSaccharomyces cerevisiae, na pro- de das células imobilizadas em gel de alumina apresentou-se como odução de etanol (JAMAI et al., 2001); de poliacrilamida foi maior que as suporte mais indicado para asKluyveromyces lactis, na produção das células imobilizadas em alginato archaea metanogênicas. Estes auto-de lactose (BECERRA et al ., 2001); de cálcio (PUNDLE, PRABHUME e res afirmam que o sucesso de umCandida guilliermondii, na produ- SIVARAMAN, 1988). A poliacrilamida reator anaeróbico está diretamenteção de xilitol (CARVALHO et al., também foi utilizada na imobilização associado com o material usado como2005). de S. cerevisiae, para a bioconversão suporte da imobilização. Já, de etanol e butanol em aldeídos KOURKOUTAS et al. (2006) avalia- 3.5.2 Carragena (NOROUZIAN et al., 2003). ram o efeito de armazenamento e A carragena é um polímero na- reuso das células imobilizadas detural presente na estrutura celular de 3.5.4 Alumina levedura em alumina, “kissiris” ealgas do tipo Rodophyceae. Este Conforme visto anteriormen- pedaços de maçã, durante a fabrica-polissacarídeo tem a particularidade te, a alumina é um material inorgânico ção do vinho. As células imobilizadasde formar colóides e géis em meios que apresenta diversas vantagens apresentaram maior estabilidade queaquosos a concentrações muito bai- para ser utilizada como suporte de as células livres quanto ao períodoxas (CREDIDIO, 2006). O sistema imobilização. Sua vida útil, se não de estocagem e atividade, indepen-de imobilização de células em ilimitada, é mais longa do que a dos dentemente do suporte utilizado. Oscarragena é promissor para a produ- suportes orgânicos mais comumente resultados também mostraram queção industrial de etanol. Quando foi usados em testes com fermentação as células imobilizadas não apresen-utilizado gel de alginato de cálcio alcoólica (SANTOS et al ., 1998; taram efeito negativo na composi-para a imobilização de células, o BEKERS et al., 2001; RESHMI, SANJAI ção dos produtos responsáveis pelosuporte não apresentou boa estabili- e SUGUNAN, 2006). NAVARRO, aroma dos vinhos, durante adade operacional quando compara- LUCCA e ALLIERI (1982) também estocagem. Estes autores tambémdo ao uso de células imobilizadas em assinalaram que o baixo custo da destacam outros trabalhos da litera-carragena (CHIBATA, TOSA e SATO, alumina torna-a mais atrativa para tura que utilizam alumina, “kissiris” e1986). Este suporte já foi então uti- imobilizar células de leveduras. pedaços de maçã como suporte paralizado para a imobilização de células MOUEDDEB et al. (1996) ressalta- a imobilização na produção de vi-de S. cerevisiae, visando à produção ram que a alumina apresenta algu- nhos.de etanol (LÓPEZ, LÁZARO e MAR- mas vantagens sobre os materiaisQUES, 1997; NIGAM, 2000); orgânicos, destacando-se a facilida- 3.5.5 Outros tipos de suportesPseudomonas dacunhae , visando à de de esterilização e limpeza. Por Células de levedura também fo-produção de L-alanina (ÇAHK et al., estas características, este material ram imobilizadas em suportes poro-1999); Escherichia coli, visando à vem sendo utilizado na imobilização sos de terra de Kanuma (solo prove-produção de L-fenilalanina (LENG, de células de S. cerevisiae, para a niente do Japão), carvão ativado eZHENG e SUN, 2006). produção de etanol (HAMDY, KIM e celulose em pó, por polimerização e RUDTKE, 1990; SANTOS et al., 1998; por irradiação a baixa temperatura. 3.5.3 Poliacrilamida BORENSTEIN, 2003); Zymomonas As fermentações alcoólicas foram Um outro tipo de suporte utili- mobilis , para produção de levânio e realizadas em reatores com célulaszado em fermentação alcoólica é a etanol (BEKERS et al ., 2001); imobilizadas ou com recuperação de54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006
  8. 8. células. Os reatores com células imo- GONZÁLEZ, M.I.S. Lactose VA, S.S. Uso de biocatalisadoresbilizadas se apresentaram como a bioconversion by calcium- imobilizados: uma alternativamelhor alternativa nesse bioprocesso alginate immobilization of para a condução dequanto ao custo e complexidade, Kluyveromyces lactis cells. bioprocessos. Revista Analytica,além de terem produzido mais etanol. Microbial Technology, v.29, n.23, p.60-70, 2006.A terra de Kanuma foi mais efetiva p.506-512, 2001.que a celulose em pó, pois a ativida- CHAMPAGNE, C.P.; BLAHUTA, N.;de das suas células imobilizadas per- BEKERS, M.; LAUKEVICS, J.; GAGNON, C. A vortex-bowl diskmaneceu constante por longos perí- KARSAKEVICH, A.; VENTINA, atomizer system for theodos. Ao final, células imobilizadas E.; KA MINSKA, E.; UPITE, D.; production of alginate beads inobtidas por copolimerização de dois VINA, I.; LINDE, R.; a 1500-liter fermentor.monômeros (10% de metoxi SCHERBAKA, R. Levan-ethanol Biotechnology andnonaetilenoglicol metacrilato e 10% biosynthesis using Zymomonas Bioengineering, v.68, p.681-de hidroxietil metacrilato) usando mobilis cells immobilized by 688, 2000.30% de terra de Kanuma apresenta- attachment and entrapment.ram a mais alta produtividade em Process Biochemistry, v.36, CHIBATA, I.; TOSA, T.; SATO, T.etanol (KUMAKURA, YOSHIDA e p.979-986, 2001. Immobilized biocatalysts toASANO, 1992). produce aminoacids and other BORENSTEIN, I.M. Uso de alumina organic compounds. In: LASKIN, 4 CONCLUSÕES como suporte para imobilização A.I. Enzyme and Immobilized de leveduras. São Paulo: USP/ Cells in Biotechnology. p.37-70. O uso de biocatalisadores imo- Faculdade de Ciências Farma- The Benjamin/Cummings,bilizados (enzimas e células) é uma cêuticas, 2003 (Dissertação de U.S.A., 1983.estratégia a ser utilizada para a con- Mestrado).dução de bioprocessos em várias CHIBATA, I.; TOSA, T.; SATO, T.situações. Aliada à engenharia, bio- ÇAHK, G.; SAVASÇI, H.; ÇAHK, P.; Methods of cells immobilization.química, microbiologia e genética, OZDAMAR, T.H. Growth and k- In: DEMAIN, A.L.; SOLOMON,esta tecnologia pode ser utilizada carrageenan immobilization of N.A. Manual of Industrialcomo uma ferramenta para aumen- Pseudomonas dacunhae cells Microbiology andtar a eficiência de processos for L-alanine production. Enzyme Biotechnology. Washington/biotecnológicos e, and Microbial Technology, v.24, American Chemical Society,consequentemente, reduzir custos p.67-74, 1999. 1986.de produção. Para aproveitar o enor-me potencial desta metodologia, os CANTARELLI, C. The use of CORCORAN, E. The production anddesafios a superar passam pela pro- immobilized yeasts in wine use of immobilized livingdução de suportes e coadjuvantes fermentation. Journal of Food microbial cells. In: WISEMAN, A.eficientes e de baixo custo, assim Science, n.3, p.3-20, 1989. Topics in Enzyme andcomo pela harmonização dos com- Fermentation Biotechnology,ponentes do trinômio suporte - mé- CARVALHO, P.O.; CAMPOS, P.R.B.; v.10, p.12-50. England/Ellistodo de imobilização - uso do siste- NOFFS, M.D.A.; OLIVEIRA, J.G.; Horwood, 1985.ma imobilizado. SHIMIZU, M.T.; SILVA, D.M. Apli- cação de lipases microbianas na COSTA, S.A.; TZANOV, T.; PAAR, A.;5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA obtenção de concentrados de GUDELJ, M.; GÜBITZ, G.M.; CA- ácidos graxos poliinsaturados. VACO-PAULO, A. ImmobilizationALBRAS. Matéria-prima. Alumina. Dis- Química Nova, v.26, jan./fev., of catalases from Bacillus SF on ponível em: http:// 2003. alumina for the treatment of www.albras.net/materia_prima.htm textile bleaching effluents. . Acessado em: 24/07/2003. CARVALHO, W.; SANTOS, J.C.; Enzyme and Microbial CANILHA, L.; SILVA, S.S.; Technology, v.28, p.815-819,BARON, G.V.; WILLAERT, R.G.; PEREGO, P.; CONVERTI, A. 2001. BACKER, L.U.C. Immobilized cell Xylitol production from reactors. In: WILLAERT, R.G. sugarcane bagasse hydrolysate. CREDIDIO, E. Carragena: um antigo Immobilized living cell systems: Metabolic behavior of Candida alimento do futuro. Disponível Modeling and experimental guilliermondii cells entrapped em:www.laticinio.net/ methods. London: John Willey & in Ca-alginate. Biochemical inf_tecnicas.asp?cod=39. Publi- Sons, 1996, p.67-95. Engineering Journal, v.25, p.25- cado em: 26/04/2004; Acessado 31, 2005. em: 23/08/2006.BECERRA, M.; BAROLI, B.; FADDA, DAVID, A.E.; WANG, N.S.; YANG, A.M.; BLANCO MÉNDEZ, J.; CARVALHO, W.; CANILHA, L.; SIL- V.C.; YANG, A.J. Chemically Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 55
  9. 9. surface modified gel (CSMG): An Eupergit C â-galactosidase from Process Biochemistry, v.15, p.2- excellent enzyme-immobilization B. circulans and á-galactosidase 8, 1980. matrix for industrial process. from Aspergillus oryzae. Enzyme Journal of Biotechnology, v.125, and Microbial Technology, v.27, KOURKOUTAS, Y.; KANELLAKI, M.; p.395-407, 2006. p.26-32, 2000. KOUTINAS, A.A.; TZIA, C. Effect of storage of immobilized cells atDURAN, P.M.; BAILEY, J.E. Effects of HERNANDEZ, C.E.L.R. Degradação de ambient temperature on volatile immobilization on growth, clorofenóis e compostos fenólicos by-products during wine-making. fermentation properties and em águas residuais de refinaria Journal of Food Engineering, v.74, macromolecular compositions of por cloroperoxidase de p.217-223, 2006. Saccharomyces cerevisiae Caldariomyces fumago. Rio de attached to gelatin. Biotechnology Janeiro: UFRJ/Bioquímica, 2005 KUMAKURA, M.; YOSHIDA, M. and Bioengineering, v.28, p.73- (Tese de Doutorado). ASANO, M. Preparation of 87, 1986. immobilized yeast cells with IDA, J.I.; MATSUYAMA, T.; porous substrates. ProcessEBERHARDT, A.M.; PEDRONI, V.; YAMAMOTO, H. Immobilization Biochemistry, v.27, p.225-229, VOLPE, M.; FERREIRA, M.L. of glucoamylase on ceramic 1992. Immobilization of catalase from membrane surfaces modified with Aspergillus niger on inorganic and a new method of treatment LEE, T.H.; AHN, J.C.; RYU, D.Y. biopolymeric supports for H2O2 utilizing SPCP-CVD. Biochemical Performance of an immobilized decomposition. Applied Catalysis Engineering Journal, v.5, p.179- yeast reactor system for ethanol B: Environmental, v.47, p.153- 184, 2000. production. Enzyme and Microbial 163, 2004. Technology, v.5, p.41-45, 1983. JAMAI, L.; SENDIDE, K.; ETTAYEBI,FREEMAN, A.; LILLY, M.D. Effect of K.; ERRACHIDI, F.; HAMDOUNI- LENG, Y.; ZHENG, P.; SUN, Z.H. processing parameters on the ALAMI, O.; TAHRI-JOUTI, M.A.; Continuous production of L- feasibility and operational stability MCDERMOTT, T.; ETTAYEBI, M. phenylalanine from of immobilized viable microbial Physiological difference during phenylpyruvic acid and L-aspartic cells. Enzyme and Microbial ethanol fermentation between acid by immobilized recombinant Technology, v.23, p.335-345, calcium alginate-immobilized Escherichia coli SW0209-52. 1998. Candida tropicalis and Process Biochemistry, v.41, Saccharomyces cerevisiae. p.1669-1672, 2006.FUKUDA, H. Immobilized Microbiology Letters, v.204, microorganism bioreactor. In: p.375-379, 2001. LÓPEZ, A.; LÁZARO, N.; MARQUÉS, ASENJO, J.A.; MERCHUK, J.C. A.M. The interphase technique: a Bioreactor system design. p.339- KAREL, S.F.; LIBICKI, S.B.; simple method of cell 375. New York/ Marcel Dekker, ROBERTSON, C.R. The immobilization in gel-beads. 1994. immobilization of whole cells: Journal of Microbiological Engineering principles. Chemical Methods, v.30, p.231-234, 1997.GERBSCH, N.; BOCHHOLZ, R. New Engineering Science, v.40, processes and actual trends in p.1321-54, 1985. LOZANO, P.; PÉREZ-MARÍN, A.B.; DE biotechnology. FEMS DIEGO, T.; GÓMEZ, D.; Microbiology Reviews, v.16, KATCHALSKI-KATZIR, E.; KRAEMER, PAOLUCCI-JEANJEAN, D.; p.259-269, 1995. D.M. Eupergit C, a carrier for BELLEVILLE, M.P.; RIOS, G.M. immobilization of enzymes of IBORRA, J.L. Active membranesGROBOILLOT, A.; BOADI, D.K.; industrial potential. Journal of coated with immobilized Candida PONCELET, D.; NEUFELD, R.J. Molecular Catalysis, v.10, p.157- antarctica lipase B: preparation Immobilization of cells for 176, 2000. and application for continuous application in the food industry. butyl butyrate synthesis in organic Critical Reviews in Biotechnology, KNEZEVIC, Z.; MILOSAVIC, N.; media. Journal of Membrane v.14, p.75-107, 1994. BEZBRADICA, D.; JAKOVLJEVIC, Science, v.201, p.55-64, 2002. Z.; PRODANOVIC, R.HAMDY, M.K.; KIM, K.; RUDTKE, C.A. Immobilization of lipase from MARTÍN, T.M.; PLOU, F.J.; ALCALDE, Continuous ethanol production by Candida rugosa on Eupergit C M.; BALLESTEROS, A. yeast immobilized onto supports by covalent attachment. Immobilization on Eupergit C of channeled alumina beads. Biochemical Engineering Journal, cyclodextrin glucosyltransferase Biomass, v.21, p.189-206, 1990. v.30, p.269-278, 2006. (CGTase) and properties of theHERNAIZ, M.J.; CROUT, D.H.G. KOLOT, F.B. New trends in yeast immobilized biocatalyst. Journal Immobilization/stabilization on technology- immobilized cells. of Molecular catalysis B:56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006
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