2. Inmunofluorescencia
Consiste en conjugar colorantes
fluorescentes con anticuerpos,
exponiendo después este conjugado a
los anticuerpos o antígenos
correspondientes en cortes de tejidos,
frotis de microorganismos o de
células, o cultivo de tejidos en capa
única.
3. Cuando la reacción es positiva y se
expone a la luz ultravioleta se
producirá fluorescencia observable
bajo el microscopio de
inmunofluorescencia.
Se realiza un acople a un anticuerpo de
un fluoróforo o una enzima que
cataliza una reacción por la cual se
emite fluorescencia.
4. fluoróforo
• Generalmente son compuestos
heterocíclicos o hidrocarburos
poliarómaticos: moléculas rígidas
Rodamina 6G
Rodamina B
5. Cada fluorocromo tiene un espectro de
emisión y excitación característicos; si
se utilizan dos con el mismo espectro
de excitación pero distinto espectro de
emisión, se pueden medir dos
características al mismo tiempo
(fluorescencia de dos colores).
Fluoresceína
6. Las moléculas fluorescentes tienen
la particularidad de que emiten
luz de una determinada longitud
de onda al ser excitadas con luz
de otra determinada longitud de
onda.
7. La Inmunofluorescencia es una técnica de
biología molecular que consiste en
incubar una muestra con un anticuerpo
que detecte la molécula o componente
que queramos detectar. Dicho
anticuerpo lleva unida una molécula
fluorescente (inmunofluorescecnia
directa) o bien es reconocido por un
segundo anticuerpo marcado
fluorescentemente (inmunfluorescencia
indirecta).
8. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA:
Esta técnica se vale de un anticuerpo
primario marcado con un fluorocromo
que reacciona con el antígeno dentro de
la muestra. Es un procedimiento de un
solo paso y comprende un solo anticuerpo
marcado. La visualización de estructuras
no es ideal a causa de la poca emisión de
la señal.
9. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Esta prueba tiene una sensibilidad mayor que
los métodos directos y con frecuencia recibe
el nombre de técnica del emparedado o de la
capa doble. En vez de conjugar un
fluorocromo con un anticuerpo específico
dirigido contra el antígeno de interés, el
fluorocromo se conjuga con un anticuerpo
secundario dirigido contra el anticuerpo
primario.
10. Por lo tanto, cuando la fluoresceína se
conjuga directamente con el anticuerpo
primario el método es directo y cuando la
fluoresceína se conjuga con un anticuerpo
secundario el método es indirecto.
El método indirecto aumenta en forma
considerable la señal fluorescente emitida
por el tejido.
11. Una ventaja adicional del método de
marcación indirecta es que es un solo
anticuerpo secundario puede usarse para
localizar la unión histoespecífica de varios
anticuerpos primarios diferentes.
Para los estudios microscópicos el
anticuerpo secundario puede conjugarse
con colorantes fluorescentes distintos de
modo que en el mismo corte de tejido
aparezcan marcas múltiples.
12. Las desventajas de la
inmunofluorescencia indirecta son
que es cara, que requiere mucho
trabajo y que no se adapta con
facilidad a los procedimientos
automatizados.
