2. Fundamento
• Se basa en la reacción Ag-Ab
específico
• Marcaje con enzima
indicadora (unida a un Ag o
Ab) que produce productos
coloreados
3. • La diferencia principal entre las técnicas de RIA y
ELISA es que la primera utiliza como marcador un
isótopo y la segunda la actividad de un enzima
• Anteriormente se empleaban isótopos
radioactivos, que suponía mayor riesgo y costo en
el laboratorio.
ELISA
5. ELISA Directo
• Ag inmobilizados y detectados por
Ab primarios conjugados con
enzimas. Es muy importante la
especificidad del Ab primario.
• PROS: mínimo procedimiento, evita
reactividad cruzada al no usar un
Ab secundario
• CONS: requiere marcado de todos
los Ab primarios – alto costo, no
todos los Ab son adecuados para
ser marcados
6. ELISA Indirecto
• Los Ab primarios no están marcados,
son detectados por Ab secundarios
conjugados con enzimas.
• PROS: Se puede usar una gran
cantidad de Ab secundarios para
diferentes ensayos, los Ab primarios
mantienen máxima
inmunoreactividad
• CONS: Puede ocurrir cross-reactivity
7. ELISA No competitivo (Sandwich)
• Ag capturado por Ab y detectado
por Ab diferentes. Ambos Ab deben
ser elegidos con cuidado para
prevenir la reactividad cruzada o
competencia por sitios de unión.
• PROS: Sensibilidad, alta
especificidad, el Ag no necesita
haber sido purificado antes de usar
• CONS: Los Ag deben tener al menos
dos lugares de unión a Ab
8. ELISA Competitivo
• EL Ag de la muestra y el Ag
purificado inmobilizado
compiten por la unión (captura)
del Ab.
• PROS: crude or impure samples
may be used, high
reproducibility.
• CONS: lower overall sensitivity
and specificity.
10. Diseño para cuantificación de Antígeno
• Método «Sándwich» o ELISA de captura
• El Ag debe ser capaz de ser reconocido por
dos moléculas de Ab, simultáneamente: Uso
de Ab policlonal o de dos Ab monoclonales
(que reconocen distintos epítopos)
13. Diseño para cuantificación de
anticuerpo
• Método indirecto: unión de Ag a fase sólida y
unión de Ab de la muestra. Detección por
conjugado.
• Riesgo: cambio conformacional del Ag al
unirse a fase sólida
16. Enzimas y substratos
• Principales enzimas: peroxidasa de rábano y
fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina.
• Pueden unirse a Ab sin alterarlos ni perder su
capacidad catalítica.
• Catalizan reacciones que producen productos
coloreados solubles o precipitables:
– Solubles: cuantificación por espectofotrometría, o
en el caso de fluorogénicos que se pueden
detectar a bajas concentraciones
– Pp: técnicas de localización cuantitativa (WB, EIT,
etc.)
17. Resultados
• Positivo:
– Presencia de anticuerpos (empleado en detección
de enfermedades) o antígenos
• Falso positivo:
– Producción de Ab en una persona que estuvo
enferma, pero ya se curó
– Inespecificidad Ag-Ab
• Falso negativo:
– Producción en bajas cantidades de Ab, puede
pasar desapercibido
18. Muestra: 256 adultos del Distrito de Cauday, Cajamarca
Detección de anti-Toxocara IgG por dot-ELISA, usando antígenos TES (T. canis larvae
excretory-secretory Ag)
Positivos Negativos
Toxocara dot-ELISA 53.1% (136) 46.9%
Las muestras de suero recibieron antígenos de Ascaris suum y disminuyó los resultados positivos
Las muestras negativas siempre se mantuvieron negativas
Positivos Negativos
Toxocara dot-ELISA 44.92% (115) 55.08%
19. HIV ELISA detection
• The most popular ELISA involves an indirect
method in which HIV antigen is attached to a
well of a 96-well microtiter plate. Antibody in
the sample is allowed to react with the
antigen-coated solid support
20. • El método de ELISA descrito detecta antígenos
solubles en la orina de los pacientes detectado
por un Ab monoclonal para confirmar casos
de pacientes con Legionella pneumophila
serogroup 1 (L.pn 1).
• Especificidad del ensayo: 100%
• Detección de antígeno en la orina: 77%