Este documento fornece instruções sobre como utilizar ferramentas do NCBI, como Pick Primer e BLAST, para desenhar primers e verificar sua especificidade. Inicialmente explica como pesquisar e selecionar bases de dados no NCBI. Em seguida, detalha o uso do Pick Primer para desenhar primers com base nos parâmetros de sequência, tamanho e temperatura de fusão definidos pelo usuário. Por fim, descreve como utilizar o BLAST para comparar a sequência do primer com bancos de dados e verificar sua similaridade com outras sequências.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PARÁ – UFOPA
INSTITUTO DE BIODIVERSIDADE E FLORESTAS – IBEF
PROGRAMA DE BIOTECNOLOGIA – Pnat 2012
Tutorial básico: Uso de ferreamentas do NCBI – Pick Primer
& BLAST
Org.: Cássio Figueira
Santarém - Pará
Outubro/ 2014

2. COMO UTILIZAR AS FERRAMENTAS DO NCBI
 Composição da Página Inicial.
Figura 1 – Página
A página inical é apresentada na lingua inglesa, aparentemente simples e comporta de
forma explícita todas as ferramentas, bancos de dados, artigos, informações e afins.
 Pesquisa e indexação.
Barra de Pesquisa - Inserir termo de indexação (Genôma, seguência de DNA,
bactérias, fungos, proteínas, primer, etc.).
Barra de Rolamento – Escolher a base de dados específicos a qual o termo se
enquadra.

3.  Apresentação de informações pesquisadas em todas as bases de
dados (“All databases”).
Exibe cada fonte de dados com a quantidade de vezes em que o termo foi citado, além
de quantos tipos de informações existem nas bases quanto ao termo pesquisado, como
genes, genôma, protínas, artigos publicados, revistas, etc.
 Escolha de bases de dados.
Em caso de pesquisas relacionados a especies de animais, vegetais, bactérias, fungos,
insetos, etc. usa-se inicialmente a base de dados “Taxonomy” (Taxonomia), pois os
dados relativos ao termo pesquisado serão mais específicos, havendo melhor triagem
dos dados de interesse, quanto a termos específicos, como genes, proteínas, primer, etc.
utiliza-se o termo científico e base de dados apropridos (Ex.: Base “Protein” – Termo,
Catalase).
Após pesquisa, aparecerá o termo indexado pelo usuário. Lembrando: Deve-se usar
estritamente termos científicos para melhor localização de dados de interesse (Ex.:
Lippia alba, Transposon Tn10, etc.).
Ao fim do procedimento, deve-se “Clicar” sobre o termo indexado pelo usuário, o qual
foi encontrado no banco de dados taxonomico.

4. Sendo que abrirá uma página contendo diversas informações referentes ao termo
indexado pelo usuário.
A página exibirá todas as informações existentes sobre o termo indexado, e ao lado
direito, haverá uma “caixa” contendo o número de registros em algumas bases de dados
importantes relativo ao termo utilizado.
Cada base de dado apresentará um número de links diretos (páginas), sendo este número
a quantidade de resultados publicados nas bases de dados referente ao termo indexado.

5.  Base de dados referente a Nucleotídeos (“Nucleotide”).
Ao clicar sobre o número de links diretos (“Direct Links”), a página irá carregar todas
as informações contidas nesse base de dados (“Nucleotide”) referente ao termo
indexado inicialmente.
Em toda a lista haverá apenas dados relativos a nucleotídeos (sequencias de DNA) do
organismo, DNA ou RNA de interesse pesquisado pelo usuário.
 Clicar no dado de interesse.

6. Ao clicar sobre o dado de interesse, abrirá uma página contendo todas as informações
refentes aos nucleotídeos, sequencias gênicas, quantidades de pares bases (pb), onde foi
publicado, etc.
Ao rolar a “Barra de rolamento”, aparecerá a sequência nucleotídica de determinado
gene, genôma, DNA, primer, etc.
Com os dados apresentados, você poderá utiliza-los para diversos fins, como desenhos
de primers, identificação de sequências genômicas de interesse, produtos gênicos,
especificidade de primers, etc. por meio de softweres line contidos no proprio site.

7.  Desenhando Primers (Pick Primer) – Primer design.
Para desenho e criação de primers de interesse, será utilizado um processo simples,
mediado pelo softwere line Pick Primer.
Dando continuidade aos passos que foi apresentado anteriormente.
A página é a mesma do passo anterio, difere-se por se tratar de um Transposon
(Sequencia de tranposição) presente em bacteria patogênica.
Do lado direito do visor, há uma “Barra de extensão” (“analyze this sequence”) –
“Analisar esta sequência”, onde há alguns softwere line de análise de dados genéticos,
entre os quais está presente a ferramenta Pick Primer.
O aplicativo é um ótimo recurso e fácil de usar, principalmente quem tem base em
genética (qualitativa e quantitativa), mas exige certo conhecimento de termos técnicos
em inglês, visto que a plataforma se apresenta nesse idioma. Clicar em Pick Primer.

8. A página apresentará um formulário para inserção de dados referentes aos parâmetros
desejados, sequencias de genes, tamanho do produto e temperatura ideal.
Como você está seguindo os passos anteriores, aparecerá no quadro (“Enter accession,
ig, or FASTA sequence”) um código (codigo de identificação) referente ao dado de
interesse na base de dados. Caso a ferramenta seja acessada diretamente da página
inicial do site ou a sequência de nucleotídeos não estiver diponível no banco de dados,
deve-se copiar e colar nesta área a sequência que desejas analisar.
Ao lado da caixa com o ID ou sequencia, haverá um grupo (“Range”) – “Classes” com
quatro caixas abaixo.
Onde, você adicionará um intervalo de pares de bases (pb) inciais (“Forward primer”),
onde o aplicativo encontrará e combinará uma sequencia pequena de DNA (Primer).

9. A sequência inicial escolhida não deve ser muito curta, pois o aplicativo precisa de
flexibilidade para desenhar um ou mais primers, no caso acima, a sequência onde o
primer será encaixado e desenhado é entre 1.500 pb a 1.600 pb, dando cerca de 100 pb
para o softwere desenhar e combinar um primer mais semelhante possivel a uma
pequena sequencia dentro desse perímetro.
A sequencia reversa (“Reverse primer”), fará o caminho inverso realizado pela
sequencia inicial, segue o mesmo princípio (1.700 pb a 1.900 pb). Quanto maior o
perímetro estipulado, maior a possibilidade (flexibilidade) que o aplicativo tem de
desenhar um primer em qualquer área da classe escolhida, o ideal é entre 100pb a 300
pb.
Ao definir a distancia entre ambos os inciadores (primers), o perímetro entre eles é o
amplicon (Produto amplificado ou fragmento alvo a ser amplificado), sendo que o
tamanho do amplicom pode variar, visto que o primer não terá mesmo tamanho da
perímetro do qual foi gerado. Geralmente um primer é muito pequeno, com menos de
50 pb, mas o tamanho é determinado por quem realizará o procedimento, lembrando
que quanto menor o primer, maior será a possibilidade de se parear o iniciador com
qualquer senquência dentro de uma fita ou fragmento de DNA, porém , se for grande
demais, corre o risco de forma estruturas secundárias indesejadas, indica-se primers de
18 – 22 pb.
Esse procedimento geralmente é utilizado para diagnósticos, não havendo a necessidade
de grandes sequências de nucleotídeos e nem sequencias muito específicas.
Quando se conhece a sequencia que se quer isolar, deve-se escolher os interva-los para
criação do primer com cuidado, visando alcançar a sequencia de interesse.
Essa área é flexivel, podendo não colocar nenhum tipo de dado, ou definir apenas qual
será o início do primer 1 e o início do primer 1 reverso.

10. Após definir o perímetro da sequencia , onde deseja que o primer seja desenhado,
defini-se a temperatura ideal para anelamento (“Primer melting temperatures”), mas
geralmente permance a temperatura pré-configurada pelo aplicativo. Sendo que a
temperatura do primer 1 e primer 2 (reverso), devem ser análogos, ou com diferença
maxima de 3°C
IMPORTANTE: Deve-se ainda escolher o tamanho do produto que será gerado pela
amplificação (“PCR product size”). Dando um valor mínimo e outro máximo. O
tramanho do produto irá variar dentro de ambos os números, no caso foi escolhido (Min
= 150 pb; Max= 300 pb), determinando o tamanho do produto final da PCR.
Lembrando: que o tamanho do produto depende do tamanho do intervalo entre os dois
locais de criação do primer, citados acima.
Escolhe-se ainda, a quantidade de primers que se deseja encontrar (“# of primers to
return”) . No caso, foi escolhido 10 primers.
Ex.: Se meu intervalo entre 1.500 pb e 1. 600 pb, tem 100 pb ( a
diferença) para o primer 1, e o intervalo entre 1.700 pb e 1.900 pb, tem
300 pb (a diferença), para primer reverso, e entre 1.600 pb e 1.700 pb, é o
intervalo entre ambas as classes citadas acima. Se meu primer 1 tiver
tamanho igual a 30 pb, sobrarão 70 pb desse intervalo (total 100 pb),
considerando que o primer se encaixará no ínicio da classe; o resto será
amplificados juntamente com a parte de interesse, tentando sempre ficar
entre os tamanhos estipulados anteriormente (150 pb a 300 pb).

11.  Não se altera nenhum seguimento do quadro abaixo.
 A caixa desta sessão deve ser desmarcada, visto que haverá uma comparação
com outros dados, mostrando onde esse gene aplificado se encaixa dentro dos
dados com os quais será comparado (Explicado detalhadamente ao fim do
texto).
Logo, inicia-se o processo, clicando em “Get primers”.
Com alguns minutos, uma pagina apresentará uma especíe de gráfico e logo abaixo,
toda as sequências de DNA possíveis.

12. Os melhores primers serão mostrados em ordem de 1 a 10 (de acordo com a quantidade
estipulada), sendo que devemos atentar para algumas informações.
Product length – Tamanho do produto
Length – Tamanho do primer
Start – Local onde o primer inicia
Stop - Local onde o primer termina.
Tm – Temperatura ótima (Variação max.: 3°C)
CG% - Quantidade de bases G e C em percentual (desejavel 40 – 60%), pois tornam a
fita mais estavel, necessitando de altas temperaturas para dissociar as pares de bases.
Self 3’ complement. – Quanto maior o numero, mais o “primer é ruim”. (O aplicativo
busca a melhor opção, mesmo havendo pequenos erros).
A sequência do primer já desenhado deve ser copiado e salvo em documento (.doc),
para posterio análise no softwere line BLAST.

13.  Observações complementares.
Observando o gráfico
Observarndo o Caso do primer 1
Comparando com o gráfico 1
Observamos que a “Seta azul” corresponde a sequência de nucleotídeos do primer
1(esquedo) e primer 1 reverso (direito) e a linha no centro corresponde a uma parte do
produto, pois os primers também serão adicionados ao produto final.
Ao comparar a posição das “Setinhas”: Se as “setas” de todos os primers estiverem
alinhados ou quase alinhados, significa que não havia muitas combinações disponíveis
para encaixar um primer de forma análoga, logo o tamanho do produto não serão tão
diferentes em todos os casos.

14.  “Primer Pair Specificity Checking Parameters”.
O parâmetro desativado na análise anterior, pode ser ativado quando o usuário quer
saber onde se insere a sequencia de interesse dentro dos dados dos quais a sequencia
nucleotídica foi retirada (origem), além de semelhantes.
Ex.: Sabemos o título de onde o dado de intesse se originou.
Ao ativar a função, abrirá uma página mostrando os diferentes dados, onde a
mesma sequência nucleotídica de interesse se insere.
Apenas três trabalhos apresentaram dados com a mesma
sequência de nucleotídeos de interesse, para os quais
estavamos criando primers. E mostra em que sequência ele se
insere, nos dados dos trabalhos acima.

15.  Utilizando a Ferramenta BLAST.
Como utilizar a ferramenta BLAST para testar a especificidade dos primers criados
anteriormente?!
FUNÇÃO: Comparar sequência de nucleotideo (primer) com o banco de dados,
dando função, especies associadas, etc.
Agora, peque o primer 1 criado anteriormente, o qual foi copiado e
salvo em documento (.doc).
Vá na página inicial do site  BLAST (Lado direito)
Ao entrar no BLAST, hávera uma página simples, com diversos links, e um
conjunto de links específicos para teste in silico de especificidade de diversos
produtos.

16. Página inicial do BLAST.
Ao observar a área “Basic BLAST”, haverá diversas opções de softwere line para
análise.
Nucleotide blast – Sequências de DNA
Protein blast – Sequências de proteinas.
Tblastn – Sequência de DNA e seu produto gênico (proteína)
Etc.

17. A opção de interesse é “Nucleotide blast”... Visto que estamos trabalhando com
primers.
Ao clicar, abrirá uma página semelhante a tabela de inserção de dados do Pick Primers.
Agora, insira a sequência de seu primer no quadro, ou faça upload do arquivo em
Enter Query Sequence (Sequencia que será comparada).
Após a adição dos dados, as demais caixas devem permanecer sem qualquer tipo de
dado.

18. Escolha do banco de sequências.
Apenas escolha uma opção. A mais cabível na situação; visto que o gene é bacteriano,
escolhe-se a opção “Others (nr etc)”.
Human genomic + transcript – Genoma humano + transcritos
Mouse genomic + transcript – Genomas de Ratos + transcritos
E por ultimo, selecione o programa (especificidade da sequencia)
Megablast - Otimizar para seqüências altamente similares (Megablast). (Encontra o
mais proximo possivel em semelhança com o prime) (RECOMENDÁVEL).
Descontiguos Megablast - Seqüências mais desiguais (megablast descontígua) (com
pequenas dissimilaridades, com ausencia ou presença de poucas bases)

19. Blastn - Otimizar para seqüências algo semelhante (blastn). (A dissimilaridade é maior,
podendo ter apenas poucas semelhanças entre as bases do primer e a sequencida do
banco de dados).
Será selecionado a opção 3 (Blastn) , e clique no botão BLAST.
AGUARDE ALGUNS SEGUNDOS...
Um gráfico aparentemente complexo surgirá.

20. A barra colorida (preto, azul , verde, etc) apresenta uma númeração correspondente a
faixa de tamanho de sequencias nucleotídicas as quais, primers é semelhante.
Considerando que os primers tinham tamanho de 20 – 22 pb, logo as barras azuis em
sequencia apresentam grande similaridade com os primers. Ao passar o mouse sobre
cada barra, pode-se visualizar o título do trabalho onde há certa similaridade da
sequencia com o iniciador produzido in silico.
Se a barrinha estiver completa (Ex.: barra azul), houve um pareamento completo de
ambos os primes em determinada sequencia de nucleoídeos presentes no banco de
dados.
As áreas com apenas parte, como é o caso da barra preta, apenas parte das bases
parearam com os primers. (Mostra o quanto os primers se alinharam com as sequencias
presentes no banco de dados).
Logo abaixo do gráfico, todos os dados que apresentaram relação com os primer
produzido apareceram de forma descritiva.

21. Na página será apresentado dados referentes a quais sequencias, espécies, etc. o primer
está relacionado.
Do lado direito, é mostrado dados relativo a similaridade dos primers com sequencias
gênicas de outros dados (“Query cover”), sendo 100% muito similar (O quanto de
bases parearão), e (“Ident”), referece a quantas bases são idênticas ( em referencia
os primers testados) e o ID (“Accession”) do determinado dado para acesso.