Podemos empezar por triturar la muestra para hacerla polvo, utilizando un mortero y un pilón. A continuación, podemos disolver la muestra en polvo en una solución. Para eliminar los grumos de la muestra que no están bien disueltos, podemos pasar la solución por un filtro fino (normalmente de unos 0,5 μm).
2. Introducción
La preparación de las muestras es el paso de análisis que mayor tiempo
requiere, así como el de mayor probabilidad de generar errores durante la
obtención de los analitos de interés.
Este proceso requiere de varias etapas dependiendo el tipo de muestra que
se desea analizar, tales como:
a) Extracción de un analito de una matriz compleja.
b) Preconcentración de analitos muy diluidos.
c) Eliminación o enmascaramiento de especies interferentes.
d) Transformación del analito en una forma que pueda se más fácilmente
detectable. Por ejemplo la Derivatización de muestras.
2
3. Los 5 aspectos importantes que deben tomarse en cuenta para la
preparación de una muestra son los siguientes:
1. La preparación de la muestra debe realizarse sin perder ningún analito.
2. La preparación de la muestra debe transformar el analito(s) en la mejor
forma química para el método de ensayo a utilizar.
3. La preparación de la muestra debe, incluir si es necesario, la eliminación
de interferentes de la matriz.
4. Debe realizarse sin la adición de un nuevo interferente.
5. La preparación de la muestra debe considerar siempre y cuando sea
necesario, la dilución o la concentración del analito hasta obtener una
concentración del mismo que esté dentro del intervalo óptimo del
método de análisis utilizado.
3
6. Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido es una
técnica de preparación de muestras en
la cual el analito se distribuye en dos
fases inmiscibles entre sí: una acuosa y
una fase orgánica, la cual puede ser
determinada por un coeficiente de
reparto. Generalmente la muestra de
interés se transfiere desde la fase
acuosa a la fase orgánica.
No obstante, la principal desventaja que
presenta esta técnica se consume una
gran cantidad de disolventes, generando
un aumento de gastos y posibles
consecuencias medioambientales.
6
Extracción líquido-líquido en embudo de
separación.
7. Extracción en fase sólida (SPE).
Es una técnica de extracción de matrices sólidas y gaseosas
en la cual se basa en la retención del analito en una fase
adsorbente sólida a partir de una muestra líquida en el que se
encuentra disuelta.
La adición de un eluyente permite eliminar los componentes
de la matriz que interfieren, para después eluir y concentrar
los analitos de interés.
Este tipo de extracción en fase sólida sustituye a la extracción
líquido-líquido clásica.
7
8. Algunas aplicaciones de la extracción en fase sólida:
• Eliminación de pigmentos de vegetales y hortalizas.
• Retención de antocianinas y otras interferencias de análisis de pesticidas en
vinos.
• Determinación de vitaminas e zumos.
• Residuos de antibióticos en leches.
Ventajas:
• Es una técnica muy sencilla y rápida.
• Existen numerosos proveedores que fabrican los adsorbentes para SPE
• El empleo del disolvente es muy escaso.
• Se puede acoplar a otras técnicas de separación.
• Se puede automatizar la extracción.
• Resulta efectiva para extraer compuestos polares o apolares de muestras
líquidas.
• Está limitada a muestras líquidas (Desventaja).
8
9. Procedimiento para la preparación de la muestra mediante SPE.
1. Acondicionamiento de la fase estacionaria.
2. Paso de la muestra a través del material adsorbente.
3. Lavado de la columna.
4. Elución de la muestra.
Esquema de preparación de una muestra
mediante extracción en fase sólida.
9
11. Microextracción en fase sólida (SPME).
Es un método sencillo de extracción de líquidos,
gases e incluso lodos, sin el empleo de disolventes.
Se emplea una fibra de sílice fundida recubierta de
una película fina de 10-100µm, de un líquido,
generalmente no volátil.
Este método es muy utilizado para la cromatografía
de gases o de HPLC.
Ejemplo de fibra de sílice:
Dimetilsiloxano/divinilbenceno.
Sólo se aísla una porción del analito de la muestra.
Jeringa para
microextracción en fase
sólida.
11
12. Toma de muestra mediante microextracción en fase sólida
y desorción del analito de la fibra recubierta, para la
introducción en un cromatógrafo de gases.
Ejemplo de un cromatograma de
gases de productos químicos de
guerra previamente aislados de
agua de mar por microextracción
en fase sólida.
12
13. 13
Procedimiento general:
1. Se expone la fibra de sílice a la muestra en un vial sellado para que produzca la
migración del analito desde la matriz hasta la fase adsorbente por un determinado
tiempo.
2. Una vez retenida la muestra, se repliega la fibra y se introduce la aguja dentro de un
inyector de un cromatógrafo (generalmente de gases).
3. Se saca la fibra dentro de la guía caliente del inyector para comenzar con la desorción
térmica.
4. Se puede concentrar en frío el analito en la cabeza de la aguja antes de realizar la
cromatografía.
16. Ejemplo de un dispositivo para SPME.
Modos de muestreo para SPME: A) Muestreo
directo, B) Muestreo en espacio de cabeza y
C) SPME indirecta o con membrana.
16
17. 17
Dentro de la SPME, existen variantes en cuanto a cómo se extrae la muestra, entre
las cuales destacan:
Extracción directa. Se introduce la fibra directamente en la muestra líquida. Es
de utilidad para muestras sencillas y poco volátiles.
Extracción en el espacio de cabeza. Se introduce la fibra de sílice en el espacio
donde no hay muestra, de modo que aquellos analitos volátiles sean adsorbidos
sin necesidad de haber contacto con la muestra líquida.
Extracción indirecta o por membrana. Entre la fibra y la muestra se sitúa una
membrana que evita el deterioro de la fibra debido a impurezas que pueda
contener matrices complejas. El proceso de extracción es más lento.
Diversos factores pueden modificar la transferencia del analito, tales como la
temperatura, el tiempo de extracción, concentración de sales y fuerza iónica,
el pH de la matriz y la velocidad de agitación. También cabe destacar que el
empleo de disolventes orgánicos disminuye la eficiencia de la microextracción.
18. Purificación por purga y trampa.
Este método de preparación de muestra se emplea para separar líquidos
que por lo regular son volátiles.
El aislamiento del analito de la muestra es cercano al 100%.
La separación de analitos polares de matrices polares resulta ser muy
difícil.
El aparato de purga y trampa está acoplada al cromatógrafo de gases.
18
19. Adsorbentes moderados:
Compuestos no polares, como el
Fenilmetilpolisiloxano.
Adsorbentes fuertes: Tenax
Adsorbentes más fuertes: Tamices
moleculares de carbono.
Figura 4. Aparato de purga y trampa para
extraer sustancias volátiles de un líquido o
sólido mediante una corriente de gas. 19
20. Procedimiento general:
1. Se burbujea como gas de purga helio por medio de una aguja de acero.
2. El sistema se calienta a una temperatura que permita volatilizar la muestra.
3. El gas de purga que sale del vial pasa por un tubo que contiene diferentes adsorbentes.
4. El gas fluye por el tubo desde el adsorbente moderado al más fuerte.
5. Después de arrastrar el analito hasta el tubo de adsorción, se invierte el sentido del
flujo ahora del adsorbente más fuerte al adsorbente moderado.
6. Se purga la trampa a 25oC o menor temperatura para eliminar el agua remanente y
cualquier disolvente que pueda contener el adsorbente.
7. El punto A se conecta a un cromatógrafo de gases, y la trampa se calienta a 200oC para
comenzar con la desorción del analito.
8. Los analitos desorbidos penetrarán en la columna del cromatógrafo, para concentrarlos
en una trampa fría.
9. Una vez terminada la desorción, se calienta el cromatógrafo para la separación
analítica.
20
21. Filtración de las muestras.
Es una técnica de preparación de muestras en el cual se eliminan partículas microscópicas o
entidades biológicas de líquidos mediante su paso por un material poroso.
En casi cualquier tipo de cromatografía, es esencial eliminar cualquier tipo de partículas ya
que estas pueden interferir con el análisis mediante la adsorción de algunos Analitos de
interés, causando bajas recuperaciones de los mismos en líquidos, gases y cromatografía de
intercambio iónico.
La filtración adecuada de las muestras, disolventes y buffers produce una mayor calidad y
eficiencia de la cromatografía, aumenta el tiempo de funcionamiento del instrumento
prolonga la vida de la columna.
21
22. Filtración en membrana.
La filtración por membrana elimina partículas contaminantes procedentes de muestras,
disolventes y fases móviles, aumentando la duración de la columna, lo que minimiza la
contrapresión y previene el fallo del sistema.
Figura 5. En la siguiente gráfica se observa cómo varía la
contrapresión generada en una cromatografía de HPLC al
emplear diferentes métodos de filtración.
Figura 6. Sistema de filtración
MilliSolveTM
para disolventes y
buffers.
22
23. Unidad de filtración Millex-HV; 0,45 µm, PVDF, 33 mm
Aplicación: Esterilización de soluciones acuosas y soluciones que
contienen proteínas.
Tamaño del poro: 0.45 µm
Diámetro del filtro: 0.33mm
Volumen de proceso: 100mL
Filtro de membrana Durapore®
Aplicaciones: Eliminación de partículas
Compatibilidad: Soluciones acuosas y algunos
disolventes.
Características: Baja unión a proteínas.
Material: Fluoruro de polivinilideno (PVDF).
MF-Millipore™ Membrane Filters
Aplicaciones: Monitoreo del aire y análisis de la
contaminación de combustibles y fluidos hidráulicos.
Clarificación y esterilización de fluidos.
Características: Filtración general y monitoreo de
partículas.
23
24. Extracción asistida por microondas
(MAE).
En este tipo de purificación se extrae el analito aplicando energía de
microondas en un disolvente adecuado.
Es una técnica rápida, utiliza volúmenes pequeños de disolvente y
permite controlar parámetros que afectan la eficacia de la extracción.
Fundamento: se aplica una radiación electromagnética de 100mHz a
3GHz. Esto produce que los dipolos se orienten en una sola dirección y
se desordenen cuando la energía disminuye. La fricción causada por los
movimientos generados por los dipolos provoca la emisión de energía
calorífica y el alineamiento de las moléculas no polares.
24
25. La frecuencia de trabajo en la MAE es de
2.5GHz.
Partes del equipo de extracción
asistido por microondas.
25
26. Ejemplo de Extracción tipo Soxhlet en
el cual se emplea un microondas para
la disolución del analito.
Entre mayor sea la constante dieléctrica de
un disolvente, aumentará más su
temperatura y permitirá una mayor
difusividad de los Analitos desde la matriz
al disolvente. Por el contrario. A menor sea
su constante dieléctrica, sólo lograrán
solubilizar el analito.
Hay que tomar en cuenta que la cantidad
de energía irradiada a la muestra es un
parámetro a controlar, pues de lo contrario,
se puede producir un calentamiento
excesivo de la muestra.
La temperatura de trabajo de un equipo
generalmente es de 2GHz.
26
27. Procedimiento general.
1. La muestra se coloca en un recipiente cerrado y se calienta a temperaturas
mayores al punto de ebullición en un corto tiempo.
2. Luego se deja enfriar la muestra y se despresuriza el sistema.
3. Se filtra el extracto y se concentra la muestra.
. Otro factor a considerar es la matriz en la que se halla la muestra, ya que
aquellas que contengan una mayor cantidad de materia orgánica, disminuyen
la eficiencia de la recuperación del analito.
27
28. Extracción acelerada con disolventes (ASE).
También se le conoce como extracción con disolventes presurizados,
es una técnica de extracción sólido-líquido el cual se realiza a altas
temperaturas (50-200oC) y presiones elevadas (100-140 atm).
Se emplean disolventes en estado líquido para la extracción de
Analitos de distintos tipos de matrices de una manera rápida y
eficaz.
A estas temperaturas ligeramente mayores al punto crítico del
disolvente, sus propiedades se modifican, disminuyendo la
viscosidad, lo cual permite la entrada en los poros de la matriz, y
favoreciendo la difusión del analito.
En ASE se pueden emplear disolventes orgánicos o mezcla de ellos.
Ejemplo de acelerador de disolvente automatizado
Dionex™ ASE™ 350. El equipo tiene una capacidad de
análisis de muestras de 1-100g, permite una extracción de
24 muestras y emplea de 50 a 90% menos disolvente que
otros.
28
29. Procedimiento general.
1. La muestra sólida es colocada en un recipiente el
cual se sella.
2. La celda se llena con disolvente y se calienta a
una temperatura mayor al punto de ebullición del
disolvente, provocando un aumento en la presión
en la celda.
3. Al final de la extracción, el extracto se expulsa a
una celda recolectora y se purga la primera celda
con nitrógeno.
Partes de un equipo de extracción con
disolventes presurizados.
29
30. Extracción en modo estático:
1) El disolvente es introducido en la celda manteniéndola a una presión
constante.
2) La celda se vacía recogiendo todo el extracto en un vial colector.
3) Se hace pasar un volumen de disolvente para arrastrar posibles trazas de
Analitos que pudiesen haber quedado en la celda (flush).
. Extracción en modo dinámico:
1) Hay un flujo constante de disolvente a través de la celda presurizada.
30
31. Extracción asistida por ultrasonido
(US).
Es otra técnica de extracción sólido-líquido en la que la muestra se pone en contacto con un
disolvente adecuado, y se somete a ultrasonidos generados por un baño de agua o una sonda
ultrasónica.
El efecto mecánico de los ultrasonidos provoca una mayor transferencia de los Analitos de la matriz
al disolvente.
Cuando se realiza la etapa de sonificación, se centrifuga la muestra y el sobrenadante y se realiza
otros tratamientos como la preconcentración para realizar el análisis cromatográfico.
Se emplea principalmente para la extracción de compuestos activos de origen vegetal, parabenos
en cosmetología y la industria farmacéutica. 31
32. Partes de un equipo de extracción asistido por
ultrasonido.
Ultrasonicador UIP1000hd
para extracción. También
realiza otras funciones
como dispersión, lisis o
molienda. 32
33. Extracción exhaustiva en Soxhlet
Es una extracción de tipo sólido-líquido que se emplea principalmente para
extraer productos naturales como los de una planta.
Antes se empleaba la extracción exhaustiva o Soxhlet para separar y preparar
analitos de muestras complejas de origen vegetal, animal, ambiental,
farmacéutico, alimentario o petroquímico con el uso de disolventes orgánicos
clorados o hidrocarburados. Sin embargo, los analitos sometidos a esta
técnica no conservaban sus características ideales, además de que eran
procedimientos de varias horar para recuperar el analito, lo que muchas
veces esto resultaba imposible.
33
38. Líquidos
Aprovechar las diferencias
en la reactividad de los
analitos, comparada con
los componentes de la
matriz.
Un ejemplo:
Deposición electrolítica
38
Proceso implicado
en la
preconcentración
por
electrodeposición
39. Con la electrodeposición, en una operación
(reducción electroquímica con mercurio) los
componentes pueden ser tanto separados como
concentrados. Dos muestras para las que se
utiliza este método de preconcentración son el
agua de mar y la sangre.
39
40. Otros métodos de preconcentración de analitos en
disolución:
purga y trampa
extracción en estado sólido
extracción de líquido a líquido
flotación
evaporación
precipitación con redisolución
40
41. Preconcentración de Hidrocarburos Aromáticos
Policíclicos (HAP)
Extracción líquido-líquido (ELL)
Extracción en fase sólida (EFS)
Método de preparación de muestras por microextracción
íquido-líquido (MELL)
Preparación de las muestras por el método de SPME
41
42. 42
Una técnica relacionada, denominada
microextracción en fase sólida, emplea
una fibra de sílice fundida, recubierta de
un polímero no volátil para extraer los
analitos directamente de muestras
acuosas o del espacio de cabeza sobre
ellas. El analito se reparte entre la fibra
y la fase líquida. Después dichas
sustancias son desorbidas térmicamente
en el inyector de un cromatógrafo de
gases. La fibra de extracción se monta
en un soporte muy parecido a un jeringa
ordinaria.
La técnica combina la obtención y
preconcentración de la muestra en una
Jeringa para
microextracción en fase
sólida.
SPME
44. Objetivos
a)Mejorar la estabilidad térmica de los analitos
b)Mejorar la Resolución cromatográfica
c)Modificar indirectamente la sensibilidad del
detector
44
45. Tipos de reacciones de derivatización
Reacciones sustractivas:
Un grupo funcional de un analito se hace reaccionar con un reactivo para originar un
derivado no volátil, el cual no es arrastrado por el gas portador.
Tetradecano +alcohol heptílico+2,4-hexadienal+2-nonanona + ácido Bórico+o-
dianisidina +
bencidina tetradecano
Agente sustractivo Compuestos sustraibles
Ácido bórico Alcohol primario y secundario
O-dianisidina aldehído
bencidina cetona
45
47. La utilización de estas reacciones permite
obtener:
Datos sobre grupos de compuestos
Simplificación de cromatogramas complejos o mal resueltos
Eliminación del pico correspondiente al componente
mayoritario
Se realizan de forma continua.
47
48. Reacciones No Sustractivas
Son de tipo discontinuo llevándose a cabo reactor o recipiente de mezcla.
Las más utilizadas en C.G.
Sililación: la sustitución de un hidrógeno activo de un grupo funcional por un
sililo.
R-OH + Cl-Si(CH3)3 —> R-O-Si(CH3)3 + HCl
Grupos sililos
sustituidos
(CH3)3Si-Cl
(CH3)3Si-NH-Si(CH3)3
(CH3)3Si-N(C2H5)2
CX3CON(CH3)-Si-
(CH3)3
48
49. Reacciones No sustractivas
Produciendo en la molecula del soluto:
1)reducción de su polaridad
2)reduce la posibilidad de formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares
3)aumenta la volatilidad y estabilidad térmica
Las reacciones de sililación se aplican en:
Separación de aminoácidos
Analizar azúcares.
Separar fenoles
49
51. Reacciones No sustractivas
Reacciones de alquilación
Consisten en sustituir un átomo de hidrogeno activo por un
grupo alquilo o un grupo arilo.
La aplicación principal de esta técnica es la conversión de ácidos
orgánicos en ésteres, que permiten mejores cromatogramas que
los ácidos libres.
Cl-CH2-CH2 -CH2 -CH3+ H3C-COOH + Ag2O —> H3C-COO- CH2-
CH2 -CH2 -CH3
51
52. Reacciones No Sustractivas
Reacciones de esterificación:
Son utilizadas para derivatizar grupos funcionales ácidos
Son lentas
R-COOH + CH3OH/BF3 —> R-COOCH3
Reacciones de acilación:
La acilación con haluro de acilo se usa para transformar alcoholes y aminas
primarias y secundarias en derivados estables.
H3C-CO-Cl +R-OH —>H3C-CO-OR
52
53. R
Reacciones de acilación:
Reacciones de formación de perfluorderivados:
Se utiliza para originar derivados capaces de captar electrones
Grupos funcionales que originan
reacciones de acilación.
OH-OAc NH2-NHAc-N(Ac)2
NOH-NOAc CH2C=O-CH=COAc
SH-SAc SO2NHR-SO2NRAc
Reactivos Grupos funcionales de los solutos
que reaccionan con los reactivos.
Cloruro de pentafluorbenzoilo Aminas, fenoles, alcoholes
Bromuro de pentafluorbencilo Ácidos carboxílicos, fenoles,
mercaptanos
Alcohol pentafluorbencílico Ácidos carboxílicos
53
55. Procesos Pirolíticos
Es una técnica de derivatización en la que en lugar de un reactivo químico se
utiliza el calor.
Forma continua: la muestra se introduce en el pirolizador situadoa al entrada
del cromatógrafo.
Forma discontinua: Se recogen primero los derivados volátiles y
posteriormente se inyectan, ya sea en forma de líquidos o gas y disueltos en
disolvente adecuado.
55
56. Derivatización en cromatografía
líquida.
Objetivos:
a)Facilitar/posibilitar /mejorar la detección cromatográfica continua.
b)Aumentar la sensibilidad
c)Aumentar la selectividad
Pre-columna y post-columna son los sistemas de derivatización en cromatografía en
columna mas convenientes.
La derivatización pre-columna se realiza generalmente en forma discontinua y la post-
columna se realiza en forma continua.
56
57. Sistemas pre-columna:
Se realiza mediante una reacción derivatizadora en un matraz
Erlenmeyer donde se adiciona la muestra y el reactivo en el
medio adecuado.
Después de un intervalo de tiempo, una alicuta es introducida en
el cromatógrafo de líquidos.
57
58. Detección.
Detección por absorción UV-visible.
Consiste en la introducción de un grupo cromóforo en los análitos de interés,
algunos reactivos usados como cromóforos para introducir los analitos.
Grupo funcional agente derivatizador
Alcoholes Cloruro de 3,5-dinitrobencilo
Cloruro de piruvoilo
Isocianato de fenilo
Aminas Cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo
Cetonas y Aldehídos 2,4-Dinitrofenilhidracina
Bromuro de fenacilo
Fenoles Cloruro de piruvoilo
58
59. Detección fluorimétrica.
a)Elevada sensibilidad
b)amplio rango de lineabilidad
c)Mayor selectividad
-Detección electroquímica
Por su sensibilidad y selectividad es posible la reducción del grupo
nitro aromático.
59
60. Sistemas Post-columna
Consiste básicamente en una bomba, un reactor con control de temperatura y,
eventualmente, un soporte externo para los recipientes de reactivos. Requiere un
HPLC con detector UV y FL y posibilidad de crear gradientes para algunas
aplicaciones.
La derivatización post-columna aumenta la sensibilidad y selectividad para
muchas aplicaciones de HPLC.
Se realiza de forma continua en los detectores de reacción post-columna.
60
61. Diferencias entre derivatización continua y
discontinua.
Derivatización pre-columna (Discontinua) Derivatización post-columna(Continua)
En la columna cromatográfica se separan los
productos de reacción.
En la columna cromatográfica se separan los
analitos.
Optimización de las condiciones de
derivatización y separación.
Dificultad de operar en las condiciones óptimas
en la separación y derivatización.
Es necesaria la formación de derivados estables
y bien definidos
No es necesaria la formación completa de los
derivados.
La cinética de formación de los derivados no es
trascendental.
La cinética de la reacción derivatizadora es
importante en el diseño del montaje continuo.
Operación llevada a cabo en forma manual. Operación llevada a cabo en forma automática.
Reduce notablemente la velocidad de muestreo. No altera significativamente la frecuencia de
muestreo.
61
62. Referencias
Skoog, D. A.; Holler, H. J. y Crouch, S. R. (2008). Principios de análisis instrumental. Sexta edición.
México: Cengage Learning 858-860, 927
Canosa, M. del P. (2005). Desarrollo de metodología analítica para la determinación de triclosán y
parabenos. Aplicación al estudio de su distribución y transformación en muestras ambientales. Madrid:
universidad Santiago de compostela 27-40.
Rubinson, K. A. y Rubinson, J. F. (2001). Análisis instrumental. Madrid: Pearson Prentice Hall 92-95, 111,
112
Análisis Instrumental de Alimentos - Diplomatura de Nutrición Humana y Dietética. Asignatura de
Análisis Instrumental de Alimentos.
Universidad autónoma de Madrid. [Recurso Online]. Ref. http://
www.uam.es/personal_pdi/ciencias/alimento/TemaJS-AISA.pdf
http://biblioteca.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0053101.pdf
Niño G., Jeny. “La cromatografía de gases en la medida de la concentración de hap de ultra trazas en
agua: pre-concentración del analito.” Universidad Federal de Bahia, Instituto de Geociencias, Salvador,
Brasil.
Técnicas analíticas de separación/Valcarcel/Editorial Reverté/pag. 682-720
http://www.areaciencias.com/quimica/que-es-reactor-quimico.htm 15/NOV/2015 5:50 hrs.
62
