1. in vitro]
[TOX
David Ramos
Investigador CERETOX
dramos@pcb.ub.cat
Jornada: The in vitro choice
29 de Noviembre de 2013
Parc Científic de Barcelona

2. ¿El modelo ideal?
HUMANOS
IN VIVO
IN VITRO
IN SILICO
REALIDAD
A
C
E
R
C
A
M
I
E
N
T
O
Perdida de
información

3. ¿Por qué In vitro?
1
Forma parte del avance tecnológico
2
Throughput (screening molecular)
3
Tiempo (días, semanas vs años)
4
Coste (- maquinaria + persona )
5
Menor gasto de molécula (µg vs g)
6
Moral/Ética (Refinamiento, reemplazo, reducción)
7
Obligaciones legales (pharma vs cosmética)

4. Técnicas validadas
Toxicidad sistémica
OECD
ICCVAM
ECVAM
FDA
VALIDAN
TÉCNICAS
IN VITRO
Genotoxicidad
Reprotoxicidad
Carcinogénesis
Tolerancia local

5. Toxicidad sistémica
3 Rs
Reducción,
refinamiento
Reducción,
refinamiento
Reducción,
refinamiento
Reducción,
refinamiento
MTT Assay - Acute oral Toxicity
3T3 NRU Phototoxicity Test Fototoxicidad
Mecanismo
Endpoint
Neutral red
uptake/IC50
Vibilidad celular
Vibilidad celular
ICCVAM
Neutral Red
Uptake
Compound 4
001
001
OECD 432
IC50
100
090
080
070
060
050
040
030
020
010
000
000
ICCVAM
MTT uptake/IC50 ECVAM 17
Exposicion UVA viabilidad
Neutral red
Normativa
Neutral red
uptake/IC50
Vibilidad celular
Cell Number (% Viable)
ACUTE
SYSTEM
TOXICITY
Ensayo
3T3 NRU - Acute oral Toxicity - Fixed
Dose Procedure
Normal human epidermal keratinocyte
NHK - Acute oral Toxicity - Fixed Dose
Procedure
002
002
003
Log Concentration (µM)
IC50 (µM)
MTT
Compound 4
[LB, UB]
88.79
[76.12, 102.26]

6. Genotoxicidad
Ensayo
Ames Test - Bacterial Reverse Mutation
Test
3 Rs
Mecanismo
Endpoint
Mutagenicidad en Colonias revertintes
Reducción
S. typhymurium
vs espontáneas.
Translocaciones y
In Vitro Mammalian Chromosome
Alternaciones
Reducción
perdidas de
Aberration Test
cromosómicas
cromosomas
GENOTOXICITY
Colonias mutantes
Mutagenicidad en en medio selectivo
In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation
Reducción
vs colonias en medio
TK cell
Test
no selectivo
MNT in vitro - In vitro Mammalian Cell
Alteración nuclear MN generados en
Reducción
Micronucleus Test
post-mitosis
celulas binculeadas
DNA Single Strand Damage - Comet
Daño en el DNA,
Refinamiento
Tamaño cola Comet
Assay
electroforesis
Ensayo
Normativa
OECD 471
OECD 473
OECD 476
OECD 487
ASTM E2186
3 Rs
Normativa
In Vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells
Reducción
OECD 479
Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay
Reducción
OECD 480
Reducción
OECD 481
DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in
Mammalian Cells in vitro
Reducción
OECD 482
Escherichia coli, Reverse Assay
Reducción
OECD 472
OTRAS
GENOTOXICITY Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay

7. Genotoxicidad
MN In vitro
Ames Test
Comet Assay
Aberraciones
cromosómicas

8. Toxicidad en la reproducción
Ensayo
REPROTOX
EST
MM
Mecanismos
Endpoint
Directive
Citotoxicidad
IC50 3T3, IC50 D3,
EST Embryonic Stem Cell Test
Reemplazo parcial 3T3/D3 + Gota
ECVAM 113
ID50
pendiente D3
Extremidades
IC50 para la
embriones +
MM Micromass Embryotoxicity Assay
Refinamiento
ECVAM 114
inhibición y
citotoxicidad 5 dias
citotoxicidad
+ Alcian blue
IC50 ICMAX for
Cultivo de
WEC Whole rat Embryo Embryotoxicity
malformations;
ECVAM 123
Refinamiento
embriones
Test
ICNOEC for Total
expuestos
Morphlogical score
Exposición embrión
Alteraciones
FET
Refinamiento
OECD 236
zebrafish
morfologicas embrion
Cultivo ES-D3
Extracción miembros
3 Rs
Día 0
Día 3-5
Tinción NR
Día 10
Tinción Alcian Blue

9. Carcinogénesis
Test Method
CARCINOGÉNESIS
3 Rs
CTA – Balb/c 3T3 Cell
Transformation Assay
Reemplazo
CFE Citotoxicity
Dia 46 estudio: contaje de
focos
Mecanismo
CFE citotoxicity + ½ Fase
testado como inductor o
promotor
Endpoint
Focos Tipo III
transformantes
Focos tipo III
Directive
OECD Draft 31
ECVAM
Recomendation

10. Tolerancia local
Ensayo
In Vitro Skin Corrosion: Human
Skin Model Test Episkin,
Epiderm)
SKIN CORROSION
CORROSITEX - In Vitro
Membrane Barrier Test Method
for Skin Corrosion
SKIN IRRITATION
RHE Model Test (Episkin,
Epiderm)
DERMAL
PENETRATION Skin absorption
TESTING
HEMOLISIS
Red Blood cell test
LLNA /BrdU
3 Rs
Mecanismo
Endpoint
OECD
Reemplazo
Exposición producto
sobre RHE
Viabilidad por MTT
OECD 431
Tiempo necesario para
corroer membrana
OECD 435
Viabilidad por MTT
OECD 439
Reemplazo
Reemplazo
Refinamiento
Reemplazo
Refinamiento
SENSIBILIZACIÓN
hCLAT
Reemplazo
Membrana sintética
Exposición producto
sobre RHE
Cámara Franz con
% molécula recuperada
fluido donador y
OECD 428
receptor
Exposición de la
Hemolisis 50%
sustancia en eritrocitos
ECVAM 99
aislados
Exposición en ratón,
Cantidad de timidina tritiada
OECD
extracción nódulos
recogida
429/442
linfáticos
Exposición a células
THP1
Detección de receptores
CD86-54
Draft

11. Tolerancia local
Ensayo
BCOP - Bovine Cornea Opacity Test
EYE
ICE - Isolated chicken eye test
IRRITATION
HET-CAM - Hen's egg test - chorioallantoic membrane
3 Rs
Mecanismo
Endpoint
Exposición a
Opacidad de la
Reemplazo parcial corneas
cornea
bovinas
Opacidad y
Exposición a
Reemplazo parcial
fluorescencia e
corneas
hinchazón
Huevos
Hemorragia, lisis
Reemplazo parcial fertilizados de los vasos,
post-10d
coagulación
Directiva
TG 437
TG 438
ECVAM 047

12. Un futuro prometedor
Tenemos un mayor conocimiento de los mecanismos
moleculares
Estamos más cerca de sustituir el uso de animales
Debemos avanzar hacia modelos que nos acerquen a la
realidad
Los ensayos in vitro representarán en un futuro próximo una
parte muy importante en el desarrollo de un nuevo
producto y en la fase regulatoria.

13. En CERETOX tenemos una
amplia experiencia en hacer
todas estas técnicas
CERETOX
Parc Científic de Barcelona - Edifici
Cluster
c/Baldiri Reixac, 10-12
08028 Barcelona
T. 93 403 71 83
www.pcb.ub.cat/ceretox
ceretox@pcb.ub.cat
http://goo.gl/BGLwt
http://goo.gl/VBsu7