Bài giảng trong khoá học Sinh học Phóng Xạ tại Rouen (Pháp) 2014 dành cho đối tượng bác sĩ nội trú ung thư (Xạ trị).

1. Các cơ chế
“Chết tế bào”
trong xạ trị
C. HENNEQUIN,
Bệnh viện Saint-Louis, Paris
S. RIVERA
Viện Gustave Roussy, Villejuif
Dịch: BSNT. Trần Trung Bách

2. Chết tế bào:
Định nghĩa
“Chết” tế bào hay “chết” clon tế bào:
Mất khả năng phân bào
à Tác dụng được nghiên cứu trong xạ trị

3. Chết tế bào
1/ Các tế bào có khả năng phân chia
à Mất khả năng phân bào
Lợi ích mong đợi trong điều trị ung thư
Gây chết cả 1 clon tế bào
2/ Các tế bào biệt hoá
Tế bào thần kinh, cơ, chế tiết …
à Mất chức năng
Mô lành +++ Độc tính

4. Phản ứng của tế bào với xạ trị
Chiếu xạ
Đứt gãy chuỗi kép ADN
Sửa chữa đứt gãy chuỗi
kép ADN
Thích ứng với tổn
thương còn lại
• Thiếu oxy
• Dọn dẹp các gốc tự do
• Cấu trúc chromatin
• Dừng chu kỳ tế bào để
sửa chữa
• Tổng hợp các enzym sửa
chữa
-­ Hiệu quả của quá trình
sửa chữa
Tế bào sống sót
Tế bào chết
Cơ chế chết tế
bào

5. Tác động của các bức xạ ion hoá lên tế bào
-­ Gây ra các tổn thương ADN
-­ Hoạt hoá các con đường tín hiệu
=> Biến đổi bộc lộ kiểu gen
=> Tổng hợp/giáng hoá protein
-­ Đột biến/ rối loạn nhiễm sắc thể
-­ Thay đổi tiến trình chu kỳ tế bào
-­ Thay đổi kiểu hình
-­ Chết tế bào

6. Phân loại tổn thương
l Tổn thương gây chết tế bào:
Không thể sửa chữa
Nhanh chóng dẫn đến chết tế bào
l Tổn thương có khả năng gây chết tế bào
> Có thể được sửa chữa tuỳ theo đặc tính của tế bào tổ chức
mô bị chiếu xạ
l Tổn thương “cận tử”:
> Có thể được sửa chữa nếu tế bào có đủ thời gian

7. Lý thuyết về tổn thương “cận tử”
l Những tổn thương có khả năng sửa chữa nếu có đủ
thời gian để quá trình sửa chữa diễn ra
1 2 3 4 5
Tỷ lệ tế bào
sống sót
Thời gian (Giờ)
Khoảng thời gian giữa 2 lần chiếu xạ
Thời gian cần thiết để
sửa chữa
Khác nhau giữa các
loại mô

8. Chiếu xạ
Sửa chữa trở lại nguyên vẹn
Sửa chữa còn sai lệch
Quá trình sửa chữa
Yếu tố Thời gian
Chu kỳ
tế bào
Nhiễm sắc thể
Chết tế bào theo chương trình
Hoại tử
Sống sót với bộ gen mất ổn định
Chuyển đoạn
Đảo đoạn
Telomere capture
Mất đoạn
Mất tâm động
Hai tâm động
Đứt gãy
p53
P
Hiện tượng “Lão hoá”p21Waf1
Các sự kiện dẫn đến chết tế bào gây ra do xạ trị
Các con đường khác???

9. Các hình thức ”Chết tế bào” khác nhau
CTB lập tức Lão hoá Tế bào mất khả
năng phân chia
Hoại tử
CTB theo chương
trình (Apoptosis)
Không theo
chương trình
Theo chương
trình
Không theo chương
trình
Theo chương trình
Các tế bào
biểu mô
Các nguyên
bào xơ
Các tế bào biểu mô
Đột biến/mất đoạn
pT53
Tế bào lympho, tế
bào tuyến ức, tuyến
tiền liệt, tuyến nước
bọt, tuyến ruột, các tế
bào nội biểu mô
“CTB” = Chết tế bào

10. Chết tế bào lập tức
Xảy ra sau chiếu xạ từ một vài phút đến vài giờ
Yêu cầu một liều chiếu xạ cao
Hoạt hoá quá mức PARP
Mất tính toàn vẹn của màng tế bào, hoạt hoá các lysosom
Giáng hoá nhanh các cơ quan nội bào

11. Hiện tượng lão hoá/ Ngừng chu kỳ tế bào tại
pha G1
Ngừng CKTB ở pha G1 vĩnh viễn: các nguyên bào xơ
Biến mất hoàn toàn các cycline và mất vĩnh viễn khả năng
phân bào
« Một liều duy nhất từ 40 đến 60 Gy »
Các nguyên bào xơ vẫn duy trì các hoạt động chuyển hoá
trong một thời gian dài,
Các nguyên bào xơ trong môi trường
nuôi cấy
Các tế bào “trẻ” kích thước nhỏ, bắt màu
thuốc nhuộm ít với b-­Galactosidase.
Các tế bào “lão hoá” kích thước lớn, đa
nhân, dương tính với b-­Galactosidase.

12. Hiện tượng lão hoá
§ Mất vĩnh viễn khả năng tăng sinh của tế bào u
§ Xác định bởi:
§ Tăng giải phóng b-galactosidase
§ Các ổ “cô đọng” chất nhiễm sắc đặc hiệu
§ Đã được quan sát thấy khi xạ trị các tế bào tuyến tiền liệt
Tiến trình:
Tổn thương ADN ----> p53 ----> p21 ----> Ngừng chu kỳ tế bào
Không có hiện tượng lão hoá ở những tế bào có gen p53 đột biến

13. Các
cơ
chết
CTB
của
tế
bào
ung
thư
CTB
qua
cơ
chế
tự
thực
bào
CTB
týp 2

14. Hiện tượng tự thực bào
Quá trình ”tiêu hoá” của tế bào
Giáng hoá các protein và cơ quan nội bào nhờ lysosom
Hình thành các thể tự thực bào trong tế bào
Chứa các protein và cơ quan nội bào
sau đó hoà nhập với các lysosom
Được điều hoà bởi cơ chế gen
Các gen liên quan đến cơ chế tự thực bào

15. CTB qua cơ chế tự thực bào

16. Các
cơ
chết
CTB
của
tế
bào
ung
thư
Cơ
chế
tự
thực
bào
CTB
týp
2
Cơ
chế
hoại
tử
CTB
týp
3

17. Chết tế bào
Ø Những cơ chế chính:
§ Mất khả năng phân bào và Hoại tử
§ CTB theo chương trình
Ø Mất khả năng phân bào và Hoại tử
Ø Xảy ra khi các tổn thương không được sửa chữa dẫn
đến rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể (2 tâm động, không
tâm động…) à Gây ra “thảm hoạ” trong các lần phân bào
tiếp theo

18. CTB do các “thảm hoạ” phân bào
Phân chia tế bào
không đối xứng

19. Chết tế bào
• Các rối loạn nhiễm sắc thể nặng:
-­ Không truyền lại cho thế hệ tế bào sau
-­ Dẫn đến CTB nhanh chóng
• Các rối loạn “nhẹ”
(Chuyển đoạn, đảo đoạn, đứt đoạn ngắn)
• Tế bào sống sót có thể tạo nên 1 clon tế bào mang cùng
rối loạn gen/NST
• Nhưng bộ gen/NST luôn bất ổn định
• Có thể gây CTB về sau

20. CTB muộn
Sau khi bị chiếu xạ, một số tế bào rồi cũng sẽ kết thúc
bằng CTB tuy nhiên, sau một số lần phân bào (đến 20).
(Thompson, IJRB, 1969)

21. CTB muộn
• Hậu quả của việc di truyền những rối loạn NST qua các lần
phân bào
Rối loạn cấu trúc phức tạp/2 tâm động:
Giảm 30-­50% mỗi lần phân bào
• Hoặc cần thiết phải trải qua một vài lần phân bào (Bộ gen mất
ổn định)
Tăng khả năng xuất hiện đột biến mới, rối loạn NST mới
à Những rối loạn gây chết tế bào
Þ Giảm khả năng tăng sinh của tế bào được chiếu xạ (Plating
efficiency)
(Little, IJRB, 1990;; Motherhill, IJRB, 1997;; Hendry, Radioth. Oncol, 2001)

22. Mất khả năng phân bào
• Không thể hoàn thành 1 chu kỳ tế bào trọn vẹn,
• Hậu quả của việc tích luỹ nhưng tổn thương NST không
được sửa chữa
• Xuất hiện các tế bào 2 nhân, khổng lồ hoặc những nhân nhỏ
(micronucleus)
• Hình thức CTB chủ yếu đối với các tế bào biểu mô
• Có thể dẫn đến Hoại tử hoặc CTB theo chương trình

23. Hiện tượng Hoại tử (Necrosis)
-­ Đặc hiệu cho các tế bào có thể phân chia
-­ Tăng tính thấm của màng tế bào
-­ Suy giảm nhanh chóng sinh tổng hợp protein
-­ Sự phồng lên của các ty thể, sau đó của cả tế bào
-­ Tương quan giữa Hoại tử và:
-­ Số lượng tổn thương ở ADN
-­ Các rối loạn NST (Ward, IJRB, 1990)
-­ Tạo nên hình ảnh “cao nguyên” của đường cong tỷ lệ tế bào sống sót
(Khi các tổn thương còn trong giới hạn cho phép sửa chữa)
Khả năng của tế bào sửa chữa chính xác và hoàn hảo các
thương tổn ADN
Các bất thường chuyển hoá

25. Hoại tử
Kerr, 1965: Observations morphologiques
• Bào tương và các cơ quan nội bào phình to
• Tăng tính thấm của màng tế bào
(thuốc nhuộm qua màng tế bào: hình ảnh ái toan)
• Cô đọng sau đó phân huỷ chất nhiễm sắc
• Biến mất các cơ quan nội bào và xuất hiện không bào
• Thâm nhiễm các tế bào viêm

26. CTB theo tiến trình Hoại tử

27. Hoại tử tế bào
V79 được chiếu xạ 5 Gy, 7 ngày sau
A: quần thể tế bào bình thường
B,C: quần thể được chiếu xạ

30. Chết tế bào theo chương trình-­Apoptosis
Được mô tả đầu tiên như 1 hiện tượng chết tế bào ở Gian kỳ
(Không cần thiết phải có phân bào)
Được mô tả ở các tế bào lympho, tinh bào và tế bào trứng
Quá trình chủ động, một số protein cần thiết được tổng hợp
Chết tế bào “theo chương trình”

31. Những sự kiện dẫn đến Apoptosis
- Tuỳ theo týp tế bào:
• Sự biệt hoá của tế bào đến một mức độ nào đó trong quá trình phát triển
• Mất tác động của hormone hay các yếu tố phát triển
• Tín hiệu Apoptosis (thụ thể FasAPO-­1/CD95 ở tế bào lympho)
• TGF-­ß, TNF, corticoid, …
• Mất sự kết dính với mạng lưới ngoại bào (anoikis)
• ADN bị phá huỷ bởi các tác nhân: Thuốc, độc tố, tia X, …

32. Apoptosis
Tín hiệu Apoptosis
Initiator Caspase
(cysteine-aspartic proteases)
Effector Caspase
Coactivators Inhibitors

33. Các quá trình sinh hoá trong Apoptosis:
Hoạt hoá các Endonucleases
• Endonucleases: phân cắt ADN thành các nucleosomes
à các mảnh nhỏ gồm 185 cặp base
à Hình ảnh «Bậc thang Apoptosis» trên gel agarose
• Có thể nhận dạng các nucleosomes, không thuộc các chuỗi ADN
• Kích hoạt: - endonucleases DNAse I et II
- NUC-18 (Tế bào tuyến ức)

35. Apoptosis: nhìn tổng thể
Con đường ngoại sinh CĐ nội sinh
Tín hiệu
Các protein liên quan
TNF
- Mất tác động
của GF – tia X,
Hoá chất
Hoạt hoá Caspase
Death effectors:
FADD, TRADD
Giải phóng
Cytochrome C
Initiator caspases Caspases 8, (10)
Apaf-1
Caspase 9
Effector caspases
Caspases 3, (6-7)
APOPTOSE

36. Con đường nội sinh
CytochromeC
Bcl2 Bax
Tín hiệu
gây độc tế bào
Apaf-1
Caspase 9
Caspase 3
ThểApoptosis
IAPs Diablo
IAPs: Chất ức chế Apoptosis

37. Chết tế bào theo tiến trình
Apoptosis

38. Apoptosis sau chiếu xạ
v Apoptosis ảnh hưởng quan trọng đến chỉ số a của đường
cong tỷ lệ tế bào sống sót
v Không có hiệu ứng Liều/apoptosis;; Không có hiệu ứng
suất liều
(Stephens, Rad Res, 1993;; Meyn, IJRB, 1993;; Clifton, Radioth. Oncol., 1994)
v Hiệu ứng Apoptosis không thay đổi giữa các lần chiếu xạ
(Meyn, IJROBP, 1994)

39. Apoptosis do xạ trị
v Thường xảy ra trong vòng 48 giờ sau xạ trị
§ Trước giai đoạn phân bào
§ CTB trong gian kỳ (Stephens, Rad Res, 1991)
§ Khởi phát bởi tổn thương đứt gãy chuỗi kép ADN (DSB)
(Story, IJRB, 1994)

40. Tổn thương ADN
Các cảm biến với tia xạ
Kích hoạt P53
Truyền tín hiệu
P21; Rb
Mdm2
Gadd45
Mất khả năng phân bào
Caspases
Bax
Fas
Apoptosis

41. Apoptosis
Phụ thuộc p53
- Tia X và cực tím
- Hoá trị
- Virus
Không phụ thuộc p53
- Thiếu hụt hormone
- Thiếu hụt yếu tố tăng trưởng
- Corticoid (các tế bào tuyến ức)

42. Apoptosis do xạ trị
-­ Cần p53 (+++)
(Kastan, Cancer Res., 1991; Kuerbitz, PNAS, 1992)
-­ Chiếu xạ làm tăng hoạt động p53 của tế bào
( Zhan, Mol Cell Biol, 1993)
-­ Các tế bào có đột biến p53 trở nên đề kháng với xạ trị
(Lowe, Science, 1994)
Các tế bào tuyến ức của chuột p53 -­/-­: Không có apoptosis sau
xạ trị
(Clarke, Nature, 1993;; Lowen, Blood, 1993;; Lowe, Nature, 1993)
Các tế bào tuyến ruột: Chuột bình thường: apoptosis
Chuột p53 -­/-­: Không có apoptosis
(Clarke, Oncogene, 1994)

43. Trạng thái p53 và hiệu quả của các
phương pháp điều trị ung thư In Vivo
Lowe, Science, 1994
Các tế bào sarcoma xơ p53 +/+ hoặc p53 -/-
Tiêm vào chuột bình thường
Chiếu xạ (7Gy hoặc 14 Gy) hoặc điều trị Adriamycin
Chết bởi apoptosis sau xạ trị hoặc hoá trị

44. 7 Gy
14 Gy
Adria
Lowe,
Science, 1994
p53 +/+
p53 -/-

45. Apoptosis do xạ trị
p53
Bax (Noxa)
Giải phóng cytochrome C từ
Các ty thể
Apaf-­1/casp-­9
Bcl2

46. Hậu quả đứt gãy chuỗi kép ADN
DNA-­DSBATM DNA-PK
(p450, Ku 70/86)
p53
Bax Bcl2
Apoptosis
p21
Trì hoãn G2/S/G1
Sửa chữa Hồi phục toàn vẹn
khả năng phân bào

47. P53 ở vị trí trung tâm trong đáp ứng
của tế bào với tổn thương do xạ trị

48. P53: Người bảo vệ của bộ gen
P53:
Tác giả trực tiếp của các đáp ứng với tổn thương ADN
Liên kết với các protein
XPD, XPB et CSB (Hélicases)
Của Nucleotide-excision repair (NER)
(Wang, Nature Genet, 1995;
Leveillard, EMBO J, 1996)
Liên kết với Helicases:
WRN: Hội chứng Werner
BLM: Hội chứng Bloom
RECQ4: Hội chứng
Rothmund-Thomson
Tạo thuận lợi cho « base excision repair »
(Offer, FEBS Lett., 1999)

49. Tác động trực tiếp của P53
đến quá trình sửa chữa DSBs
Hiệu quả sửa chữa DSBs
theo trạng thái p53
Dòng tế bào HCT116 wP53
đường ô trắng
Và dòng tế bào suy giảm p53
đường ô đen
Mirzayans, IJROBP, 2006

50. Vai trò của Bax
trong Apoptosis do xạ trị
-­ Tăng Bax phụ thuộc p53 sau xạ trị
Được chứng minh ở nhiều dòng tế bào
-­ Nhưng:
-­ Hiệu ứng Apoptosis do p53
Được quan sát ở những trường hợp không tăng Bax
-­ Chuột Bax -­/-­
Vẫn có apoptosis phụ thuộc p53 sau xạ trị.

51. 4 con đường Apoptosis
l P53 -­-­> BAX -­-­-­> CĐ nội sinh
l Tổn thương ADN -­-­-­> Ceramide synthase -­-­-­> CĐ nội sinh
l Tổn thương màng tế bào
> -­-­-­> kích hoạt sphingomyélinase
> -­-­-­> chuyển dạng sphingomyéline sang céramide
> -­-­-­> kích hoạt CĐ nội sinh
l Kích hoạt con đường ngoại sinh

52. «Target» trong Apoptosis do xạ trị:
Màng tế bào ?
Chiếu xạ
Kích hoạt trực tiếp sphingomyelinase
màng tế bào
Ceramide Sphingomyelin
Apoptosis
Chuỗi chuyển hoá
(Santana, Cell, 1996
Chumura, Cancer Res, 1997)

53. 4 con đường Apoptosis
DNA
damage
Ceramide
synthase
Ceramide
Sphingomyelinase
p53 Bax
Fas
Death
Receptor
Caspase 8
Apoptose

54. Apoptosis và Đáp ứng với xạ trị
v Tầm quan trọng của hiện tượng Apoptosis sau chiếu xạ?
• Tuỳ theo loại mô được nghiên cứu
• Rất khác nhau giữa các loại khối u
• Ví dụ: các nguyên bào xơ không chết bởi apoptosis
(Yanagihara, IJRB, 1995)
• Đây là hình thức CTB chính của các tế bào tạo máu
v Hiệu ứng Apoptosis có vẻ tương ứng với hiệu quả kiểm soát khối u
v Với một số dòng tế bào, không có tương quan giữa Apoptosis do xạ trị
và tỷ lệ sống sót của tế bào
(Alridge, Br J Cancer, 1995)

55. So sánh hiệu ứng
Apoptosis của 15
loại khối u khác
nhau

56. Apoptosis trong xạ trị phân liều
Chen, Rad Res, 1994 -
Tế bào phôi chuột
- Tỷ lệ sống sót với apoptosis: 0.53
- Tỷ lệ sống sót không apoptosis: 0.67
Sau 2 Gy:
Sau
32 phân liều
- Tỷ lệ sống sót với apoptosis : 1.5.10-9
- Tỷ lệ sống sót không apoptosis : 2.7.10-6
=> Tỷ lệ kiểm soát tại chỗ giảm xuống 30%

57. Apoptosis tự phát ở khối u
-­ Hiếm xảy ra
-­ Ở ung thư cổ tử cung:
Ghi nhận ở 0-­4% các tế bào
(Levine, Lancet, 1994, 344: 472)
-­Yếu tố tiên lượng trước khi bắt đầu xạ trị
=> Dữ liệu chưa thống nhất

58. Những giải thuyết mới
Đích tác động: ADN
Đích tác động: màng/bào tương
Hiệu ứng Bystander

59. Chết
tế
bào
theo
tiến
trình
Entosis
Post-­‐Doc2
Ø Cơ
chế
Chết
tế
bào
không
phải
Apoptosis
Ø Hiện
tượng
nhập
bào
1
tế
bào
sống
và
trong
1
tế
bào
sống
Ø Phân
giải
tế
bào
nhập
bào
nhờ
các
lysosom
của
tế
bào
chủ
Overholtzer et al. Cell.
2007.

60. Pleural effusion
MUC-­1
b-­cat
Breast tumor
b-­cat
Cano et al, EMBO Molecular Medicine
(2012)
Florey et al, Nature Cell Biology (2011)
Krajcovic et al, Nature Cell Biology (2011)
Guadamillas, Journal of Cell Science (2011)
Yuan, et al, Genes and Development (2010)
Wang et al, Cell Research (2009)
Overholtzer et al, Cell (2007)
White et al, Cell (2007)
Entosis
trong
các
khối
u
Post-­‐Doc2
Cytokeratin 5
b-­cat
Melanoma
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
0
100
200
300
400
Nbre/de/cita5ons/par/année
!Cannibalisme!cellulaire!et!entose

61. Tổng kết:
Chết tế bào trong sinh học phóng xạ
l = Mất khả năng phân bào và tế bào không nhất
thiết phải biến mất!!!
l 1 tế bào chết có thể còn các hoạt động chuyển hoá
l Hiệu ứng gây CTB ↗ cùng với mức liều nhưng động
học của quá trình sửa chữa là hằng định