1. Vliv vnitřních a vnějších
faktorů na mikroorganizmy v
potravinách

2. Faktory ovlivňující růst
mikroorganismů v potravinách
Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní
aktivita,antimikrobiální aktivity
Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra
Implicitní: specifická růstová rychlost,
synergismus, antagonismus, komensalismus
Technologické: krájení, mytí, balení, záření,
pasteurizace

3. Mikroorganizmus a potravina
• uchycení mikroorganizmů (fimbrie, pouzdra, slizová
vrstva)
• kontaminační dávka
• druh mikroorganizmů (růstová fáze, generační
doba)
• mikroflóra potraviny (vzájemné vztahy mezi
mikroorganizmy)
• vliv vnitřních faktorů
• vliv vnějších faktorů

4. Vnitřní faktory
Působením mikroorganismů se mění vlastnosti
potravin (např. textura, konzistence, vůně, chuť,
vzhled). K jakým změnám dojde je závislé na
chemických a fyzikálních vlastnostech potraviny
(intrinsic factors):
• složení potraviny (dostupnost živin)
• koncentrace vodíkových iontů (pH)
• aktivita vody (aw)
• oxido-redukční potenciál (Eh)
• textura potraviny
• přítomnost antimikrobiálních látek v potravinách

5. Vnější faktory
Způsob uchování a skladování potravin má významný
vliv na mikroflóru potravin. Jakost a trvanlivost
potravin je určována vnějšími faktory (extrinsic
factors).
• teplota prostředí
• relativní vlhkost vzduchu (% RV)
• složení atmosféry
• čas

6. Další faktory
Vedle vnitřních a vnějších faktorů má na trvanlivost
potravin z pohledu mikrobiologického vliv také počet
a druhové zastoupení mikroflóry.
Čím méně je v potravině mikroorganismů a čím méně
jsou aktivní, tím delší čas je potřeba k jejich
pomnožení a vzniku senzorických změn (dlouhá lag
fáze a delší generační čas)
Tlak, záření, působení antimikrobiálních látek,
dezinfekčních prostředků

7. Vztahy mezi mikroorganismy
Komenzalizmus
- volné sdružení MO, kteří si vzájemně neškodí ani
neprospívají (např. mikroflóra úst, kožní
mikroflóra, atd.)
Synergizmus (syntrofizmus)
- umožňuje žít určitým MO v daném prostředí pouze
v přítomnosti MO jiných (např. aeroby odčerpávají
kyslík z prostředí → umožňují růst anaerobů,
štěpení makromolekul extracelulárními enzymy,
kefírové kultury)

8. Vztahy mezi mikroorganismy
Symbióza
- vzájemně prospěšné soužití MO, např. s hmyzem,
rostlinami nebo vyššími živočichy (např. rozklad
celulózy v bachoru přežvýkavců, produkce vitaminu
K bakteriemi střevního traktu)
Antagonizmus
- nepříznivé působení jedné skupiny mikroorganizmů
na druhou (např. bakterie mléčného kvašení a
hnilobné bakterie)

9. Vztahy mezi mikroorganismy
Parazitizmus
- jeden MO využívá vnitrobuněčných meziproduktů
metabolismu jiného druhu a tím jej ničí. Jev
častější pro soužití mikroorganizmů s živočichy
nebo rostlinami (např. bakteriofágy, mykoviry)
Metabióza
- produkty metabolismu jedněch mikroorganizmů
jsou postupně využívány mikroorganizmy dalšími
(např. zoctovatění alkoholických nápojů)
- metabióza umožňuje rychlou mineralizaci
organických látek v přírodě - koloběh prvků

10. Vnitřní faktory
- složení potraviny
Obecně platí, že potraviny obsahující více
nízkomolekulárních látek a větší množství vody se
kazí rychleji.
• obsah vody v potravině
• zdroj energie a zdroj dusíku (sacharidy, alkoholy,
AMK)
• zdroj dusíku (AMK, peptidy, bílkoviny)
• vitamíny a růstové faktory (B vitamíny)
• minerální látky

11. pH
Bakterie – slabě kyselé
až slabě alkalické pH
Kvasinky – preferují
kyselé prostředí
Plísně – tolerují velmi
široké rozmezí

12. pH
Hodnota pH ovlivňuje:
- rozmnožování bakterií, rychlost růstu, vitalitu
- intenzitu a charakter metabolizmu
- odolnost buněk ke zvýšených teplotám
- kyselé pH (<4,0) zabraňuje klíčení spór
- změna dostupnosti kovových iontů v alkalickém
prostředí
Vliv má nejen nízká hodnota pH, ale i druh kyselin,
které se na snížení hodnoty podílely.

13. Dělení potravin dle pH

14. Aktivita vody - aw
Aktivita vody
- je definována jako poměr parciálního tlaku vodní
páry nad potravinou (p) k parciálnímu tlaku vodní
páry nad čistou vodou (p0) při dané teplotě:
p
aw =
p0
- množství vody dostupné pro mikroorganizmy pro
chemické reakce buněk
- optimální hodnota pro většinu mikroorganizmů
aw>0,98

15. Aktivita vody - aw
Bakterie
halofilní x halotolerantní
xerofilní x xerotolerantní
osmofilní x osmotolerantní

16. Aktivita vody - aw
Snížení aktivity vody:
• odstranění využitelné vody sušením, uzením,
odpařením, mražením
• zvýšení obsahu tuku
• zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v
prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) → zvýšení
osmotického tlaku (hypertonické prostředí) →
difuze vody z buňky do prostředí → zastavení
metabolizmu až smrt buňky

17. Aktivita vody - aw
Potraviny
• lehce kazitelné (více než 0,95)
• středně kazitelné (0,95-0,92)
• málo kazitelné (pod 0,91)
Důležitá je kombinace aw s ostatními faktory
ovlivňujícími přežívání MO v potravinách.

18. Aktivita vody - aw

19. Redox potenciál - Eh
Oxidačně redukční potenciál prostředí
- je rozdíl potenciálu mezi platinovou (kovovou)
elektrodou umístěnou do daného prostředí a
standardní vodíkovou elektrodou.
oxidace
látka redukovaná látka oxidovaná + n elektronů
redukce
Snížení redox potenciálu:
- přidání redukujících látek
- růst aerobních mikroorganismů
- vakuové balení, atd.

20. Redox potenciál - Eh

21. Textura potraviny
Přirozené krytí povrchu potravin
- skořápka vajec, skořápky ořechů, kůže, vazivová
pouzdra orgánů, povázka masa, kůrka chleba, atd.

22. Přítomnost antibakteriálních
látek (biocidů) v potravinách
• Některé potraviny obsahují přirozené
antimikrobiální látky (koření, minerální oleje,
česnek, hořčice, med)
• Kravské mléko obsahuje laktoferrin,
laktoperoxidázový systém, lysozym, kasein
• Vejce lysozym, conalbumin, ovotransferrin, avidin

23. Antimikrobiální enzymy
Jsou hojně rozšířeny v přírodě a hrají důležitou roli při
obranných mechanizmech živých mikroorganizmů proti
infekcím.
Hydrolázy – degradují klíčové struktury buněčných
stěn (peptidoglykan)
Oxidoreduktázy – vytváří reaktivní molekuly, které
rozrušují vitální proteiny v buňce.

24. Antimikrobiální enzymy
Bakteriolytické
1. N-acetylhexosaminidázy katalyzují štěpení
glukosidických vazeb sacharidů peptidoglykanu
2. N-acetylmuramyl-L-alaninamidázy katalyzují
štěpení mezi sacharidovou a peptidovou částí
peptidoglykanu
3. Endopeptidázy hydrolyzují peptidové vazby
peptidoglykanu
4. Ostatní – chitinázy, ß-glukanázy

25. Antimikrobiální enzymy
Bakteriolytické
Lysozym je aktivní především u G pozitivních bakterií.

26. Antimikrobiální enzymy
Oxidoreduktázy
Glukozooxidázy jsou produkovány některými plísněmi,
podstata cytotoxicity spočívá v tvorbě peroxidu
vodíku (oxidace glukózy na kys. glukonovou a
H2O2)
Laktoperoxidázy se vyskytují např. ve slinách, mléce
(oxidace thiokyanátu na hyperthiokyanát)
Laktoferrin je glykoprotein tvořící komplexy s ionty
železa

27. Vnější faktory
• Teplota
• Složení atmosféry
• Relativní vlhkost vzduchu
• Čas

28. Teplota
• Je jedním z hlavních faktorů vnějšího prostředí,
který ovlivňuje rychlost rozmnožování (přežívání)
bakterií
• Rozeznáváme 3 základní body teploty
minimální teplotu
optimální teplotu
maximální teplotu

29. Rozdělení bakterií podle
vztahu k teplotě
Mikroorganizmy dělíme do skupin podle nároků na teplotu
při které se rozmnožují a metabolizují
Psychrofilní bakterie (12-15 °C)
Psychrotrofní bakterie (25-30 °C)
Mezofilní bakterie (30-40 °C)
Termofilní bakterie (50-70 °C)

30. Vliv vysokých teplot
Smrtící účinek vysokých teplot (letální teplota)
• je nejnižší teplota, při které dochází za určitý čas k
usmrcení (70 °C/10 minut)
• denaturace bílkovin, inaktivace enzymů, narušení DNA a
cytoplazmatické membrány
• je závislá na: druhu mikroorganismu
jeho fyziologickém stavu
koncentraci buněk v prostředí
charakteru prostředí

31. Termorezistence
Stupeň odolnosti mikroorganizmů je závislý na:
• fyziologickém stavu bakterií
• jejich genetické výbavě
• množství bakterií
• obsahu vody v substrátu
• množství ochranných látek (lipidy, proteiny, sacharidy)

32. Sterilizace
• jednorázové použití teploty nad 100 °C
• sterilizace je definována jako kombinace teploty a
času
• sterilizaci potravin přežívají některé spóry (rody
Bacillus a Clostridium)
• praktická (obchodní) sterilita x absolutní sterilita
STERILIZOVANÉ POTRAVINY MOHOU
OBSAHOVAT SPÓRY!

33. Pasterace
Správně provedená pasterace zaručí:
• devitalizaci patogenních mikroorganismů
(M. tuberculosis)
• devitalizaci podstatné části saprofytické mikroflóry
(vegetativních buněk)
• zachování původních fyzikálních, chemických,
výživových a senzorických vlastností
PASTEROVANÉ POTRAVINY OBSAHUJÍ
MIKROORGANISMY!

34. Vliv nízkých teplot
Nižší než optimální teploty přežívá většina mikroorganizmů
dlouhou dobu. Přenesou-li se však z optimálních teplot do
teploty kolem 0 °C dochází k chladovému šoku.
oku
Při pomalém zmrazování buněk na teploty pod 0 °C ze z
vnitro i mimobuněčné vody tvoří velké krystaly ledu, které
buňku nevratně poškozují.
Při rychlém zmrazování buněk na teploty -30 °C – 180 °C
se tvoří mikrokrystalky ledu, které buňky poškozují jen
minimálně.
Po rozmrazení se potraviny rychleji kazí (poškození
živočišných i rostlinných pletiv krystaly vody)

35. Složení atmosféry
Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má
ochranný účinek
• Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných
pro kyslík)
• CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při
skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro
potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné
oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

36. Relativní vlhkost prostředí
Vysoká relativní vlhkost ovlivňuje aw potraviny
(význam balení)
Čím vyšší je teplota, tím nižší
musí být relativní vlhkost
prostředí a naopak

37. Čas
Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek
Vnitřní faktory Vnější faktory

38. Technologie překážek
Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které
musí mikroorganizmy překonat.
I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k
zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení
účinku.
Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí
mikroorganizmy vyvinout.

39. Prediktivní mikrobiologie
Vychází ze znalostí vnitřních
a vnějších faktorů
• Predikce růstu
• Pravděpodobnostní modely
• Kinetické modelování

40. Predikce růstu – modelování
typ zákusek
Počáteční počet LM 104 CFU Teplota 20/10°C
pH 7 aw 0,997

41. • Vliv dalších faktorů na
mikroorganizmy v potravinách

42. Povrchové napětí
• Některé mikroorganizmy se špatnou smáčitelností
buněk rostou v tekutinách ve formě blanky (křísu)
• Povrchové napětí prostředí snižujeme přídavkem
povrchově aktivních látek (tenzidů)

43. Záření
Elektromagnetické vlnění různých délek se
značně liší svými účinky na mikroorganizmy
• Infračervené – nemá přímé letální účinky (teplo!)
• Viditelné světlo – ovlivňuje pozitivně i negativně
některé aktivity buněk
• Ultrafialové – má silně mutagenní a letální účinky
(malá pronikavost)
• Ionizační záření- má silně mutagenní a letální
účinky (vysoká pronikavost)

44. Hydrostatický tlak
Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního
atmosférického tlaku.
Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a
30-40 MPa zcela zastavuje.
Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60
MPa – barofilní x barotolerantní (v hlubinách moří)

45. Ultrazvuk
Ultrazvuk
jsou zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, na
bakterie působí letálně pouze při vysoké intenzitě.
Kavitační ultrazvuk
v důsledku kmitání vzniká prudká pulzace buněčných
membrán a cytoplazmy (letální účinek)
Citlivé k ultrazvuku jsou především tyčinky a vlákna,
koky jsou odolnější

46. Mechanické vlivy
Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou
buněčnou stěnou a malými rozměry
K destrukci buněk dochází:
• opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním
(odolnost enzymů)
• ošetření vysokým tlakem
• třepání s abrazivním materiálem

47. Působení antimikrobiálních látek
Některé látky přítomné v prostředí mají na
mikroorganizmy nepříznivý vliv v důsledku svého
specifického složení (antimikrobiální).
Mikrobistatické
- látky zastavující rozmnožování mikroorganizmů
Mikrobicidní
– látky usmrcující mikroorganizmy
Vliv koncentrace (účinek stimulační)

48. Podle mechanizmu účinku dělíme
antimikrobiální látky
Látky poškozující strukturu buňky nebo její funkci
(např. buněčná stěna, cytoplazmatická membrána,
ribozomy)
Látky působící na mikrobiální enzymy (oxidační činidla,
chelatační látky, těžké kovy, antimetabolity)
Látky reagující s DNA (např. chemické mutageny –
alkylační nebo dezaminační činidla, cytostatika)

49. Cílová místa působení AML na
bakteriální buňku

50. Dezinfekční látky
Sanitace = čištění a dezinfekce
Čištění – odstranění nečistot a zbytků organického
materiálu
Dezinfekce – odstranění mikroorganismů.
Teplota a doba působení čistících a dezinfekčních
prostředků!

51. Dezinfekční látky
• buněčná stěna - poškození
• cytoplazmatická membrána – indukce difuze látek
z buňky, inhibice enzymů CM, oslabení
elektrochemického potenciálu CM
• cytoplazma – koagulace enzymů, ribozomů, NK
Dezinfekční mechanizmus
- oxidace, hydrolýza, tvorba solí s bílkovinami,
koagulace bílkovin, změny permeability, poškození
enzymatického systému, mechanická disrupce.

52. Anorganické sloučeniny
Silné kyseliny a silné zásady
- poškozují BS a CM x poškozují povrchy zařízení
Hašené vápno
- dezinfekce stěn, kvasných kádí, atd.
Uhličitan sodný, fosforečnan sodný, polyfosfáty
- odstranění zbytků tuků a bílkovin x polyfosfáty
ekologicky nežádoucí (eutrofizace vod)
Oxid siřičitý
- síření ovocných a vinných polotovarů, síření sudů,
sklepů, atd.

53. Anorganické sloučeniny
Oxid uhličitý
- uchovávání ovocných šťáv
Organocíničité sloučeniny - Lastanoxy
- antifugální účinek, nátěry stěn, omítek, atd.
Sloučeniny chlóru
- plynný chlór – dezinfekce vody
- chlorové vápno – desinfekce podlah, skladovacích
ploch
- chloramin – směsné čistící prostředky, velmi časté
použití v lékařství i potravinářství

54. Anorganické sloučeniny
Jodové preparáty
- Jodonal M – desinfekce mléčné žlázy
Peroxid vodíku
- sterilizace korunkových uzávěrů, obalů z plastu
(kelímky, tetrapakové obaly,atd.), sýrařství

55. Organické sloučeniny
Organické kyseliny – konzervace potravin
- kyselina benzoová
- kyselina sorbová (plísně)
- kyselina mravenčí (kvasinky, plísně)
Kyselina peroctová - Persteril
Povrchově aktivní látky
- mýdla (sodné soli vyšších MK)
- kvartérní amoniové báze (Ajatin, Septonex)
Antibiotika
- nisin (konzervace potravin)

56. Laboratorní metody
přímé nepřímé
1. kultivační 1. impedanční
2. mikroskopické 2. konduktometrické
3. imunologické 3. metabolická
4. molekulárně aktivita
biologické 4. redukce barviv

57. Kultivační metody
Metoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo
stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebo
druhu bakterií
Výhody
• vysoká citlivost - REFERENČNÍ METODA (ISO, EN)
Nevýhody
• dlouhá doba do dosažení výsledků
• kvantita je vyjádřena jako CFU (KTJ) ne počtem
bakterií

58. Kultivační metody
Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu
(kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou
• Spirálová plotnová metoda
• Petrifilmy
• Hygikulty

59. Kultivační metody
- spirálová plotnová metoda
Malé množství vzorku (35 µl) je nanášeno na rotující
Petriho misku tryskou spirálovitě ve směru od středu
misky k její periferii. Pomocí šablony (manuálně) nebo
laseru (automaticky) je odečítán počet CFU (KTJ) na
misce a ten je přepočten na výchozí objem inokula.
Výhody
• automatizace, eliminace chyb způsobených
lidským faktorem
Nevýhody
• vysoké pořizovací náklady

60. Kultivační metody
- Petrifilmy
Petrifilmy jsou destičky potažené kultivačními
médii ve formě gelu. Destičky se inokulují 1 ml
naředěného vzorku a inkubují v termostatu.
Výhody
• destička je opatřena mřížkou pro snazší počítání
kolonií
• speciální indikátory zbarvují narostlé
kolonie a tím je zvýrazňují

61. Kultivační metody
- Hygikulty
Hygikult je plastová destička oboustranně pokrytá
kultivačním médiem, umístěná ve sterilní nádobce.
Je určen k rychlému monitorování úrovně mikrobiální
kontaminace v potravinářských provozech.
Výhody
• snadnost použití mimo laboratoř
Nevýhody
• sortiment destiček je omezen pouze na indikátorové
mikroorganizmy

62. Membránová filtrace
Metoda slouží k zakoncentrování bakterií
• kultivační metoda
• mikroskopie
filtry z nylonu, PVC, polykarbonátu, polyesteru, kovu
Výhody
• filtrací většího objemu lze zvýšit citlivost metody
• teplý agar nepoškozuje bakterie

63. Mikroskopické metody
Klasické metody - stanovení počtu bakterií po obarvení
preparátu
Moderní metody - epifluorescence
spojuje metodu filtrace a fluorescenční mikroskopie
Princip spočívá ve vazbě fluorochromového barviva na
DNA (RNA) mikrobů (DEFT, BACTOSCAN)
Výhody
• rychlost provedení
Nevýhody
• metoda detekuje i mrtvé buňky

64. Imunologické metody
Princip metody ELISA
Enzymaticky značená specifická protilátka je
vázána na vhodný povrch (mikrotitrační
destička).
Za přítomnosti antigenu (specifické bakterie)
vzniká komplex AgAb.
Ten je možné detekovat buď přímo
spektrofotometricky nebo vizualizovat
konjugátem.

65. Imunologické metody
Výhody - automatizace
- rychlost
- vyšetření velkých sérií
vzorků
Nevýhody – vyšší náklady na vyšetření
- skríningová metoda
Využití – detekce bakteriálních patogenů
- detekce bakteriálních toxinů

66. Imunomagnetická
separace
Princip
jsou-li v substrátu přítomny sledované bakterie, váží
se na super-para-magnetické částice obalené
specifickou protilátkou. Komplex
antigen - protilátka se odseparuje
pomocí magnetu a dále zpracuje.
Výhody
zkracuje dobu kultivace
zachycuje i subletálně poškozené buňky

67. Imunomagnetická separace

68. Polymerázová řetězová reakce
Princip
Princip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro
opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly
DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy
(primery), které nasedají na templátovou DNA na
začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý
s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA.
PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci jediné
buňky.
Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním tří
základních kroků - denaturace, hybridizace a
syntézy nových vláken

69. Polymerázová řetězová reakce
Vysvětlení základních pojmů
• templát – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro
syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používá
genomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml.
• DNA polymeráza – termostabilní enzym používaný
k syntéze nové DNA ve směru 5´-3´ podle sekvence
nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po
jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používá
pro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a
umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C. Enzym
zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut.
• dNTP - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a
thymin)

70. Polymerázová řetězová reakce
Vysvětlení základních pojmů
• primery – jsou oligonukleotidy (obvykle 20-25 bazí) ,
které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a které
vymezují úsek templátu, který bude amplifikován
• master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky
pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního
pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro
aktivitu polymerázy, směsi dNTP, polymerázy, specifických primerů a
vody.
• termocykler (teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém
za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce.
• marker – velikostní standard, používá se k odhadu
velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti
v agarózovém gelu

71. Turbidimetrie
Podstata
Bakterie v průběhu množení tvoří v tekutém vzorku
zákal. Metoda využívá měření změn intenzity zákalu
média v závislosti na čase.
Intenzita zákalu je závislá na počáteční koncentraci
mikroorganizmů.
Využití – k měření celkového počtu mikroorganizmů
(aerobních i anaerobních)

72. Průtoková cytometrie
Podstata
Metoda vyjadřuje kvantitativní fotometrické stanovení
fluorochromu navázaného na specifické bakterie.
Buněčná suspenze po obarvení prochází kapilárou přes
trysku, kde je laserem ozářena. Intenzita
excitovaného světla vyjadřuje kvantitu specifických
bakterií.
Využití – rychlá detekce technologicky významných a
patogenních bakterií. Výsledky nejsou porovnatelné
se standardními metodami (CFU)

73. Impedanční metoda
Metabolická činnost bakterií mění složení kultivačního
média, což vede ke změnám vodivosti.
Systém je složen ze dvou elektrod ponořených do
živného média. Ty jsou připojeny na zdroj střídavého
proudu a měříme jimi impedanci. Stoupající vodivost
vede k poklesu impedance.
Výhody - automatizace
Nevýhody – vyšší cena přístroje
- při smíšených kulturách nestandardní
výsledky
Využití – indikátorové skupiny mikroorganizmů

74. Metabolická aktivita
Bioluminiscence
ATP je zdrojem energie všech živých buněk. Podstata
metody spočívá v reakci ATP s enzymem
luciferázou vázanou na luciferin.
luciferin
Tři tvorbě luciferin-adenylátového komplexu se z ATP
uvolňuje pyrofosfát.
Za přítomnosti kyslíku dochází k uvolnění světla, jehož
intenzita je závislá na výchozím množství ATP.
Použití – rychlá detekce mikrobiální kontaminace v
potravinářských provozech (HACCP)

75. Enzymatická aktivita
Redukce barviv
Resazurinový test je založen na průkazu
bakteriálních reduktáz.
Ty redukují
resazurin rezorufin hydrorezorufin
met. modř leukoforma
Rychlost barevné změny je závislá na množství
mikroorganizmů.
Využití – rychlá detekce CPM v mléce nebo mase

76. Metody typizace
IDENTIFIKACE - zařazení neznámých kmenů (druh,
poddruh)
TYPIZACE - zařazení neznámých kmenů pod úroveň druhu
FINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho
druhu poddruhu nebo variety

77. Kategorie typizačních metod
- fenotypová charakteristika
BIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základě
biochemických vlastností (API,
Enterotest, Stafytest atd.)
REZISTENCE k antibiotikům - zkoumání citlivosti kultur k
antimikrobiálním látkám (disková difuzní
metoda, MIC)
SÉROTYPIZACE - nejstarší typizační technika,
sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H:K

78. Kategorie typizačních metod
- genotypová charakteristika
1. Generace - analýza plazmidové DNA
- restrikční analýza plazmidové DNA
2. Generace - restrikční analýza chromozomální DNA
- hybridizací s próbami
- ribotypizace
3. Generace - PFGE
- typizační metody na bázi PCR (RAPD, REP PCR)
4. Generace - DNA sekvenování

79. Restrikční analýza plazmidové DNA
RE - sekvenčně specifická nukleáza, která štěpí
dsDNA ve specifických sekvencích vytvářením
dvouřetězcových zlomů

80. Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)
Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu, technika
určená pro separaci molekul DNA o velikosti až 12Mb,
při níž dochází ke změně směru elektrického pole.
Molekuly DNA putují
pohybem cik-cak v závislosti
na pulzním čase a napětí

81. Pulzní gelová elektroforéza
(PFGE)
Rare cutting endonukleázy
-RE vzácně štěpící –
rozpoznávají a štěpí sekvence, které
se v genomové DNA vyskytují
zřídka a vytváří dlouhé restrikční
fragmenty (XbaI, SpeI,SmaI,NotI)

82. Randomly amplified polymorfic DNA
(polymerázová řetězová reakce náhodná - RAPD)
Metoda PCR detekující polymorfizmus DNA za použití
jediného krátkého oligonukleotidového primeru, který
se na cílovou DNA váže v náhodných místech.
Výsledkem je soubor amplikonů charakteristický pro
daný mikroorganizmus
Podle délky primerů rozlišujeme metody:
AP-PCR (Arbitrary primed PCR) 18-24 mer
RAPD 10 mer
DAF (DNA amplification fingerprinting) 5-8 mer