Diferenciación para todas las tinciones

1. PREPARACION DE LA MUESTRA
Y TINCIÓN

2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• Los microorganismos son transparentes, es difícil distinguirlos, es por
lo que se suelen teñir. Para observar una muestra al microscopio
óptico podemos recurrirá a:

3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

4. Fijación
Proceso usado para preservar el material, evitar autólisis y
eliminar microorganismos.
FÍSICOS
QUÍMICOS
DESECACIÓN
CALOR SECO
CALOR HÚMEDO
CONGELACIÓN
FIJADORES SIMPLES
FIJADORES COMPUESTOS

5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

6. Ejemplos de fijadores químicos
Fijadores simples:
Formol 10%, alcohol etílico absoluto o al 96%, alcohol metílico,
ácido ósmico 1-2%, dicromato de potasio 3-5%
Fijadores compuestos:
Solución de Bouin (ácido pícrico, formol, ácido acético)
Solución de Zenker (dicromato de potasio, cloruro de
mercurio y acido acético)
Solución de Helly (dicromato de potasio, cloruro de
mercurio y formol)

7. COLORANTES
• Colorantes ionizables
Ácidos:
Tienen grupos cargados negativamente (aniónicos)
Ejem. Eosina, fuscina ácida.
Se unen a estructuras celulares cargadas positivamente.
Básicos:
Tienen grupos cargados positivamente (catiónicos)
Ejem. azul de metileno, cristal violeta, safranina, verde
malaquita.
Se unen a ácidos nucleicos y a muchas proteínas

8. TINCIÓN
• Se usan colorantes que son sustancias
químicas que poseen dos características:

9. TINCIONES
TINCIÓN SIMPLE TINCIÓN DIFERENCIAL
Utilizado para observar el
tamaño y forma
Se utiliza un solo tinte:
Tinción directa: se tiñe a la
bacteria
Tinción negativa: Se tiñe el
fondo pero no a la bacteria
Se utiliza para separar y clasificar a los
microorganismos de acuerdo a sus
características.
Se utiliza para visualizar estructuras
como flagelos, cápsulas y esporas.
Debe usar un mínimo de tres tintes

11. TINCIÓN DIFERENCIAL

12. • La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza
sobre las bacterias para observarlas mejor bajo el
microscopio.
• Según la distribución del peptidoglicano (compuesto
formado por azúcares y aminoácidos) en la pared
celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra.
GRAM + (SE COLOREA AZUL-VIOLETA)
GRAM - (SE COLOREA ROSA)

13. Los mordientes, intensifican la tinción porque
aumentan la afinidad de la célula por el colorante.
En el caso de la coloración de Gram, se utiliza
SOLUCIÓN DE LUGOL.
“Mayor volumen de peptidoglicano, mayor y mejor
fijación del colorante (en el caso de tinción de gram es
el cristal violeta)”

16. Tinción de Gram
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Tinción del frotis
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las células se tiñen
de color azul-violeta.
Añadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las células siguen
de color azul-violeta.
Decolorar con alcohol
Las células Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las células G+
se ven azul-violeta.
Las G- rosas o rojas.
Gram +
Gram -

20. TINCIÓN DIFERENCIAL

21. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS ESPECÍFICAS
TINCIÓN NEGATIVA (CÁPSULAS)
• Tinción simple que revela la presencia de
cápsulas difusas alrededor de muchas
bacterias.
• La tinción se logra mediante una mezcla
del tinte (tinta china) y el cultivo de
bacteria.
• Las bacterias aparecen como cuerpos mas
claros en medio de un fondo oscuro.

23. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS ESPECÍFICAS
ESPORAS BACTERIANAS
(Schaeffer-Fulton)
• Tinte primario: verde malaquita.
Requiere de calor para la penetración de
este tinte.
• Agente decolorante: agua, remueve el
exceso de tinte, decolora las células
vegetativas.
• Colorante de contraste: Safranina. Tiñe
las células vegetativas.

24. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS ESPECÍFICAS

25. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS ESPECÍFICAS
FLAGELOS
• Para observarlos con el
microscopio óptico se debe
aumentar su grosor con
mordientes (ácido tánico y
alumbre de potasio) y fuscina
básica (método de Gray).
• La presencia y distribución de
flagelos ofrece una información
taxonómica importante.

26. NORMAS PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
OPTICO
1.Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la
platina completamente.
2.Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3.Comenzar la observación con el objetivo de menor aumento (ya está en
posición) hasta llegar al de 100aumentos (100x) si la preparaciones de
bacterias.
4.Para realizar el enfoque;
1.Acercar al máximo la lente del objetivo a a preparación, empleando
el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
2.Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino

27. 5. Pasar al siguiente objetivo.
Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible
volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el
paso 3.
El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es
fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión
si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

28. 6. Empleo del objetivo de inmersión:
Bajar totalmente la platina.
Subir totalmente el condensador
Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino
entre éste y el de 40x.
Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de
inmersión.
Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite..
Enfocar cuidadosamente con el micrométrico.
Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se
coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver.
En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina.
Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado.

29. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Dejar puesto el objetivo de menor aumento.
1. No tocar las lentes con las manos. Limpiarlas muy suavemente
con un papel de óptica
2. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está
utilizando el microscopio.
4. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el
aceite que queda en el objetivo.
5. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que
limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona(7:3) o xilol.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio.
7. Limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica.

30. OBSERVACIÓN CELULAR
Acaros en la alm ohada y la
cam a; m icroscópicos