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Bioquimica i 2

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Bioquimica i 2

  1. 1. . UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO División de Docencia Dirección de Planeación y Desarrollo Educativo MANUAL DE PRÁCTICAS Instituto: INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Licenciatura en: INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 1.- Nombre de la asignatura: BIOQUÍMICA I 2.Semestre: TERCERO 3.- Carga horaria semanal: 10 4.- Nombre de quienes elaboraron el manual: DRA. INTRODUCCIÓN ELIA NORA AQUINO BOLAÑOS 5.- Fecha de última actualización: 8 De DICIEMBRE DEL 2004 i
  2. 2. INDICE PRACTICA Pág. 1.- Nombre de la asignatura:......................................................................................................................................i pH DE SOLUCIONES DE ACIDOS Y BASES FUERTES....................................................................................1 Introducción...............................................................................................................................................................1 PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA.............................................................................4 Introducción...............................................................................................................................................................4 REACCIONES DE CARBOHIDRATOS................................................................................................................7 Introducción...............................................................................................................................................................7 PROPIEDADES DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS.........................................................................................15 Introducción.............................................................................................................................................................15 Cuestionario.............................................................................................................................................................18 REACCIONES DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS.........................................................................................19 Introducción.............................................................................................................................................................19 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS......................................................................................................................24 CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE LIPIDOS.....................................................................................28 Introducción.............................................................................................................................................................28 Objetivo...................................................................................................................................................................29 ESTABILIDAD DE ACEITES...............................................................................................................................32 Introducción.............................................................................................................................................................32 ii
  3. 3. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRACTICA # 1 pH DE SOLUCIONES DE ACIDOS Y BASES FUERTES Introducción Los ácidos y bases fuertes son aquellas soluciones que al ponerlas en contacto con al agua, se disocian en sus iones totalmente. Para el caso de los ácidos fuertes, se tiene la siguiente reacción: H++A- HA Por lo que: pH = log __ 1__ [ H +] Con respecto a las bases fuertes tenemos: B+ + OH- BOH Por lo que: pOH = log __ 1__ [ OH - ] pH = 14 – pOH Objetivos 1. Repasar los aspectos químicos de los ácidos y las bases 2. Preparar y evaluar un sistema amortiguador de pH (buffer) 1
  4. 4. Materiales y métodos 6 vasos precipitados de 200 ml 2 pipetas volumétricas 1 piceta 2 matraces aforados de 100 ml. 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 potenciómetro Reactivos Solución de HCl 0.1 M Solución de NaOH 0.1 M Metodología En un vaso precipitado de 200 ml colocar aproximadamente 100 ml de solución de HCl 0.1 M y medir su pH en el potenciómetro. Posteriormente, colocar 10 ml de solución 0.1 M de HCl, en un matraz aforado de 100 ml y diluir a la marca con agua destilada; colocar alrededor de 100 ml de la solución preparada en un vaso de precipitado de 200 ml y medir el pH. Repetir la operación anterior hasta la quinta dilución y medir el pH a las distintas disoluciones. Hacer de la misma manera con el NaOH 0.1M, para calcular el pH de distintas soluciones preparadas de base fuerte. Resultados Hacer dos cuadros de resultados del experimento, uno con las soluciones de ácido fuerte y otro con las soluciones de la base fuerte, que contenga ambos cuadros: número de dilución, concentración molar del ácido en las distintas diluciones, pH real y pH calculado. Graficar los resultados donde se encuentre el pH en función de la concentración molar del ácido clorhídrico y otra gráfica del pH en función de la concentración molar de NaOH Cuestionario 1. ¿Hubo diferencias entre el pH real y el calculado de las distintas soluciones? A qué se atribuyen dichas diferencias. 2. Encontrar la cantidad de gramos de HCl que se necesitan para preparar las siguientes cantidades. A)1000 ml de HCl 1M B)1000 ml de HCl 0.1M C)1000 ml de HCl 0.001M D)1000 ml de HCl 0.2M E)1000 ml de HCl 0.5M F)250 ml de HCl 1M G)300 ml de HCl 0.2M H)400 ml de HCl 0.5M I)650 ml de HCl 0.1M J)50 ml de HCl 1.2M 3. Encontrar la [ H + ] de las siguientes soluciones: 2
  5. 5. A)HCl 0.001M B)H2SO40.01M C)HCl 0.02M D) H2SO4 0.03M E)500 ml de HCl 0.5M 4. Encontrar el pH de las siguientes concentraciones de HCl A)1.33 *10-5 moles / litro B)1.58*10-2 moles / litro C)1.18*10-3 moles / litro D)6.9*10-4 moles / litro E)1.96*10-4 moles / litro F)1.3*10-1moles / litro G)0.1 moles /litro H)1 moles/litro I)0.2 moles/litro J)2 moles /litro 5. Cual sería la concentración de iones hidrogeno en los siguientes pH? A)8.3 B)7.2 C)6.8 D)5.9 E)5.0 F)4.7 G)3.0 H)2.5 I)1.0 J)0.5 BIBLIOGRAFIA 1. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 2. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y. 3. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioquímica. 3ª. Ed. La prensa Medica Mexicana. 4. Plummer, D. T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill Latinoamericana, 3
  6. 6. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRACTICA # 2 PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA Introducción La concentración de los iones hidrógeno en los diferentes medios es de particular importancia para todos los organismos vivos. Cambios pequeños en la concentración de iones hidrogeno en la sangre, pueden dar lugar a cambios considerables en la composición química de ésta, trayendo como consecuencia alteraciones en procesos fisiológicos tales como la respiración, y hasta el comportamiento. Variaciones mínimas en el pH pueden afectar la capacidad catalítica de las enzimas y por lo tanto el buen funcionamiento de los sistemas metabólicos. De aquí que el uso de soluciones amortiguadoras sea de gran importancia en el estudio de la actividad enzimática o de las reacciones involucradas en los procesos metabólicos. Una solución amortiguadora (tampón o buffer) puede definirse como una solución de un par conjugado ácido – base en tal proporción que resiste los cambios en pH cuando se le adicionan iones H+ o iones OH-. La capacidad amortiguadora de este tipo de soluciones es máxima cuando la concentración de la especie ácida es igual a la concentración de la especie básica. El pH de la solución en este punto se conoce como el pK del sistema. Cuando la solución amortiguadora está formada por un compuesto que presenta varias etapas de disociación, dicho compuesto tendrá un pK diferente para cada grupo disociable. Objetivos. 1. Conocer los principios en los que se basa la preparación y la acción de una solución amortiguadora. 2. Llevar acabo los cálculos necesarios para preparar una solución amortiguadora con ciertas características, y con estos datos preparar esta solución. 3. Verificar la estabilidad de la solución amortiguadora en cuanto al cambio del pH. 4
  7. 7. Materiales y métodos. 2 agitadores de vidrio 2 buretas de 50 ml 2 matraces aforados de 500 ml 1 pinzas para bureta 2 vasos de precipitados de 1 000 ml Soluciones Acido cítrico monohidratado 0.1 M (300 ml) Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) 0.2 M (250 ml) Amortiguador de referencia pH 4 y 7 NaOH 0.1 M (500 ml) HCl 0.1 M (500 ml) Equipo Potenciómetro Metodología 1. Preparación de una solución amortiguadora de ác. cítrico-fosfáto de sodio pH 4.5. 1.1 Realización de los cálculos. Llevar a cabo los cálculos necesarios para preparar las soluciones de: ácido cítrico 0.1 M, Na2HPO4 0.2 M, NaOH 0.1 M y HCl 0.1 M 1.2 Preparación de la solución amortiguadora mezclando 272.9 ml de ácido cítrico 0.1 M con 227.1 ml de Na2HPO4 0.2 M. Medir el pH de la solución en un potenciómetro que haya sido previamente calibrado. Reportar el resultado obtenido y las observaciones hechas. 2. Verificación de la estabilidad de la solución amortiguadora en cuanto al cambio en pH. 2.1 Elevación de pH de la solución amortiguadora A 50 ml de la solución amortiguadora preparada en 1.2, adicionar con una bureta diferentes volúmenes de la solución de NaOH 0.1 M. (en incrementos de 10 ml hasta 50 m l). Agitar perfectamente la solución y en seguida determinar el pH de la misma. Reportar los resultados obtenidos 2.1 Disminución del pH de la solución amortugiadora A 50 ml de la solución amortiguadora preparada en 1.2, adicionar con una bureta diferentes volúmenes de la solución de HCl 0.1 M. (en incrementos de 10 ml hasta 50 m l) Agitar perfectamente la solución y en seguida determinar el pH de la misma. Reportar los resultados obtenidos. 5
  8. 8. 2.2 Elevación del pH del agua. Medir 50 ml de H2O destilada mediante el uso de un matraz volumétrico. En seguida, medir el pH de la misma. Adicionar al agua 20 ml de solución de NaOH 0.1 M y agitar vigorosamente, para después medir el pH de la mezcla. 2.3 Disminución del pH del agua Medir 50 ml de H2O destilada mediante el uso de un matraz volumétrico. Adicionar al agua 20 ml de solución de HCl 0.1 M y agitar vigorosamente, para después medir el pH de la mezcla. Comparar el resultado obtenido en esta prueba, con el que se obtuvo con la solución amortiguadora reportar los resultados obtenidos. Realizar una gráfica con los valores de titulación del amortiguador. Cuestionario 1. Porque el ácido acético se considera un ácido débil y al ácido clorhídrico se le considera un ácido fuerte 2. Calcular el pH de una mezcla ácido acético 0.1 M y de acetato de sodio 0.2 M. El pka del ácido acético es de 4.76 3. En función a que se selecciona una sustancia reguladora en los procesos bioquímicas. Bibliografía 1. Conn E. Stumpf P. K. 1976. Outlines of Biochemistry Cap.1 Wiley internacional (Edición en Español. Ed. Limusa 1976 bioquímica fundamental). 2. Suttie J. W. 1976. Fundamentos de Bioquímica Cap.1 Nueva Ed. Interamericana. 3. Calbiochem, 1975 ( D.E.Gueffroy, editor) A guide for the preparation and use of buffers in biological systems. Calbioche, Cal. 4. Williams B. L..Wilson K. 1975. Principales and techniques of practical Biochemistry Cap.1 Arnold publishers. 5. Cowgill W. Pardee B. 1964. Técnicas de investigación bioquímica. Ed. Alhambra. 6
  9. 9. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRACTICA # 3 REACCIONES DE CARBOHIDRATOS Introducción Los carbohidratos se definen como polihiroxialdehídos, polihidroxicetonas o aquellos compuestos que por hidrólisis los producen. Los carbohidratos se clasifican, con base en su estructura química, por el número de unidades en: monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos, la unidad de carbohidrato, puede ser aldosas (polihidroxialdehídos) o cetosas (polihidroxicetonas) y éstas a su vez se clasifican con base al número de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y tetrulosas, pentosas y pentulosas, hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, etc. Para finalmente reclasificarse cada una de ellas por el número de sus centros quirales. Los oligosacáridos están constituidos de 2-6 monosacáridos unidos a través del enlace glicosídico que puede ser hidrolizado por enzimas o por ácidos en ciertas condiciones. Los polisacáridos son carbohidratos que contienen un gran número de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos; son hidrocoloides, no forman verdaderas soluciones, no tienen color ni sabor y su peso molecular puede llegar hasta varios millones. Los polisacáridos son polímeros lineales o ramificados constituidos por un solo tipo de monosacáridos (homopolisacáridos) o por diferentes monosacáridos (heteropolisacáridos). Objetivo El alumno analizará las propiedades características de los carbohidratos, derivadas de su estructura, realizando algunas reacciones generales de identificación. 7
  10. 10. Materiales y métodos Tubos de ensayo Pipetas Gradilla Baño maría a ebullición Vaso de precipitados de 100 ml Cerillos Marcador Masking tape Glucosa Sólida y al 2% Arabinosa al 2% Maltosa al 2% Sacarosa sólida y al 2% Fructosa al 2% Glucógeno sólido y al 0.2% Almidón sólido y al 2% Dextrina sólida y al 2% Amilosa al 0.2% a-naftol Etanol al 96% Acido sulfúrico concentrado Fluorogucinol HCI concentrado y diluido 1:3 Resorcinol Sulfato de cobre Hidróxido de potasio Tartrato de sodio Yodo metálico Yoduro de potasio Acción de los ácidos y reacciones de caracterización de carbohidratos Los ácidos fuertes inorgánicos calientes deshidratan a las hexosas formando derivados furánicos como el hidroximetil furfural, que puede posteriormente descomponerse y formar otros compuestos como el ácido levulínico y el ácido fórmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas reacciones son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para caracterizar a los carbohidratos, ya que el producto deshidratado del carbohidrato se condensa con el reactivo correspondiente produciendo compuestos coloridos característicos. a- REACCION DE MOLISH-UDRANSKY FUNDAMENTO La prueba de Molish está basada en la formación de furfural o derivados de éste a partir de los carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un producto violeta. 8
  11. 11. Es una reacción muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y sacarosa al 0.0001% dan positiva la prueba. Esta prueba también es positiva para aldehídos, cetonas y algunos ácidos como fórmico, oxálico, láctico y cítrico. METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar (marcadas con asteriscos en la tabla correspondiente) b) Agregar 2 gotas del reactivo de Molish y Mezclar. c) Dejar resbalar por la pared del tubo 1 ml de H 2SO4 concentrado. d) Un anillo color violeta en la interfase es una prueba positiva. b- REACCION DE TOLLENS. FUNDAMENTO. La prueba de Tollens es una reacción característica para pentosas y está basada en la formación de furfural a partir de pentosas y su posterior condensación con el floroglucinol dando un color rojo cereza. METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 0.5 ml de las soluciones a probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). b) Agregar 1 ml del reactivo de Tollens y mezclar. c) Calentar en baño María a ebullición por 3-4 minutos. d) Un color rojo cereza es una prueba positiva. c- REACCION DE SELIWANOFF. FUNDAMENTO. La prueba de Seliwanoff es una reacción para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan la reacción, las cetosas la dan rápidamente y las aldosas lentamente. 9
  12. 12. Está basada en la formación de durfural o en un derivado de éste y su posterior condensación con el resorcinol dando un color rojo fuego para cetosas y rosa para aldosas. METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar marcadas con asterisco en la tabla correspondiente. b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Seliwanoff y mezclar. c) Calentar en baño maría a ebullición. d) Tomar lecturas de la coloración a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos. e) Un color rojo fuego es una prueba positiva para cetosas y un color rosa es una prueba positiva para aldosas. ACCION DE LOS ALCALIS Y PODER REDUCTOR DE LOS CARBOHIDRATOS. Los álcalis pueden inducir varias reacciones químicas en los monosacáridos que dependen de la intensidad del tratamiento y de la concentración del álcali utilizado. A bajas concentraciones (0.5 N) se favorece la isomerización y el equilibrio cetoenólico (aldosas cetosas). En condiciones más severas (0.5 N), la isomerización se produce fuertemente y los enoles intermediarios se rompen produciendo compuestos como: formaldehído, aldehído glicólico, gliceraldehído, acetona, láctico, propiónico, purúvico etc. En condiciones fuertemente alcalinas se generan ácidos sacáricos. Una reacción característica de los carbohidratos está basada en el poder reductor que le confiere su grupo aldehído o cetona. a- REACCION DE FEHLING. FUNDAMENTO. La reacción de Fehling está basada en la acción reductora que tienen los azúcares sobre los iones cúpricos en medio alcalino, como se representa a continuación: Carbohidrato + Cu2 + álcali_ Carbohidrato oxidado + Cu+ El reactivo de Fehling está constituido por dos soluciones que se mezclan al momento de usarse (Solución A de sulfato de cobre y solución B de tartrato de sodio-potasio en medio alcalino). 10
  13. 13. El poder reductor de los oligo y polisacáridos depende, del número de carbonilos potencialmente libres que no estén involucrados en enlaces glicosídicos. METODOLOGIA. a) Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de agua destilada. b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Fehling A y 0.5 ml del reactivo de Fehling B y mezclar. c) Calentar en baño maría durante 5 minutos. d) No debe producirse un precipitado rojo ladrillo. PREPARACION DE LOS PROBLEMAS. a) Colocar en el tubo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Fehling A y 0.5 ml del reactivo de Fehling B y mezclar. c) Calentar en baño maría a ebullición durante 5 minutos. d) Un precipitado rojo ladrillo es una prueba positiva. SOLUBILIDAD Y SABOR DE LOS CARBOHIDRATOS. METODOLOGIA a) Colocar en 5 tubos de ensayo de 3 ml de agua destilada. b) Agregar en el tubo correspondiente aproximadamente 50 mg de los carbohidratos a probar (marcados con asterisco en la tabla correspondiente). c) Mezclar y anotar el grado de solubilidad. d) Calentar en baño maría durante 2 minutos. e) Anotar el grado de solubilidad. f) Tomar, con ayuda de un agitador, unas gotas de las 5 soluciones y percibir su sabor. g) Hacer las anotaciones correspondientes. REACCION DEL YODO. FUNDAMENTO. El yodo es atrapado por los polisacáridos y dependiendo de la estructura de éstos da una coloración característica; si el polisacárido es lineal se obtendrá una coloración azul pero si es ramificado la coloración obtenida va del púrpura al rojo. METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a 11
  14. 14. b) c) d) e) Probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). Agregar una gota de lugol y mezclar. Anotar el color producido. Calentar en baño maría. Anotar la observación. Resultados MOLISH TOLLENS SELIWANOFF FEHLING SOLUBILIDAD YODO BLANCO (AGUA) Glucosa Arabinosa Maltosa Sacarosa Fructuosa Glucógeno Almidón Dextrina Amilosa PREPARACION DE REACTIVOS. 1) Glucosa al 2%.- Pesar 2 g de glucosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 2) Arabinosa al 2%.- Pesar 2 g de arabinosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 3) Maltosa al 2%.- Pesar 2 g de maltosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 4) Sacarosa al 2%.- Pesar 2 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 5) Fructosa al 2%.- Pesar 2 g de fructosa en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 12
  15. 15. 6) Solución de glucógeno al 0.2%.- Pesar 200 mg de glucógeno y disolver en 100 ml de agua caliente, al agua caliente agregar poco a poco el glucógeno. Refrigerar. 7) Solución de almidón al 2%.- Pesar 2 g de almidón comercial y disolver en 100 ml de agua caliente, al agua caliente agregar poco a poco el almidón. Refrigerar. 8) Dextrina al 2%.- pesar 2 g de dextrina y llevar a 100 ml con agua destilada (para disolver, alcalinizar en caliente y neutralizar posteriormente), refrigerar. 9) Amilosa al 2%.- Pesar 200 mg de amilosa y disolver en 100 ml de agua destilada caliente. Refrigerar. 10)Reactivo de Molish.- pesar 5 g de alfa-naftol y disolver en 100 ml de alcohol a 96°. 11)Floroglucinol al 2%.- Pesar 2 g de floroglucinol y disolver en 100 ml de agua caliente. 12)Reactivo de Tollens.- Mezclar 10 ml de HC1 concentrado con 2 ml de floroglucinol al 2% y llevar con agua destilada hasta 18 ml. 13)Reactivo de Fehling: Solución A.- Pesar 34.65 g de sulfato de cobre y disolver 300 ml de agua destilada, llevar a 500 ml con agua y conservar en frasco con tapón de hule. Solución B.- Pesar 125 g de KOH y 173 g de tartrato de sodio y potasio, y llevar con agua destilada a 500 ml, conservar en frasco revestido de parafina y con tapón de hule. 14) Reactivo de Seliwanoff.- Pesar 0.05 g de resorcinol y disolver en 100 ml de HC1 diluido 1:3. 15) Lugol.- Pesar 1 g de yodo metálico, 2.0 g de KI (dos partes de KI por una de yodo), mezclar en un mortero y agregar agua destilada poco a poco hasta la disolución total. Llevar a 300 ml con agua destilada y conservar en un frasco ámbar. Cuestionario 1. Explique porque la reacción de Fehling es positiva con la glucosa y negativa con la sacarosa. 2. Cual es la diferencia estructural del glicógeno y de la glucosa 3. A que se le llama inversión de la sacarosa Bibliografía 5. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 6. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y. 13
  16. 16. 7. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioquímica. 3ª. Ed. La prensa Medica Mexicana. 8. Plummer, D. T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill Latinoamericana, 14
  17. 17. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRACTICA # 4 PROPIEDADES DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS Introducción Las sustancias pécticas son heteropolímeros de carbohidratos cuya unidad principal es el ácido galactopiranosilurónico unido por enlaces glucosídicos 1-4. Alguno grupos carboxilo del ácido galactopiranosilurónico pueden estar esterificados con grupos metilo formado por metil- galactopiranosilurónico, algunas de las unidades pueden estar acetiladas con c-o-c en ambos, en la cadena existe la inserción de unidades de ramnopiranosa además laterales de una unidad cilopiranosa: cadenas laterales altamente ramificadas que contienen unidades de L-arabinofuranosa y cadenas laterales que contienen unidades de L-galactopiranosa. Las sustancias pécticas son por lo tanto sustancias muy complejas y la terminología más adecuada para referirse a sus varias formas es la siguiente: Protopectina. Es el término usado para describir el precursor insoluble de la pectina que se encuentra de manera abundante en los tejidos inmaduros de los frutos, junto con celulosa, hemicelulosa y lignina, forma parte de la estructura celular. Se considera que la protopectina es el material de cementación para las otras sustancias. La protopectina durante la maduración o la hidrólisis ácida, produce primero ácidos pectínicos y luego ácidos pécticos. Acidos pécticos. Son ácidos poligalactopiranosilurónicos coloidales de los cuales los grupos carboxilo se encuentran sin esterificación alguna. Las sales de estos ácidos son pectatos. Ácidos pectínicos. Son ácidos poligalactopiranosilurónico de naturaleza coloidal parcialmente esterificados con grupos metilo y son las llamadas pectinas. La nomenclatura de las pectinas esta gobernada por el grado de esterificación con grupos metilo. La fuerza del gel es obtenida con la pectina con sucrosa o dextrosa hasta obtener la fuerza natural del gel deseado. El tiempo o temperatura de gelación se obtiene mezclando lotes de pectinas con diferentes tiempos o temperaturas de gelación que se originan de las variaciones en las propiedades de la materia prima. 15
  18. 18. Objetivos Determinar el contenido de pectina de una fruta Observar algunas propiedades de las pectinas Materiales y métodos Cuchillo Tabla Pela papas 3 vasos de precipitados de 150 ml 1 mechero 1 arillo 1 tela de asbesto 1 tela de algodón Papal filtro Buchner 8 tapones para los tubos 8 tubos de ensaye de 20 ml 4 pipetas de 5 ml 9 vasos de 50 ml termómetro agitador de vidrio 1 vasos de precipitados de 800 ml 2 vasos de precipitados de 600 ml Matraz kitazato Reactivos Equipo Etanol al 95% Buffer acetato pH 2.2, 2.6, 3.0, 3.2 y 3.4 Cloruro de calcio al 2% Pectina de bajo y alto metoxilo Azúcar Balanza granataria Balanza analítica Resistencia METODOLOGÍA 1. Estimación de contenido de pectina de una fruta Dividir 50 gramos de manzana. Colóquelas en un vaso de precipitados: Adicione 50 ml de agua y hierva hasta obtener una pulpa. Este calentamiento no debe ser prolongado. Filtre la pulpa a través de un lienzo (o centrifugue). Precipite la pectina en el filtrado adicionándole poco a poco etanol al 95% quitando bien hasta que ya no haya precipitación. Seque y pese los sólidos formados. Calcule el peso de la pectina extraída en por ciento sobre el peso de la materia prima original 2. Observación de las propiedades de las pectinas 2.1 Determinación de la temperatura de gelificación de dos pectinas con diferentes contenidos de metilación: 16
  19. 19. Formulación estándar (65% s.s., pH 3.2) 0.72 g de pectina 120 g de azúcar 60 ml de agua 10 ml de buffer pH 3.2 Pese un vaso de precipitados de 600 ml. Añada la pectina y 30 g de azúcar. Mezcle todo muy bien (si no lo hace se formarán grumos). Adicione 60 ml de agua hirviendo y agite. Inmediatamente añada los 10 ml de buffer y el resto del azúcar. Ebulla el contenido hasta obtener un 65 % de s.s. Cheque con el refractómetro o pesando. Use la siguiente formula PA X = ------------PCM Donde PA = Peso del azúcar PCM = Peso del contenido del matraz X = porcentaje de sólidos solubles Cuando se alcance el contenido de sólidos, vacíelos rápidamente en varios tubos de 19 ml en un baño de agua hirviendo (vaso de 800 ml). Remueva la fuente de calor y cierre los tubos. Deje que el agua del vaso se enfríe bajo condiciones naturales. Cada determinado tiempo remueva un tubo, y lea la temperatura del agua. Invierta el tubo y nótese si la gelación ha empezado en el fondo del tubo. Anote la temperatura a la cual empieza la coagulación. Repita el experimento con la otra pectina. 2.2 Efecto el pH en la formación de geles Prepare la formulación estándar dada en el punto 2.1, pero sustituya los 10 ml de buffer por 10 ml de agua y pare la ebullición. Cuando alcance el 71 % de s.s., añada 20 ml de solución a cada uno de los siguientes vasos y mézclelos. Numere 5 vasos de precipitados de 100 ml y añada de acuerdo a lo siguiente 1. 2 ml de agua 2. 2 ml de buffer de pH 2.2 3. 3 ml de buffer pH 2.6 4. 3 ml de buffer pH 3.0 5. 2 ml de buffer de pH 3.4. 17
  20. 20. Déjelos reposar y observe al final del periodo de laboratorio del estado físico (ejemplo líquido, gel débil, gel fuerte). Almacene sus vasos y repita las observaciones la semana siguiente. 2.2 Formación de geles con pectinas de bajo metoxilo. En un vaso de precipitado tarado ponga 30g de azúcar, y 1g de pectina de bajo metoxilo, mézclelo bien. Añada 70ml de agua caliente y 5ml de buffer 3.0. Ebulla hasta disolver bien el contenido, agregue 10ml de solución de cloruro de calcio al 2% (CaCl2) y ebulla hasta tener PCM (peso neto) de 100g, vacíe el contenido en 4 vasos de precipitado pequeños y déjelos reposar hasta el siguiente periodo de laboratorio, y entonces obsérvelos Cuestionario 1. ¿Por qué los tomates antes de enlatarlos (como tomates enteros) se sumergen en una solución de cloruro de calcio? 2. ¿Qué tipo de pectina usarías para fabricar un postre en forma de gel a partir de leche y jugo de frutas? 3. Menciona las tres fuentes principales para extraer pectinas Bibliografía Glickman, M., 1969. Gum Tecnology in the Food Industry, 1 Academic Pess, New York Wight, 1971, Polysaccharyde Conformation, Part VII: Model Building computation : for 1-4 Galacturonan and the kicking function of L-rhamnose Residues in Pectic Substances, j. Chem. Soc. (8): 1366 18
  21. 21. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRÁCTICA No. 5 REACCIONES DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS Introducción Las proteínas son polímeros de alto peso molecular, compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos, que cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales. Presentan propiedades químicas y físicas que dependen directamente de factores extrínsecos, como puede sel el pH, la temperatura, la presencia de sales, etc. Existen varios métodos para la identificación y cuantificación de las proteínas, pero la mayoría tiene como principio alguna reacción química característica de los grupos R de los diferentes aminoácidos. Puede decirse que las proteínas reflejan las propiedades químicas de los residuos de aminoácidos que contienen, por lo que la mayoría de las reacciones coloridas de identificación dependen de la existencia de un aminoácido específico en ellas. Objetivos • • El alumno realizará algunas reacciones coloridas específicas para la identificación de los aminoácidos que constituyen a una proteína. El alumno comprenderá la importancia de estas reacciones para distinguir las proteínas. Materiales Y Métodos. Acido oxálico (sol. Saturada) Acido acético glacial Reactivo de biuret Gelatina al 5% Peptona al 5% Albúmina al 5% Tirosina al 1% Triptofano al 1% Fenilalanina al 1% Cisteína al 1% Arginina al 1% Hidróxido de sodio al 10% Acetato de plomo al 5% Ninhidrina al 1% en butanol saturado con regulador de fosfatos 0.06M, pH 7.4. Acido nítrico concentrado. Hidróxido de amonio concentrado Oxido rojo de mercurio Nitrito de sodio Magnesio en polvo o granallas 19
  22. 22. Gradilla Tubos de ensayo Pipetas de 1,5 y 10 ml Vaso de precipitados de 100 ml Baño maría Agitador de vidrio Pinzas para tubo REACCION DEL PLOMO PARA CISTEINA.- Es una reacción característica para grupos sulfhidrilos. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema 2 ml de NaOH al 10% y calentar ligeramente. Adicionar de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5% y calentar nuevamente hasta ver la aparición de un precipitado negro. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE LA NINHIDRINA.- Es una reacción característica para grupos amino libres. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 5 gotas de la solución de Ninhidrina en butanol. Observar a temperatura ambiente la aparición de un color azul o violeta que se debe a la presencia de los grupos amino libres; si es necesario, calentar en baño maría 1 ó 2 minutos los tubos en los que no aparece el color. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE HOPKINS-COLE.- Esta reacción es característica del anillo indol y por lo tanto del triptófano, por ser éste el único aminoácido que contiene este grupo. El reactivo contiene ácido glioxílico que se prepara por reducción del ácido oxálico con magnesio en polvo o amalgama de sodio. Numerosos aldehídos pueden dar una reacción similar con triptófano. La naturaleza del compuesto colorido formado no se conoce totalmente. Los cloratos, nitritos y cloruros interfieren en la reacción. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problemas, 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole y mezclar bien. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de ácido sulfúrico concentrado, procurando que se forme un límite bien definido entre ambos líquidos. La aparición de un anillo violeta-rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia del triptófano. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. 20
  23. 23. REACCION DE MILLON.- El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercúricos en ácido nítrico concentrado. Debido a la presencia del grupo fenólico se produce un compuesto de color rojo. METODOLOGIA. A) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema de 2 a 5 gotas del reactivo de Millon y calentar en baño maría. La aparición de un color rojo será una prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. REACCION XANTOPROTEICA.- Esta reacción es positiva tanto para aminoácidos aromáticos activados como proteínas en solución, aunque es mucho más sensible cuando éstas se encuentran perfectamente secas. Esta reacción depende de la nitración de los anillos bencénicos activados produciendo un color amarillo. La prueba resulta negativa para proteínas que no contengan aminoácidos aromáticos activados. Ciertos derivados del benceno, como el ácido pícrico, reaccionan formando los nitro derivados amarillos. METOLODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 1 ml de ácido nítrico concentrado, calentar la mezcla y enfriar. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de hidróxido de amonio concentrado. La parición de un color amarillo o naranja en la interfase será prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados obtenidos. REACCION DEL BIURET.- Esta es una prueba general para proteínas y péptidos de cadena no menor de 3 unidades de aminoácidos. Una utilidad de esta reacción es seguir el proceso de una hidrólisis proteínica, ya que la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa. METODOLOGIA. a) Adicionar 1 ml de la solución problema 2 ml de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas del reactivo de biuret (solución de CuSO 4 al 0.5%), mezclar bien. La formación de un color violáceo o la precipitación de hidróxido cúprico será una prueba positiva. Si el color de la reacción del biuret no se presenta inmediatamente, deja reposar de 10 a 15 minutos. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. Reacción para Reacción grupos SH de Reacción Ninhidrina HopkinsCole Reacción Reacción de de Millón la de Reacción de Hantoproteica Gelatina Peptona 21 biuret
  24. 24. Albúmina Aspartame Tirosina Triptofano Fenilalanina Cisteína Arginia Agua Interpretación. PREPARACION DE REACTIVOS. 1. Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara añadiendo 60 g de óxido de Mercurio a una mezcla de 45 ml de HNO 3 concentrado y 50 ml de H 2O. Cuando el óxido de mercurio se ha disuelto, se añade 50 ml de una solución de nitrito de sodio al 30%. El reactivo de millon contiene nitritos y nitratos mercúricos. 2. Reactivo de Hopkins-Cole.- Se prepara añadiendo 10 g de magnesio en Polvo en 20 ml de agua destilada. Agregar lentamente 250 ml de una solución fría y saturada de ácido oxálico. La reacción se produce con gran rapidez, desprendiendo tanto calor que se debe enfriar el matraz en la corriente de agua mientras se añade el ácido. Cuando se ha terminado de añadir el ácido. Agitar el contenido y verterlo sobre un papel filtro para separar el oxalato de magnesio insoluble. Se vierte un poco de agua sobre el filtro, se acidifica de magnesio al quedar largo tiempo en reposo, y se lleva a un litro de agua destilada en un matraz aforado. Esta solución contiene únicamente la sal magnésica de ácido glioxílico. 3. Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 ml con Agua destilada. 4. Soluciones de aminoácidos al 0.5%.- Pesar 0.5 del aminoácido a preparar y Llevar a 100 ml con agua destilada. Si no se disuelve fácilmente, adicionar algunas gotas de solución de NaOH o HCI para mejorar su solubilidad. Calentar un poco si es necesario. 5. Ninhidrina al 1% en butanol saturada con regulador de fosfatos 0.0006 M, PH 7.4.- Pesar 5 g de Ninhidrina y llevar a 500 ml con butanol. Mezclar 500 ml de regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4 con los 500 ml de Ninhidrina al 1% en butanol, agitar en embudo de separación, eliminar la fase interior (acuosa) y usar la fase superior orgánica. 6. Regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4.- Pesar 2.136 g de Na 2 HPO4*12H2O y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Pesar 0.816 g de 0.816 g de KH2PO4 y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Mezclar en proporciones 8:2 de Na2HPO4 y KH2PO4 respectivamente; ajustar el pH si es necesario. 7. Reactivo de biuret.- pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 ml con Agua destilada. 22
  25. 25. Cuestionario 1. ¿Cuales son los aminoácidos esenciales y con que pruebas específicas se podrían identificar? 2. ¿A que se le denomina zwitterion? 3. Bibliografía 1. Clark, J: M: “Bioquímica Experimental”, Ed. Acribia, España, (1966). 2. Daniels, J.L. y A. L. Neal, “Laboratory Experiments in Biochemistry”, Academic Prees. Inc. , N.Y., pp. 129-141, (1967). 3. Dotty, L.B. y M.J. Morten, “Laboratory Instruments in Biochemistry”, Mosby Co., pp 29-31 (1971). 4. Johnston, B.R., “Laboratory Manual of Biochemistry”, Burges Publishing Co., Minnesota, pp. 1-13, 41-54, (1958). 5. Legget, B.J., “Techniques in Protein Chemistry”, Elsevier Publishing Co., pp. 349351, (1967). 6. Litwack, G., “Bioquímica Experimental”, Ed. Omega, S:A:, Barcelona, pp. 169180, (1967). 7. Maraculla, J.M. y F.M. Goñi, “Biomoléculas”, Ed. Reverté, pp 79-91, 107-113, (1978). 23
  26. 26. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRÁCTICA No.6 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS Introducción Para entender la precipitación de las proteínas de debe tomar en cuenta que la proteína es una molécula cargada positiva y negativamente de tal manera que las moléculas reaccionan entre sí, sea con iones pequeños de cargas opuestas o con el agua. Se pueden señalar tres tipos de interacciones: 1. proteína- proteína 2. proteína-agua 3. proteína-iones pequeños Si la interacción 1 es grande y la 2 pequeña, la proteína tenderá a ser insoluble. Si sucede lo contrario, entonces la proteína será insoluble. Existen cinco formas de precipitar proteínas: 1. Precipitación por salación (salting-out) Si se disminuye la precipitación efectiva del agua en una solución proteica añadiendo una sal muy soluble, aumenta la interacción proteína-proteína produciéndose un precipitado de proteína. Este procedimiento se ha llamado en inglés "salting-out" o en español "salado". Las sales más empleadas para este efecto son las de sulfato de amonio y sulfato de sodio. 2. Precipitación por solventes orgánicos Al añadir solventes orgánicos como etanol o acetona a una solución acuosa de proteínas, se baja la constante dieléctrica del agua disminuyendo efectivamente la interacción proteína-agua, y aumentando la interacción proteína-proteína favoreciendo así la precipitación. Si esto sucede a más de cero grados centrígrados, las proteínas se desnaturalizan; de ahí que este tipo de precipitación cuando se usa con proteínas enzimáticas se tenga que hacer a menos de cero grados centígrados. En éste tipo de precipitación se debe tomar en cuenta factores como pH, electrolitos, presencia de metales pesados, etc., pues tiene efecto en la precipitación. 3. Precipitación por formación de sales Las sales de metales pesados precipitan las proteínas porque el ion del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aniónica de la proteína. La 24
  27. 27. proteína en el lado alcalino de su punto isoeléctrico existe como ión negativo y así al combinarse con el ión del metal o catión, formará proteínatos de por ejemplo proteinato de mercurio, proteinato de plomo, proteinato de plata, etc. En cambio los reactivos alcaloidales precipitan las proteínas al combinarse el radical acídico del reactivo alcaloidal con la forma catiónica de la proteína que predomina en él lado ácido del punto isoeléctrico. Se forma entonces precipitados que podríamos llamar por ejemplo tanato de proteína, fosfomolibdato de proteína, etc. 4. Precipitación isoeléctrica Una manera muy sencilla de precipitar las proteínas es simplemente ajustar el pH de la solución a su punto isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado reversible que se disolverá tanto del lado alcalino como del lado ácido del punto isoeléctrico. 5. Precipitación por calor La mayoría de las proteínas globulares incrementan su solubilidad al aumentar la temperatura, dentro de un rango de 0 a 40ºC. A temperaturas mayores de 40 a 50ºC, la mayoría de las proteínas son inestables y se empieza a desnaturalizar. Con este fenómeno hay una pérdida de solubilidad en la zona de pH neutro, pudiéndose precipitar la proteína. Objetivo 1. Estudiar diversos procedimientos de precipitación de proteínas 2. Obtención de proteínas aplicando diversos métodos de precipitación Materiales Y Métodos 1. MUESTRAS Clara de huevo Clara de huevo diluida en agua (1:5) 2. MATERIALES 11 Tubos de ensaye 2 Pipetas de 5 ml 5 Pipetas de 1 ml 1 Gradilla 2 Vasos de precipitados de 400 ml 1 Bureta 1 Pinza para bureta 1 Agitador magnético 1 Termómetro 1 Buchner 1 matraz kitasato 3 Bases para caja petri 1 Espátula REACTIVOS Y EQUIPO Solución de etanol al 90% Solución de nitrato de plata al 5% Solución de cloruro de mercurio al 5% Solución de ácido cítrico al 5% HCl concentrado Solución saturada de sulfato de amonio Solución de cloruro de sodio al 1% Reactivo de biuret Buffer pH 7 Estufa de vacio a 50°C Potenciometro 25
  28. 28. 1 Probeta de 100 ml Papel filtro whatman # 4 1 Vaso de 4 1 Bolsa de diálisis Tela de algodón METODOLOGÍA 1. Agentes desnaturalizantes de proteínas 1.1 Calor Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensaye y calentar en baño de agua en ebullición durante 5 minutos. Enseguida enfriar y comparar el aspecto de la clara que fue calentada con el de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.2 Alcohol Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensaye. Transferir el tubo a un baño de hielo y dejarlo reposar durante 5 minutos. En seguida adicionar 5 ml de alcohol al 96%. Comparar con él aspecto de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.3 Metales pesados Colocar 1 ml de clara de huevo diluida en cada uno de dos tubos de ensaye. Adicionar a uno de ellos 5 gotas de nitrato de plata al 5% y al otro 5 gotas de cloruro de mercurio al 5%. Comparar el aspecto de la clara tratada con metales pesados con el de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.4 Ácidos orgánicos fuertes Colocar 1 ml de clara de huevo diluida en un tubo de ensaye y agregar 15 gotas de solución diluida de ácido pícrico al 5%. Comparar el aspecto de la clara tratada con ácido pícrico con la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 2. Precipitación de proteínas 2.1 Por ácido y calor Verter 200 ml de leche descremada en un vaso de precipitados de 400 ml. Adicionar lentamente ácido clorhídrico concentrado hasta alcanzar un pH de 4.5, agitando la mezcla leve, pero continuamente durante toda la adición. Una vez alcanzado él pH, observar la apariencia de la leche. Posteriormente calentar la mezcla a 55ºC durante 10 minutos, y enseguida filtrar a través de una tela de algodón perfectamente limpia. Guardar él precipitado, y él filtrado obtenido filtrarlo nuevamente a través de papel filtro whatman # 4 usando vacío. Juntar los precipitados obtenidos y extenderlos en tantas cajas petri como sea necesario para después secar la proteína en la estufa de vacío a 50ºC. Una vez que el secado haya concluido, pesar la cantidad de proteína obtenida y determinar el rendimiento. Reportar los resultados obtenidos y las observaciones hechas. 2.2 Por salting out 26
  29. 29. Romper dos huevos y separar la clara vaciándolo en un vaso de 400 ml. Agitar suavemente las claras para romper las membranas, evitando hasta donde sea posible la formación de espuma. Medir la cantidad de clara obtenida haciendo uso de una probeta y posteriormente transferirla a un vaso de precipitados de 400 ml. Adicionar una cantidad igual de solución saturada de sulfato de amonio, agitar suavemente y dejar reposar la mezcla durante 20 minutos. Transcurrido el periodo de reposo filtrar la mezcla a través de una tela de algodón perfectamente limpia. Posteriormente disolver él precipitado obtenido en 250 ml de una solución de NaCl al 1% para después transferir la solución a una bolsa de diálisis y dejar dializar durante un periodo de 10 a 24 horas en aproximadamente 3 litros de agua destilada. Transcurrido el periodo de diálisis, verter el contenido de la bolsa en un vaso de precipitados y tomar de ahí una muestra para efectuar la prueba de Biuret. Resultados Reportar las observaciones hechas y los resultados obtenidos. Cuestionario 1. Describa que es el punto isoeléctrico de una proteína y como se calcula. 2. Cuales estructuras de las proteínas se pierden durante su precipitación isoelectrica 3. Porque las proteínas forman precipitados en ciertas condiciones y geles en otras. Bibliografía 2. Clark, J: M: “Bioquímica Experimental”, Ed. Acribia, España, (1966). 3. Daniels, J.L. y A. L. Neal, “Laboratory Experiments in Biochemistry”, Academic Prees. Inc. , N.Y., pp. 129-141, (1967). 4. Dotty, L.B. y M.J. Morten, “Laboratory Instruments in Biochemistry”, Mosby Co., pp 29-31 (1971). 27
  30. 30. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRÁCTICA No. 7 CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE LIPIDOS Introducción Para diferenciar la gran cantidad de lípidos que pueden encontrarse en alimentos y productos biológicos, es necesario efectuar diversos análisis físico y químicos. En esta práctica se efectuarán algunos representativos, como son: 1. El índice de refracción, determinación sencilla y rápida que en trabajos de rutina permite identificar un compuesto o detectar adulteraciones, por comparación con el índice de refracción del aceite o ácido graso patrón, puro. 2. El índice de acidez, que se define como la cantidad de mg de KOH necesarios para neutralizar la acidez libre de 1g. De muestra Si se conoce la fórmula del ácido graso se puede calcular fácilmente el índice de acidez teórico correspondiente al ácido graso puro. Cuando se emplee NaOH en lugar de KOH para efectuar la titulación, debe convenirse el resultado a su equivalente en KOH. Trabajando con NaOH de normalidad N, la fórmula para calcular el índice de acidez será: a.= 40 N.V.56 = 56NV M.40 M 40 Es el peso molecular del NaOH. 56 Es el peso molecular de KOH. 56/40 Es el factor que permite convertir el peso de NaOH a peso de KOH. V Es el volumen en m1 de NaOH de normalidad N, requerido en la titulación (restando el volumen que se gaste en el blanco). M Es el peso de muestra en gramos. El índice de yodo sirve para determinar el grado de insaturación de un ácido graso o aceite, debido a que el yodo es absorbido únicamente en los dobles o triples enlaces. En este caso, se determinará únicamente en forma cualitativa, para saber si el compuesto tiene doble enlaces. El índice de yodo se define como la cantidad de yodo, expresada en gramos, que absorben 100g de muestra. 28
  31. 31. La formación de los complejos de ácidos grasos con urea, permite la obtención de compuestos cristalinos fácilmente aislables, cuyo punto de fusión y forma de cristalización ayudan a la identificación del ácido graso. Para la identificación del colesterol y otros esteroides, se han descrito varias reacciones sencillas como la de Salkowski y la de Liebermann- Burchard. El fundamento de estas reacciones es la formación de derivados de los esteroides, cuando se tratan con ácidos. El color y su intensidad varían según el esteroide, el tipo de ácido y la concentración de éste. Objetivo El objetivo de la práctica es conocer algunas propiedades físico químicas representativas de los lípidos, sobre todo de los que se encuentran en los alimentos y en los productos biológicos Materiales Y Métodos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Aceite de oliva y de maíz (20 m1). Acidos oleico, esteárico y palmíco ( 25 g de cada uno). Colesterol (1 gramo). Solución de lugol (ver prácticas anterior). Anhídrido acético ( 10 m1). Acido sulfúrico concentrado (10 m1). Solución de almidón ( ver práctica anterior) Disolución de urea en metanol: Pesar 3 g disolverlos en 20 m1 de metanol, calentando suavemente si es necesario. 9. Etanol neutralizado: A una muestra de 5 m1 de Etanol, agregue 5 gotas de indicador de fenolftaleina ( ver adelante) y neutralice con NaOH 0.1. N. Con el dato así obtenido, calcule cuánto debe agregar a 100 m1 de Etanol. Mida 100 ml. de Etanol y agréguele el. 10. .NaOH 0.1 N: Medio litro; si no se prepara con disolución comercial, titúlence con HCI valorado. 11. -Disolución indicadora de fenolftaleina al 1% en etanol al 75% 20m1. METODOLOGIA 1. Indice de refracción. Determine el I. R. De un aceite vegetal, en el refractómetro de Abbe, y anote los siguientes datos: Tipo de refractómetro empleado-------------------------------------Longitud de onda--------------temperatura------------I.R. obtenido--------------Aceite Empleado-------------------I.R. indicado en tablas----------------------29
  32. 32. 2. Índice de acidez. Pese exactamente una muestra entre 10 y 15 g de aceite de maíz, sobre un vaso de precipitados o un matraz previamente tarado. Agregue 50 m1 de Etanol neutralizado. Introduzca el matraz en un baño de agua mantenimiento a 60°C y titule, sin dejar de calentar, agregando 10 gotas de disolución de fenolftaleina y poniendo en la bureta NaOH 0.1 N el cual se agrega hasta obtener color rosa resistente. Aplicando la fórmula indicada en la Introducción, calcule el índice de acidez. 3. Formación de complejos de ácido grasos con urea. Disuelva 1 g de un ácido graso en 5 m1 de disolución de urea en metanol. ( Si el ácido graso es sólido, disuélvalo en metanol, calentando suavemente). Agite intensamente y luego deje enfriar hasta cero grados en baño de hielo o en refrigerador. Filtre, seque los cristales y obsérvelos al microscopio. Determine su punto de fusión y dibuje los cristales . 4. Absorción de yodo por ácidos graso insaturados. Ponga en un tubo de ensayo 2 m1 de aceite de oliva o de ácido oléico.Agregue 5 gotas de lugol y agite. Esta mezcla debe ser rojiza, como la disolución de yodo. Caliente a la flama y observe que el color va cambiando. Cuando el color inicial ha desaparecido totalmente, deje enfriar y agregue 10 gotas de disolución de almidón se observará que no hay formación del color azul lo cual indica que no hay yodo libre en la mezcla. Si se agregó lugol en exceso, aparecerá el color azul, por haber sido incompleta la absorción. 5. Identificación del colesterol. a) Reacción de Salkowski. En un tubo de ensayo perfectamente seco, ponga 100 mg aprox. De colesterol. Agregue 3 3m1 de cloroformo para disolverlo. Reparta esta disolución en 2 tubos para efectuar, con la mitad, la reacción siguiente: A uno de los tubos agregue 1 m1 de H2 SO4 concentrado, deslizándolo por las paredes, sin agitar. La capa superior y la inferior tomarán colores distintos. Observe el tubo de lado, contra un fondo semioscuro, para apreciar la fluorescencia. Anote lo observado. b) Reacción de Liebermann. Agregue 5 gotas de anhídrido acético y dos gotas de H2SO4 concentrado, a la otra porción de disolución de colesterol en cloroformo. Mezcle suavemente y anote el color que adquiere inicialmente y los cambios que se van observando en el mismo. RESULTADOS 1. Indice de refracción-----------Aceite empleado---------------2. Volumen de NaOH gastado--------------Normalidad: -------------Peso muestra-------Cálculos efectuados: Indice de acidez: -------------3. Forma de los cristales: 4. Punto de fusión----------------------30 de la
  33. 33. 5. Reacción de Salkowski: ------------------------------------6. Reacción de Liebermann: -------------------------------------------------------------------------------------------------------Cuestionario 1. Calcule el índice de acidez teórico de ácido graso empleado. 2. Calcule la cantidad de yodo absorbida por 2 m1 de aceite de oliva (o de ácido oleico, si empleó éste), midiendo el volumen de las 5 gotas que adicionó y tomando en cuenta que la concentración de yodo en g / m1 en el reactivo de lugol es 0.025. Asumir que la relación es estequiométrica y la adsorción, total. 3. Escriba la fórmula estructural del colesterol y su nombre químico completo. 4. Defina el índice de refracción y haga una breve monografía sobre el mismo, relacionándolo en especial con la dispersión ópticarotatoria y otras aplicaciones útiles en Bioquímica. Bibliografía Pierre Crabbé, 1974 Actividad óptica, dispersión rotatoria óptica y dicroismo circular en química orgánica OEA, Washington ps.7-9. Mazur, B. Harrow, 1973 Bioquímica básica 10 a ed. P. 322 Ed. Interamericana. Manuel Urquiza, 1969 Experimentos de fisicoquímica p. 127 y ss. Ed. Limusa- Wiley. Glasstone, 1968 Tratado de química física p. 477 y ss.Ed. Aguilar, S.A. 31
  34. 34. UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BIOQUIMICA I Dra. Elia Nora Aquino Bolaños PRÁCTICA No. 8 ESTABILIDAD DE ACEITES Introducción Los lípidos constituyen uno de los 4 componentes básicos de los alimentos, siendo la fuente más concentrada de energía, además de ser el grupo que tiene mayor influencia en textura, palatabilidad y que contribuye al aroma y sabor de muchos alimentos. Una clasificación general de los lípidos se da en cuanto al estado físico que presentan a una temperatura ambiente y su fuente. Así están las grasas, que son lípidos de origen animal y que, en su mayoría, se encuentran sólidos. Se tiene también a los aceites, que por lo general provienen de semillas vegetales y están líquidos a temperatura ambiente. Las grasas y aceites están formados por ácidos grasos esterificados con un alcohol, el glicerol es el más abundante. Debido a la longitud de la cadena Hidrocarbonada principalmente. A la existencia de dobles ligaduras en la misma, los aceites son muy susceptibles de sufrir cambios por ataque. Dichas ligaduras, presentando un fenómeno de deterioro que se traduce en formación de aromas y sabores objetables a la calidad del aceite. Existen 3 mecanismos por los cuales pueden suceder las reacciones de deterioro de los lípidos: a) Rancidez hidrolítica b) Rancidez oxidativa c) Reversión En todos los mecanismos de deterioro influyen de manera determinante factores físicos, como temperatura, oxígeno, luz, presencia de metales, etc. Objetivos. Determinar la influencia de factores sobre la estabilidad química y sensorial de aceites. Materiales Y Métodos Aceite comestible de origen vegetal Matraces Erlenmeyer de 500 ml 1 litro 4 32
  35. 35. Matraces Erlenmeyer de 250 ml 1 Bomba para pecera 1 Calentador eléctrico 1 Termómetro 1 Balanza electrónica Bureta Refrigerador. Etanol neutralizado. Fenolftaleina 1% Solución de KOH 0.02 N Metodología. Calentar, por cuadruplicado, 150 ml de aceite hasta 200°C. Retirar del mechero y dejar enfriar a temperatura ambiente. Los 250 ml restantes serán el control 2. A cada matraz someterlo a una de las siguientes condiciones: Matraz 1. 2. 3. 4. 5. Almacenar a temperatura ambiente oscuro (control 2) Someterlo a una oxigenación constante Almacenar a temperatura ambiente con el matraz abierto o expuesto a la luz Almacenar en matraz abierto dentro del refrigerador Almacenar en matraz cerrado y a oscuridad (control 1) Anotar los cambios que se observen desde el calentamiento y durante el almacenamiento en cuanto a olor, color y apariencia del aceite el tiempo de observación es de 2 semanas, cada 3 días. Realizar la determinación de acidez libre al control el martes y el viernes durante 15 días. Para determinar el índice de acidez. Se pesan 5 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se agregan 50 ml de alcohol previamente neutralizado a la fenolftaleina con KOH 0.02 N. Se calienta en baño María a ebullición incipiente y se titula con NaOH 0.1N, usando fenolftaleina como indicador. Se debe agitar fuertemente después de cada adición del álcali para asegurar la completa neutralización de los ácidos libres. El vire se presenta en una coloración ligeramente rosa permanente por un minuto. % ácido oléicos = (ml gastados x N x 0.0288 x 100 ) peso de la muestra 33
  36. 36. RESULTADOS Día % acidez Análisis sensorial Cuestionario. 1. ¿Qué son los ácidos grasos y como se presentan en los lípidos? 2. ¿Cuáles son los ácidos grasos más abundantes? 3. Describa el mecanismo de la reacción de la rancidez oxidativa 4. ¿Por qué no es conveniente refrigerar los aceites 5. ¿Qué métodos analíticos se utilizan para determinar la estabilidad de grasas y aceites? 6. ¿Es el cambio de color de un aceite indicativo de la rancidez de aceites vegetales? ¿Por qué? Bibliografía 1. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 2. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y. 3. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioquímica. 3ª. Ed. La prensa Medica Mexicana. 4. Plummer, D. T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill Latinoamericana, 34

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