1. CROMATOGRAFÍA DECROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOSLÍQUIDOS
Primera Parte:Primera Parte:
en columnaen columna

2. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.
Aparatos:Aparatos:
materialesmateriales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.
formas;formas; cuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la decuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la de
sección circular.sección circular.
dimensiones :dimensiones : El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, peroEl tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, pero
debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.
Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columnaLe Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna
es independiente del diámetroes independiente del diámetro
funcionamientofuncionamiento ::
AscendenteAscendente
Vertical: con flujoVertical: con flujo DescendenteDescendente
En formaEn forma HorizontalHorizontal
InclinadaInclinada
La aceleración de la gravedadLa aceleración de la gravedad
Por acción de Presión aplicada en la parte de entradaPor acción de Presión aplicada en la parte de entrada
Succión a la salidaSucción a la salida

3. Es importante la forma de rellenado:Es importante la forma de rellenado:
Empaque HúmedoEmpaque Húmedo
SecoSeco
El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.
se introduce como una papilla con el eluyente.se introduce como una papilla con el eluyente.
Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.
se elimina el exceso de disolvente.se elimina el exceso de disolvente.
El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);
tomar el tubo con una manotomar el tubo con una mano
introduce una pequeña cantidad de materialintroduce una pequeña cantidad de material
empujar el material hasta el otro extremoempujar el material hasta el otro extremo
proseguir el rellenado con pequeños incrementosproseguir el rellenado con pequeños incrementos
cuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezacuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmeza
estabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o deestabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o de
lana de vidrio.lana de vidrio.
““anillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material deanillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material de
una vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porciónuna vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porción
inferior.inferior.
Concluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa el procedimientoConcluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa el procedimiento
descrito en la forma más rigurosa posibldescrito en la forma más rigurosa posiblee

4. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.
Fase estacionariaFase estacionaria ::
Ella depende del mecanismo de separación:Ella depende del mecanismo de separación:
Partición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.Partición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.
Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa.Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa.
El soporte preferentemente debe ser inerte y se utilizan ácido silícico, tierrasEl soporte preferentemente debe ser inerte y se utilizan ácido silícico, tierras
diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.
Como fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridades varían desdeComo fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridades varían desde
lala
correspondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos muy bajascorrespondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos muy bajas
Adsorción, el relleno debe ser activo y en general cualquier sóido poroso que no sea muyAdsorción, el relleno debe ser activo y en general cualquier sóido poroso que no sea muy
soluble en la fase móvil es apropiado. ( alúminas preparadas por deshidrataciónsoluble en la fase móvil es apropiado. ( alúminas preparadas por deshidratación
del hidróxido, por hidrólisis o neutralización de sales. Las ventajas de estedel hidróxido, por hidrólisis o neutralización de sales. Las ventajas de este
material son: granmaterial son: gran
capacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata, fácilmente obtenible ycapacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata, fácilmente obtenible y
muy versátil.muy versátil.
Los rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversosLos rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversos
tratamientos:tratamientos:
activados,activados,
desactivados ydesactivados y
estandarizados.estandarizados.

5. Activación:Activación:
A - Por remoción de sustancias que bloqueanA - Por remoción de sustancias que bloquean
los lugares activos de la superficie.los lugares activos de la superficie.
B - Por mejora del área superficial, la porosidadB - Por mejora del área superficial, la porosidad
o grupos funcionales.o grupos funcionales.
En el primer casoEn el primer caso
A-1) activación por calentamiento;A-1) activación por calentamiento;
A-2) por lavado con solventes inertesA-2) por lavado con solventes inertes
A-3) por uso de reactivos químicos.A-3) por uso de reactivos químicos.
B se logra por calentamiento.B se logra por calentamiento.

6. a-1)a-1) Activación por calentamiento:Activación por calentamiento: tienen por fin el de eliminar eltienen por fin el de eliminar el
agua presente en forma parcial. Se debe evitar elagua presente en forma parcial. Se debe evitar el
sobrecalentamiento ya que éste puede tener un efectosobrecalentamiento ya que éste puede tener un efecto
contraproducente.contraproducente.
a-2)a-2) Activación por lavado con solventes inertes:Activación por lavado con solventes inertes: se realiza porse realiza por
lavado con solvente caliente en la misma columna cromatográfica olavado con solvente caliente en la misma columna cromatográfica o
por proceso “batch”.por proceso “batch”.
a-3)a-3) activación por reactivos químicos:activación por reactivos químicos: se produce el lavado conse produce el lavado con
ácidos, bases u oxidantes, lográndose la remoción de lasácidos, bases u oxidantes, lográndose la remoción de las
sustancias que bloquean los lugares activos del material. Estasustancias que bloquean los lugares activos del material. Esta
operación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo deoperación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo de
provocar cambios indeseables en el comportamiento delprovocar cambios indeseables en el comportamiento del
adsorbente.adsorbente.
Desactivación:Desactivación:
Se usaSe usa

para lograr isotermas menos curvadaspara lograr isotermas menos curvadas

para eliminar alguna propiedad no deseada del rellenopara eliminar alguna propiedad no deseada del relleno

lograr la inercia total del material cuando se requiere que el mecanismolograr la inercia total del material cuando se requiere que el mecanismo
sea de partición.sea de partición.

7. EstandarizaciónEstandarización
Para lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unaPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de una
muestra, el adsorbente a usar sera estandarizado.muestra, el adsorbente a usar sera estandarizado.
Se realiza evaluando suSe realiza evaluando su capacidadcapacidad frente a un grupo de sustancias o bien en base a lafrente a un grupo de sustancias o bien en base a la selectividadselectividad de pares de sustanciasde pares de sustancias
La capacidad de un adsorbente se puede medirLa capacidad de un adsorbente se puede medir

mediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadmediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidad
adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.

Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados de exposición en aire.Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados de exposición en aire.

mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado demediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado de
actividad de la alúmina.actividad de la alúmina.
para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:
I. . . . . . 0% de H2I. . . . . . 0% de H2
II. . . . . 3% “ “II. . . . . 3% “ “
III. . . . 6% “ “III. . . . 6% “ “
IV. . . . 10% “ “IV. . . . 10% “ “
V. . . . . 15% “ “V. . . . . 15% “ “
Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al agregar agua: para una actividad deseadaEsta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al agregar agua: para una actividad deseada
se coloca una cantidad conocida de alúmina activada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y sese coloca una cantidad conocida de alúmina activada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se
agita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separar mezclas de seis colorantes:agita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separar mezclas de seis colorantes:
Metoxiazobenceno (A)Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)Amarillo Sudán (B)
Rojo Sudán (C)Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)Aminoazobenceno (D)
Hidroxiazobenceno (E)Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)Azobenceno (F)
Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más débilmente adsorbidos sean recogidos yDefinió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más débilmente adsorbidos sean recogidos y
separados por la alúmina más activa (Gº I) mientras que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:separados por la alúmina más activa (Gº I) mientras que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:

8. Tamaño de las partículas de Relleno:Tamaño de las partículas de Relleno:
influencia importante en la calidad de las separacionesinfluencia importante en la calidad de las separaciones..

adsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentesadsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentes
pulverulentos dan mejores resultados. Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acercapulverulentos dan mejores resultados. Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca
de cual es el mejor tamaño de partícula.de cual es el mejor tamaño de partícula.
 Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de la columna. Además se incluyeExiste una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de la columna. Además se incluye
como factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnascomo factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnas
homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.
Velocidad de adsorción:Velocidad de adsorción:
Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinte segundos se adsorben las 2/3Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinte segundos se adsorben las 2/3
partes),partes),
Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20
aproximadamente) para completarse el proceso.aproximadamente) para completarse el proceso.
La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.
Velocidad de flujo:Velocidad de flujo:
En lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo que ocurre enEn lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo que ocurre en
cromatografía de gasescromatografía de gases a mayor velocidad de flujo mayor “altura de platoa mayor velocidad de flujo mayor “altura de plato”.”.
Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su valor original (porCuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su valor original (por
cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración del efluente, es decircambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración del efluente, es decir
que resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.que resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.
Uniformidad de la empaquetadura:Uniformidad de la empaquetadura:
Las irregularidades a través de la columna son normalmente grandes comparadas con laLas irregularidades a través de la columna son normalmente grandes comparadas con la
difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduce el % de distorsión (longitud del frente/difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduce el % de distorsión (longitud del frente/
distancia media que se ha movido el frente) o bien:distancia media que se ha movido el frente) o bien:
D% = (D% = (ΔΔL/ LL/ Lii) *100 D% = () *100 D% = (ΔΔV/ Vret)*100V/ Vret)*100
Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue de aproximadamenteLos mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue de aproximadamente
cinco.cinco.

9. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performanceabsorción, por baja o alta performance
Fase móvil:Fase móvil:
Solventes:Solventes: son en general más o menosson en general más o menos
inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.
Se usan como portadores de la mezcla que seSe usan como portadores de la mezcla que se
debe separar.debe separar.
Eluyente:Eluyente: remueve los adsortivos de losremueve los adsortivos de los
adsorbentes.adsorbentes.
Desalazantes:Desalazantes: aquellos eluyentes con fuerzaaquellos eluyentes con fuerza
eluctante altaeluctante alta
Desarrollantes:Desarrollantes: eluyentes con fuerza eluctanteeluyentes con fuerza eluctante
baja.baja.

10. Se pueden evaluar los solventesSe pueden evaluar los solventes
por su poder de elucionpor su poder de elucion
Serie eluotrópicaSerie eluotrópica
1 N pentano 10 Cloroformo
2 Éter de petróleo 11 Dietileter
3 N- hexano 12 Acetato de etilo
4 N- heptano 13 Piridina
5 Ciclohexano 14 Acetona
6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol
7 Tricloroetileno 16 etanol
8 Benceno 17 metanol
9 Dicloroetano 18 aguaAumentodelpodereluotrópicoAumentodelpodereluotrópico

11. Formas de elección de las fases:Formas de elección de las fases:
La figura brinda una interesante orientación para la elección de lasLa figura brinda una interesante orientación para la elección de las
fases conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con elfases conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con el
vértice del triangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de lavértice del triangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de la
mezcla y los restantes vértices indicaran el grado de actividad de lamezcla y los restantes vértices indicaran el grado de actividad de la
fase estacionaria y polaridad de la móvil.fase estacionaria y polaridad de la móvil.
Fase móvil
Muestra
Fase
estacionaria
Hidrofílica polar
Lipofílica no polar
Hidrofílica polar
Hidrofílica polar
Lipofílica no polar
Lipofílica no polar

12. Desarrollo cromatográficosDesarrollo cromatográficos
Anteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y por
elución.elución.
Elución Fraccionada:Elución Fraccionada:
Se utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. EsteSe utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. Este
procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.
Elución gradual:Elución gradual:
Si las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frenteSi las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frente
difuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasdifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colas
mezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico amezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico a
concentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentraciónconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentración
a lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonaa lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zona
cromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente máscromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente más
enérgica que la parte frontalenérgica que la parte frontal

13. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de alta
velocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)
La dificultad principal que presenta la cromatografía liquidaLa dificultad principal que presenta la cromatografía liquida
tradicional es la lentitud.tradicional es la lentitud.
La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de lasLa cromatografía de gases, presenta el inconveniente de las
elevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, yelevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, y
limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.
Es así que surge la cromatografía liquida de alta velocidadEs así que surge la cromatografía liquida de alta velocidad
(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos
con la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones concon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones con
rapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna arapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna a
velocidades lineales de flujo que puedenvelocidades lineales de flujo que pueden
ser hasta 100 veces la de la cromatografíaser hasta 100 veces la de la cromatografía
tradicional.tradicional.
Es de hacer notar que la eficienciaEs de hacer notar que la eficiencia
(expresada en “ATPE”) es mayor(expresada en “ATPE”) es mayor
cuanto menor sea la velocidadcuanto menor sea la velocidad

14. Los componentes de unLos componentes de un
cromatógrafo de líquidos de altacromatógrafo de líquidos de alta
velocidadvelocidad
deposito
Bomba
Inyect
or
Columna
Detector
Registrador
Colector de
fracciones
Medidor de
flujo

15. cromatógrafo de líquidoscromatógrafo de líquidos
de alta velocidadde alta velocidad

16. Bombas:Bombas:
La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidadLa bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad
satisfactoria, es impulsada por un motor. Dado que los detectores usadossatisfactoria, es impulsada por un motor. Dado que los detectores usados
por lo general son sensibles al flujo, la bomba de liberar el líquido a unapor lo general son sensibles al flujo, la bomba de liberar el líquido a una
velocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducir dosvelocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducir dos
cilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentecilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamente
mientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabomientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabo
la función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.la función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.
Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
Mantener el flujo libre de pulsacionesMantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
Control y reproducibilidad del flujo de solventeControl y reproducibilidad del flujo de solvente
Componentes de la bomba resistentes a la corrosiónComponentes de la bomba resistentes a la corrosión
Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según suLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su
funcionamiento y diseño en:funcionamiento y diseño en:

MecánicasMecánicas

RecíprocantesRecíprocantes

De desplazamiento contínuoDe desplazamiento contínuo

NeumáticasNeumáticas

17. ColumnasColumnas
diámetro interno de 1 a 6 mmdiámetro interno de 1 a 6 mm
longitud de 30 a 100 cm cortas sonlongitud de 30 a 100 cm cortas son
rectas y las mas largas enrolladasrectas y las mas largas enrolladas
(long 600 cm).(long 600 cm).
son de acero inoxidable o deson de acero inoxidable o de
vidrio.vidrio.
operan a temperatura ambiente.operan a temperatura ambiente.
La velocidad de difusión puedeLa velocidad de difusión puede
aumentar de un poco alaumentar de un poco al
incrementar la temperatura, por loincrementar la temperatura, por lo
que se suele usar una camisa deque se suele usar una camisa de
calentamiento, en “CLAP” elcalentamiento, en “CLAP” el
control de la temperatura no es tancontrol de la temperatura no es tan
significativo como en CGsignificativo como en CG

18. Gradiente de elución:Gradiente de elución:
El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente de elución oEl equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente de elución o
programación del disolvente.programación del disolvente.
Produce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puede conducir a unaProduce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puede conducir a una
mejor resolución.mejor resolución.
Se cambia gradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de laSe cambia gradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de la
válvula mezcladora programada.válvula mezcladora programada.
Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:
IsocráticoIsocrático
Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual seGradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se
cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
A baja presiónA baja presión
A alta presiónA alta presión
Permite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempoPermite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo
posible.posible.
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dosCuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos
objetivos:objetivos:
Asegurar alta precisión y exactitud.Asegurar alta precisión y exactitud.
Determinar la composición inicial y final del solventeDeterminar la composición inicial y final del solvente
Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasosPara obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasos
fundamentales:fundamentales:
a) Ajustar el tiempo del gradientea) Ajustar el tiempo del gradiente
b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónc) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución
d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.

19. Sistemas de Inyección de muestraSistemas de Inyección de muestra
Estos sistemas han variados durante laEstos sistemas han variados durante la
historia del sistema de HPLC, en unhistoria del sistema de HPLC, en un
principio de utilizaba la inyección de laprincipio de utilizaba la inyección de la
muestra con jeringas de alta presiónmuestra con jeringas de alta presión
cuales ya están de desuso. Hoy se utilizacuales ya están de desuso. Hoy se utiliza
el sistema de válvulas inyectorasel sistema de válvulas inyectoras

20. Detectores
Deben de tener un volumen interno pequeño para
reducir el ensanchamiento de pico

Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción,
densidad etc.)

Basados en una propiedad del soluto (absorbancia en
UV, fluorescencia etc.)
Tipos de detectores

Detector de absorbancia

Detector de fluorescencia

Detector de índice de refracción

Detector de dispersión de luz

Detector electroquímico

Detector por espectroscopia de masas