A redox-potenciál mérésen alapuló modszer részletes bemutatása: * Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú minták esetében. * Egyszerű mérési technika. * Szabványos táptalajok használhatók. * A redox-görbe alakjából következtetni lehet a mikroba-csoportra. * Nagyon széles (100-108) sejtszám-tartományban hígítás nélkül alkalmazható. * Különösen célszerű membrán-szűréses módszer kiértékelésére. * Élelmiszeripari vizsgálatokra validált és akkreditált módszer.

1. 1

2. 2
MICROTESTER
ÚJ TECHNIKA A
MIKROBIOLÓGIÁBAN
Dr. Reichart Olivér
Dr. Szakmár Katalin
Budapest, 2012. február 15.
A redox-potenciál mérésen alapuló gyors
vizsgálati módszer elméleti háttere

3. 3
Probléma:
• Klasszikus tenyésztéses módszerek időigénye nagy
(1 -3 nap).
• A nagy időigény miatt az eredmények nem csatolhatók vissza a
technológiába.
Cél:
• Durva mikrobiológiai problémák gyors kiszűrése
• Gyors tételminősítés
• Átmeneti tárolási idő csökkentése
Megoldás:
• Gyors mikrobiológiai vizsgálati módszerek
MIKROBIOLÓGIAI MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS
PROBLÉMÁI

4. 4
Élő és holt sejtek együttes számának meghatározása:
• Direkt számlálás (csak tiszta folyadékban alkalmazható)
• Számlálókamra
• Flow cytometer
• Turbiditásmérés (csak tiszta folyadékban alkalmazható)
• ATP mérés (mikrobiális és élelmiszer eredetű ATP elkülönítése
nehéz)
Élősejtszám meghatározása:
• Impedancia mérésen alapuló módszerek
• Malthus
• Rabit
• Bactrac
• Redox-potenciál mérése
GYORS MÉRÉSI MÓDSZEREK

5. A BCE ÉTK Fizika- és Automatizálás Tanszék és a
SZIE ÁOTK Élelmiszer-higiéniai Tanszék kutatói
által kifejlesztett és szabadalmaztatott eljárás.
MicroTester
REDOXPOTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ
VIZSGÁLATI MÓDSZER

6. • Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú minták
esetében.
• Egyszerű mérési technika.
• Szabványos táptalajok használhatók.
• A redox-görbe alakjából következtetni lehet a mikroba-
csoportra.
• Nagyon széles (100-108) sejtszám-tartományban hígítás nélkül
alkalmazható.
• Különösen célszerű membrán-szűréses módszer kiértékelésére.
MIT TUD A MICROTESTER?

7. 7
Direkt mérés:
• Szaporodás közvetlen detektálása a táptalaj redox-
potenciál változása alapján
Indirekt mérés:
• Szaporodás detektálása a CO2 termelés alapján
A MICROTESTER ALKALMAZÁSI
LEHETŐSÉGEI

8. Elméleti alapok:
• A szaporodás energiaforrása a biológiai oxidáció, ami a
környezetben redukciót eredményez.
• Biológiai rendszerekre jellemző általános redox reakció:
[Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]
• Nernst egyenlet:
 
 reducta
Hoxidant
ln
Fn
TR
EE 0h






DIREKT MÉRÉS

9. 9
E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 60 120 180 240 300
t (min)
Eh(mV)
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
lgN(N=cfu/ml)
Eh mV lgN
A REDOX-POTENCIÁL VÁLTOZÁSÁVAL A
SZAPORODÁS NYOMON KÖVETHETŐ

10. 10
KÜLÖNBÖZŐ BAKTÉRIUMOK
REDOX-GÖRBÉI
Redox görbék TSB-ben
-400
-200
0
200
400
0 5 10 15 20
t (h)
Eh(mV)
steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt.

11. 11
MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS
(16 csatorna)

12. 12
MICROTESTER MÉRŐCELLÁK
direkt mérőcella kémcső cella indirekt mérőcella

13. Lemezöntés, szélesztés
• Látható telepek kialakulása
– Különálló (feltételezetten 1 telepképző egységből kiinduló), kb.
106 – 107 sejtből álló populáció.
Határhígítás (MPN)
• Látható zavarosodás kialakulása, steril csövek jelenléte.
– Néhány (max. 10) sejtből kb. 107-108 sejt/ml sűrűségű populáció.
A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSA
TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKNÉL

14. • A redox-potenciál változásának sebessége haladja
meg az előírt kritikus értéket.
• Detektációs kritérium:
pl: |dE/dt|> 0,5 mV/min
Mikroorganizmustól és tápoldattól függően 0,4 – 1,0
mV/min közötti érték.
A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSA
REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSNÉL

15. 15
A REDOX-GÖRBE JELLEMZŐ PARAMÉTEREI

16. Mikroba Tápoldat kritérium Mikrobaszám
(mV/min) lg N CFU/ml
E. coli TSB 37 °C -1,0 6,2 1,6∙106
Ps. aeruginosa TSB 37 °C -0,4 6,3 2,0∙106
Enterococcus faecalis TSB 37 °C -0,5 6,7 5,0∙106
Staphylococcus aureus TSB 37 °C -1,0 6,4 2,5∙106
Bacillus cereus TSB 30 °C -0,8 6,5 3,2∙106
MICROTESTER DETEKTÁCIÓS KRITÉRIUMOKHOZ
TARTOZÓ MIKROBASZÁMOK

17. Detektációs idő (Time To Detection, TTD):
a detektációs kritérium eléréséig szükséges idő.
Lemezöntés, szélesztés
• Látható telepek kialakulása (106–107 sejt)
• 1 sejtből indulva
Független a kiinduló mikrobaszámtól.
Határhígítás (MPN)
• Látható zavarosodás kialakulása (107-108 sejt/ml)
• 1-10 sejtből indulva
Független a kiinduló mikrobaszámtól.
TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKHEZ TARTOZÓ
DETEKTÁCIÓS IDŐK

18. 106–107 sejt/ml koncentráció elérése az inokulumról
indulva. A kiindulási sejtszám függvénye.
Meghatározva a TTD és a kiindulási sejtkoncentráció közötti
összefüggést, kalibrációs görbe alapján a kiindulási
mikrobák száma (lgNo) TTD méréssel becsülhető.
MICROTESTER DETEKTÁCIÓS IDŐK

19. 19
A KIINDULÁSI SEJTSZÁM HATÁSA A
REDOX-GÖRBÉRE
E. coli 1/2 TSB-ben
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 2 4 6 8 10 12 14
t (h)
Eh(mV)
steril lgN=0,09 lgN=2,38 lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80

20. 20
KALIBRÁCIÓS GÖRBE
E. coli 1/2 TSB-ben y = -1,1736x + 8,4416
R2
= 0,9851
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/ml)
TTD(h)

21. Jelenlét/hiány próba:
• Minta közvetlen beoltása
Nagyságrendi becslés (Titer):
• Hígítási sor készítése, mérés
• Eredmény megadása nagyságrendként
MPN módszer:
• Hígítási sor készítése
• Hígításonként beoltások
• Kiértékelés automatikusan
MÉRÉSI MÓDSZEREK
KALIBRÁCIÓS GÖRBE NÉLKÜL

22. Kalibrációs görbe felvétele:
• Telepszám és TTD összefüggés meghatározása.
• Egyenlet betáplálása a gépbe.
Mikroba (telepképző egység) szám meghatározás:
• Közvetlenül a mintából.
• Előzetesen hígított mintából.
• Előzetesen koncentrált (membránszűrt) mintából.
Probléma:
• Csak akkor alkalmazható, ha a mikroflóra összetétele ismert és van
kalibrációs görbénk.
MÉRÉS ELŐZETESEN FELVETT (KÜLSŐ)
KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁN

23. MPN módszeren alapuló kiértékelés:
• Hígítási sor készítése hígításonként egy, vagy több leoltással.
• Redox-görbék felvétele.
• A TTD értékek meghatározása. (Ha szükséges.)
• Szaporodást mutató és nem mutató hígítási szintek alapján az
MPN érték meghatározása.
• Az MPN érték és a különböző hígítási szintekhez tartozó TTD
értékek ismeretében a kalibrációs görbe felvétele.
• A kalibrációs görbe alapján a hasonló minták mikrobaszámának
kiszámítása.
MÉRÉS MINTÁBÓL FELVETT (BELSŐ)
KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁN

24. 24
ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS
GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 1.

25. 25
ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS
GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 2.

26. 26
ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS
GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 3.

27. Elméleti alapok:
• A szaporodás során keletkező CO2-ot lúgban elnyeletjük és
az oldat redox-potenciál változását mérjük.
• Az elnyelető oldatban a potenciál-meghatározó
összefüggés:
   
 





 2
3
3
0 ln
CO
HCOH
Fz
TR
EE
INDIREKT MÉRÉS

28. 28
INDIREKT MÉRÉS
Saccharomyces cerevisiae
200
250
300
350
400
450
500
550
600
0 10 20 30 40 50
t (h)
Eh(mV)
lgN=4,1 lgN=3,1 lgN=2,1 lgN=1,1 lgN=0,1 Steril

29. 29
INDIREKT MÉRÉS KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJE
Saccharomyces cerevisiae
(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min)
TTD(h) = -7.2048.
lgN + 41.254
R
2
= 0.9856
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TTD(h)

30. 30
• Kísérletileg beállított koncentrációkkal az összefüggés
jól reprodukálhatóan mérhető.
• Megfelelő koncentrációjú lúgoldat alkalmazásával a
redox-potenciál változásából az elnyelt CO2
mennyisége számítható.
• Alapul szolgálhat a képződő CO2 mennyiségi
meghatározásához (BOI mérés).
• Nagy BOI értékek esetén a predikció jelentős
időmegtakarítást tesz lehetővé.
INDIREKT MÉRÉS

31. 31
Szennyvíz
150
200
250
300
350
0 50 100 150
t (h)
Eh(mV)
BOI=400 mg/l BOI=200 mg/l BOI=100 mg/l
BOI BECSLÉSE INDIREKT MÉRÉS ALAPJÁN

32. 32
Nyers szennyviz y = 26,179x - 15,58
R2
= 1
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
BOI0/BOI
TTD(h)
BOI0 = 400 mg/l
BOI PREDIKCIÓ REDOX-POTENCIÁL
MÉRÉS ALAPJÁN

33. 33
MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS
(32 csatorna)

34. 34
MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS
(2 csatorna)

35. 35
A redox-potenciál mérésen alapuló gyors
vizsgálati módszer validálva,
és élelmiszeripari vizsgálatokra
akkreditálva van.

36. 36
Köszönöm a figyelmet!
microtest1@t-online.hu
Budapesti Corvinus Egyetem
Élelmiszertudományi Kar – Fizika-Automatika Tanszék
Microtest Kft.