1. VIRUS DE L’HEPATITE C
& Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
Des Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris XII
Créteil
3. Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
4. • Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
Virus de l’Hépatite C
Bartenschalger et al., 2004.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
8. Organisation Génomique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
9. Régions 5’ et 3’NC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
10. Site d’Entrée Interne du Ribosome
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
11. From Department of Structural Biology, Stanford University Medical School, USA
Site d’Entrée Interne du Ribosome
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
12. Organisation Génomique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
13. STÉATOSE
ROS
FIBROSE
Activation des cellules étoilées
Insulino-
Résistance
Cytokines (TNF, TGF, IL-8, FasL)
Produits de la peroxydation lipidique
Cytokines
NF-kB
TNF
Nécro
Inflammation
Cytokines
TGF
Cytokines
Réponse
immunitaire
TGF
Capside
TNF
Génotype 3
Capside
NS5A
Adapted from Asselah et al., 2006
Protéine de Capside & Pathogenèse
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
18. Région HVR1 (27 amino-acides)
80% de divergence nucléotidique entre génotypes
Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Région HVR1
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
19. Protéine Non-structurale 3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
21. Sérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
Hélicase/NTPase
Protéine NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189
22. Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
Production d’IFN- en Réponse à
une Infection Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
23. Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
1. Clivage de TRIF 2. Clivage de CARDIF
Inhibition de la Phosphorylation
d’IRF3 par NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
24. Sérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
• Cible de molécules antivirales
VX-950 (Telaprevir®, Vertex)
SCH503034 (Boceprevir®, Schering-Plough)
ITMN 191 (Intermune)
Hélicase/NTPase
Protéine NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189
27. Protéine NS4B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
28. Complexe de Réplication
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
29. ARN Polymérase ARN-dépendante
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
30. Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold
Des 1999, 7: 1417-1426.
Polymérase Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
31. Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire
de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Réplication Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
44. Visualisation des cellules
Huh7 infectées
3 - Vecteur de transfert de la GFP
2 - Expression des glycoprotéines E1E2 du VHC
1 - Expression de Gag-Pol de MLV
Co-transfection
des cellules 293 T
Production de
ppVHC infectieuses
Infection in vitro
des cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
45. A
B
Adapted from Nature Review Drug Discovery, 2002; 1:911-916
Réplicons Subgénomiques
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
48. Virus de l’hépatite C
Production virale (/24 heures) 1012
T1/2 virus libre (heures) 2 - 3
T1/2 brin ARN (heures) ~10
Taux de mutation Très élevé
Mutants d’échappement au SI Fréquent
Cellules cibles
Taille du compartiment Probablement grande
Soriano et al., J Antimicro Chemother 2008, 62: 1-4
Dynamique Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
49. • Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10-4
-10-4
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
ARN Polymérase ARN-dépendante
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
50. Simmonds et al. Hepatology 2005.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Diversification des Génotypes
52. • Facteur prédictif de la réponse au
traitement
• Conditionne
– La dose de ribavirine (800 - 1400 mg)
– La durée de traitement (16 - 72 semaines)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotypes
53. Weiner et al., Virology 1991; 180:842-848; Martell et al., J Virol 1992;66:3225-36.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèce
54. • Dérive génétique
– Accumulation de mutations ponctuelles
• Glissement génétique
– Suite à la modification brutale de l’environnement
réplicatif
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Mécanismes d’Evolution de la
Quasi-espèce
55. • Joue un rôle dans le maintien de
l’infection chronique
• Joue un rôle dans l’échec des
traitements antiviraux
• Joue un rôle dans la sévérité de la
maladie
Farci P, 2000; Science, 288: 339-344; Lavillette D, 2005; Journal of Virology, 79(10): 6023-6034; Farci P, 2002; PNAS, 99: 3081-3086;
Chambers TJ et al., 2005; 79: 3071-3083; Sullivan et al., JID 2007, 196: 239-248.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèce
56. Virus de l’Hépatite C
IV. Exemples d’Application
de la Variabilité Génétique
57. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
58. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
62. Génotype 3a
Chez les UDVI
0.1 substitution per site
JK049
TrKj
NE125
NE048
HCV-3a
HCV-3f
HCV-3c
HCV-3b
HCV-3k
Australie
USA, Côte Ouest
Argentine
Brézil
France
USA, Côte Est
75
72
83
79
100
92
60
62
81
63
98
98
99
62
52
71
95
56
Morice et al., J Med Virol 2006;78:1296-1303.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
63. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
64. • Mise en évidence d’une séroconversion VHC lors du
dépistage et du suivi des patients hémodialysés en
juillet 2005, à l’hôpital Henri Mondor
• L’ensemble des patients hémodialysés ont été testés
(anticorps anti-VHC et ARN viral)
– Mise en évidence d’un 2nd cas au cours de la même période
• Analyses génétique et phylogénique
• Recherche du VHC dans l’environnement
– Supports et surfaces inertes
Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
65. Identification de deux cas de
séroconversion en 2004 au sein de l’unité
d’hémodialyse de l’hôpital Henri Mondor :
– Patient "1" infecté par un génotype 3a
– Patient "2" infecté par un génotype 1
Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
72. MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région NS5B
Patient 16
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
Patient 64
Patient 46
1f_L38350
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1i_AY434119
1h_AY434131
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
0.05
PARCIMONIE
Patient 16
Patient 18
Patient 17
Patient 7
Patient 8
Patient 64
Patient 46
1f_L38350
1h_AY434131
1i_AY434119
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
73. MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région Core-E1
PARCIMONIE
Patient 7
Patient 64
Patient 46
Patient 18
Patient 16
Patient 17
Patient 8
1h_AY434132
1h_AY257087
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_M58335
1b_L38372
1b_D90208
1f_L38371
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
0.02 Patient 64
Patient 46
Patient 18
Patient 16
Patient 17
Patient 7
Patient 8
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_D90208
1b_L38372
1b_M58335
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
1f_L38371
1h_AY434132
1h_AY257087
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
74. • Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en
Grèce ("Papageorgiou General Hospital", Thessaloniki)
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques
mois
• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante
– Système HCVpp
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Transmission Nosocomiale en Grèce
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
75. 0,1 substitution per site
HCV-1
HCV-H
SR052
HC-G9
SR037
HC-J4
HCV-BK
BE90
Pt-11
Pt-10
Pt-9
Pt-5
Pt-12
Pt-13
Pt-15
Pt-16
Pt-2
Pt-4
Pt-3
Pt-1
Pt-17
Pt-7
Pt-6
Pt-8
1b
HCV-1
1a
1c
Souche B
Souche A
Analyse Phylogénique
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
NJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
76. Incubation HCVpp avec
des dilutions de sérum
Détermination de
l’infectivité (bruit de fond)
Détermination de l’activité
neutralisante du sérum
Infection de
cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
77. Patient-10 (souche B)
ARN VHC
(UI/mL)
Semaines
% neutralisation
infection
Huh7
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
• Absence de réponse neutralisante et absence de
contrôle de l’infection
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Réponse Neutralisante - Groupe 1
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
78. • Réponse neutralisante forte et spécifique
• Réponse neutralisante inversement proportionnelle
à la cinétique de la charge virale
Patient-1 (souche A)
% neutralisation
infection
Huh7
Réponse Neutralisante - Groupe 2
ARN VHC
(UI/mL)
Semaines
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
79. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
80. Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique
50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation
6 - 10%
HCC
4 - 5% par an
Mortalité
10-30ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
81. Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique
50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation
6 - 10%
HCC
4 - 5% par an
Mortalité
10-30ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
82. Persistance Virale
• Persistance virale
– Echec de la réponse immune, pourtant
présente et adaptée, à éliminer le virus ou les
cellules qui l’abritent
• Interface complexe
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
83. Processus Multi-étape
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique
50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
84. Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique
50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale ?
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Processus Multi-étape
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
85. Adapted from Ferrari C, Gasroenterology 2007; 132(2): 801-805
Persistance du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
86. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
87. Roque-Afonso et al., J Virol 2005;79:6349-57)
Région 5’NC Région E1-E2
Compartimentation Plasma-PBMC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
88. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
89.
90. HEPATITE C : Stratégie
Diagnostique & Suivi
Virologique
96. Tests Virologiques Moléculaires
Tests quantitatifs
Seuil de détection ≥ qualitatifs
Quelle quantité est présente ?
Tests qualitatifs
Très sensibles
( 50 IU/mL)
Est-ce que le VHC est présent ?
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination
du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
97. Tests Virologiques Moléculaires
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Détermination
du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Quanti-Qualitatifs
99. Intérêts de la Détection -
Quantification de l’ARN VHC
• Evaluation de la réplication virale chez des
patients anticorps anti-VHC positifs
• Evaluation de la réponse virologique au
cours du traitement pegIFN - RBV
– Réponse virologique rapide (semaine 4)
– Réponse virologique précoce (semaine 12)
– Réponse fin de traitement (EOT)
– Réponse virologique soutenue (semaine 24 post-Rx)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
100. Techniques Disponibles
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
101. Principe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
103. bDNA : Forces & Faiblesses
• Forces
– Quantification indépendante du génotype
– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques
– Faible volume de prise d’essai
– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6.90 Log10 UI/mL
• Faiblesses
– Faible sensibilité
. LLOD: 2.80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs
– Méthode semi-automatisée (Siemens system 340 analyzer)
– 12 contrôles par run
Stratégie diagnostique & suivi virologique
104. Principe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
106. Avantages Techniques de la PCR
en temps réel
• Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de
quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers
l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
109. • Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de
quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers
l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR
en temps réel
111. • Remplace les techniques qualitatives de
détection de l’ARN VHC
• Quantifie l’ensemble des charges virales
observées en pratique clinique
– Faibles charges virales au cours du traitement
• Surveille efficacement les cinétiques
virales (évaluation précoce des réponses
virologiques au traitement)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Cliniques de la PCR
en temps réel
112. Quantification de l’ARN du VHC
CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
DifferencebetweenHBVDNAlevelsmeasuredin
CAP/CTMandinbDNA(inLog10IU/mL)
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
Mean of HCV RNA levels measured in CAP/CTM and bDNA
(in Log10 UI/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Mean
difference
+ 1.96 mean
difference
- 1.96 mean
difference
Stratégie diagnostique & suivi virologique
117. Génotypes du VHC
Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
7
Central
Africa
Stratégie diagnostique & suivi virologique
118. Intérêts de la Détermination du
Génotype
• Détermination systématique du
génotype
– Facteur prédictif de la réponse au
traitement
– Conditionne
• La dose de ribavirine
• La durée du traitement (24 vs 48 semaines)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
119. Détermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype
VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype
VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
120. Détermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype
VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype
VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
121. Cibles pour le Génotypage
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique
122. Cibles pour le Génotypage
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique
123. Méthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis
(RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur
support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)3
• Autres méthodes :
– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique
124. Méthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis
(RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur
support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)3
• Autres méthodes :
– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique
125. Versant® HCV Genotype 2.0 Assay
3
17
15
20
21
23. AC
Marker
CC
AC
4
5
10
12
24. 6 c-l
16
2b 3a 4b 6a1b 6c-l1a
6
7
8
9
11
13
14
18
19
25. 1a
25. 1b
5’UTR
Same bands
as the 1.0 version
Core region
Stratégie diagnostique & suivi virologique
126. Importance de la Région Virale pour la
Détermination du Sous-type
Analyse
phylogénique
de la région
5’NC
1ère
génération
de Line
probe assay
(LiPA1.0)
2ème
génération
de Line
probe assay
(LiPA2.0)
PCR en
temps réel
1a (n=233) 80,3%
(n=187)
73,0%
(n=170)
98,3%
(n=229)
94,4%
(n=220)
1b (n=253) 94,1%
(n=238)
91,7%
(n=232)
98,0%
(n=248)
93,3%
(n=236)
Chevaliez et al., EASL 2009.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
128. Diagnostic de l’Infection Aiguë
Ac anti-HCV
-
-
+
+
ARN VHC*
-
+
-
+
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Diagnostic
Absence d’infection aiguë
Infection aiguë C
Probablement pas d’infection
aiguë
Difficile de conclure
Stratégie diagnostique & suivi virologique
129. Diagnostic de l’Infection Chronique
• Détection des anticorps anti-VHC totaux
par ELISA
• Recherche d’ARN du VHC par un test
sensible*
• Détection d’ARN du VHC* si le test ELISA (-
) chez des patients hémodialysés ou
immunodéprimés
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Stratégie diagnostique & suivi virologique
133. Indications Actuelles du Traitement
• Patients infectés par un VHC de génotype 1
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)
– Durée : 48 semaines
• Patients infectés par un VHC de génotype 2/3
– Interferon pégylé plus ribavirine (800 mg/j)
– Durée : 24 semaines
• Patients infectés par une VHC de génotype 4, 5 et 6
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)
– Durée : 48 semaines
Stratégie diagnostique & suivi virologique
134. Génotype VHC
VHC-1 (4,5,6)
Quantification ARN
VHC-2,3
Bithérapie
24 semaines
Ribavirine 800 mg
Bithérapie
48 semaines
Ribavirine 1000-1400 mg
Quantification ARN à S12
Diminution < 2 Log Diminution 2 Log
ARN VHC +
Arrêt traitement
poursuite avec
IFN pégylé pour
ralentir la
progression de la
maladie
hépatique
Poursuite jusqu’à
S24
Si ARN VHC -
Poursuite jusqu’à
S48
diminution 2 Log
ARN VHC -
Poursuite jusqu’à
S48
135. Optimisation du Traitement en
Fonction de la Réponse Virologique
• Outils virologiques sensibles
– Sensibilité : 10-15 UI/mL
– Evaluation de la réponse au traitement
• Répondeurs virologiques rapides
– Raccourcissement de la durée de traitement
• Répondeurs virologiques précoces partiels
– Allongement de la durée de traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
146. • Durée de traitement de 6 mois chez tous les
patients avec une RVR indépendamment du
génotype
• Raccourcissement de la durée de traitement
à 12 ou 16 semaines chez les patients
infectés par une génotype 2/3 avec un ARN
indétectable à S1 ou S2 (?)
Résumé
Stratégie diagnostique & suivi virologique
150. 0
20
40
60
80
100
%deRVP
NS NS
NS
p=0.04
S 4 S 12 S 4 S 12
ARN VHC < 50 UI/ml ARN VHC ≥ 50 UI/ml
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
48 semaines
72 semaines
Génotype 1 : Traitement Long
Stratégie diagnostique & suivi virologique
151. Résumé
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Allongement de la durée de traitement à
72 semaines améliore la RVS :
– Chez les patients avec une RVP partielle
– Chez les non-répondeurs à un premier
traitement par une bi-thétrapie standard qui
sont retraités
154. • Définition
– Propriétés intrinsèques des souches
virales qui s’opposent à l’action antivirale
des effecteurs ou à des médicaments
antiviraux
Résistance aux traitements
Résistance Virale
155. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC
156. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC
157. PEG-IFN- 2a + ribavirine
(Fried et al., 2002)
PEG-IFN- 2b + ribavirine
(Manns et al., 2001)
Manns et al., Lancet 2001;358:958-65 ; Fried et al., N Engl J Med 2002;347:975-82; Hadziyannis et al., Ann Intern Med 2004;140:346-55.
PEG-IFN- 2a + ribavirine
(Hadziyannis et al., 2004)
54%
24%
58%
48%
18%16%
Résistance aux traitements
Taux d’Echecs
164. – Motif nucléotidique responsable de
cette différence de sensibilité ?
– Pas de sélection de mutations de
résistance, même si modification de
la composition de la quasi-espèce
virale
Résumé
Résistance aux traitements
165. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC
166. Mécanismes d’Action
Hypothétiques de la RBV
Adapted from Lau et al., Hepatology 2002; 35: 1002-9.
Ribavirine
Ribavirine
Transporteur
RMP RDP RTP
GMP
GTP
IMPDH
IMP
RdRp
Réplication
HCV RNA
Hépatocyte
(2) Inhibition de la RdRp VHC(1) Inhibition de l’IMPDH
HCV RNA "Catastrophe
(3) Effet mutagène
erreur”
CTL
Th1 IFN-, TNF-
(4) Effets immunomodulateurs
Résistance aux traitements
167. Pawlotsky et al., Gastroenterology 2004;126:703-14
-1.0
-0.5
0.0
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Mean HCV RNA decrease (log IU/ml)
Time (days)
Controls
Ribavirin
monotherapy
Résistance aux traitements
Effet Antiviral de la RBV
168. Semaines
*
*
*
*
*
* p<0.05
24 7260524830 36
RBV jusqu’à S52
Arrêt RBV à S24
Bronowicki et al., Gastroenterology 2006
PourcentagedeRechutes(HCVRNA+)
Suivi post-thérapeutique
Prévention de la Rechute
Résistance aux traitements
169. Prévention de la Rechute
(PROVE-2)
Résistance aux traitements
Hézode et al., en révision favorable.
T12/PR12
n/N=
T12/P12
(Sans RBV)
48
22/46
0
10
20
40
50
Tauxderechutes(%)
30
T12/PR24
14
8/5719/63
30
PR48
(Contrôle)
22
10/45
170. • Ribavirin mechanisms of action in chronic
hepatitis C remain unknown
• Ribavirin direct antiviral effect is modest
and transient
• Long-term ribavirin administration does
not select for specific resistance
substitutions
Résumé
Résistance aux traitements
171. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC
172. Cibles Potentielles
des Inhibiteurs
Spécifiques
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
1. Attachement viral, fusion, décapsidation
2. Traduction de l’ARN viral
3. Maturation de la polyprotéine
4. Réplication du génome viral
5. Maturation de la particule virale
Résistance aux traitements
173. Viral entry inhibitors
Hepatitis C immunoglobulin HCIg)
HCV-Ab 68 and Ab 65 (monoclonal Ab)
HCV RNA translation inhibitors
ISIS 14803 (antisense)
AVI – 4065 (antisense)
Heptazyme (ribozyme)
VGX-410C (small molecule IRES inhibitor)
TT 033 (siRNA)
Posttranslational processing inhibitors
NS3-4A serine proteinase inhibitors
BILN 2061
ITMN 191
VX-950
SCH 503034
ACH-806/GS-9132
HCV replication inhibitors
NS5B polymerase inhibitors
MK-0608
HCV-796
R1626
JTK-003
NM-283
XTL 2125
Cyclophilin B inhibitors
DEBIO-025
NIM 811
NS5A inhibitors
A-831, A-689
Helicase inhibitors
QU663
Recombinant Ab fragments
Virus assembly and release inhibitors
UT-231B (iminosugar-glucosidase inhibitor)
Celgosivir (glucosidase inhibitor)
Phase of Development
*
*
*
*
Preclinical I II III IV
*
*
*
Pawlotsky JM, Chevaliez S, McHutchison JG, Gastroenterology 2007;132:1979-98.
Résistance aux traitements
Molécules en Développement
177. De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Inhibiteurs en
Développement
Résistance aux traitements
178. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement
179. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement
182. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
183. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
184. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
185. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
186. • A highly selective, reversible
peptidomimetic inhibitor of the HCV NS3-
4A serine protease
• IC50 of the order of 0.5 µM in vitro
• HCV RNA level reduction of 3-4 Log10 in
vivo
Lin et al., AAC 2006, 50(5): 1813-1822; Zhou et al., Antimicrob Agents and Chemother 2008, 52(1): 110-120.
Résistance aux traitements
Telaprevir (VX-950)
187. Welsch et al., Genome Biology 2008, 9(1): R16.1-R16.18.
Telaprevir
193. Relapse Rate
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
T12/PR12 and
T12/PR24 Combined
3
0
10
20
30
5/163
PatientsWithVirologic
BreakthroughbyWeek12(%)
0
10
20
30
19/78
T12/P12
(No RBV)
24
19/78PatientsWithVirologic
BreakthroughbyWeek12(%)
Résistance aux traitements
194. Patients Receiving Telaprevir
and Peg-IFN 2a without RBV
• Among the 6 patients who received the
combination of telaprevir and Peg-IFN2a
without RBV
– 3 subtype 1a patients remained HCV RNA positive on
treatment
– 3 patients became HCV RNA undetectable upon
therapy and relapsed after treatment
• 2 infected with subtype 1b
• 1 infected with subtype 1a
Résistance aux traitements
Chevaliez et al., IASL 2008.
196. Weeks
WT
A
B C D
E F
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Chevaliez et al., IASL 2008.
Résistance aux traitements
197. Weeks
WT
A
B C D
E F
A
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements
198. Weeks
WT
A
B C D
E F
A B
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements
199. Weeks
WT
A
B C D
E F
A B C
D E
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements
204. Location of the Amino Acid Changes
Résistance aux traitements
205. Location of the Amino Acid Changes
Résistance aux traitements
206. • Among the 9 patients who received the
triple combination of telaprevir, Peg-IFN2a
and RBV
– 7 patients achieved an SVR
– 1 patient relapsed
– 1 subtype 1b patient stopped antiviral treatment at 6
weeks when HCV RNA was undetectable and
relapsed thereafter
Patients Receiving the Triple
Combination
Résistance aux traitements
207. Weeks
Patient 8
WT
L14F
WT
L14F + V36C
A
B C
A B
CV36C
*
*TVR + Peg-IFN + RBV for 6 weeks
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements
213. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement
218. MK 7009
monotherapy
0
1
2
3
4
5
6
0 50 90 130 170 210 250
Day
logIU/mL
LOQ
MK 7009
+ MK-608 Chimp A
Chimp B
Chimp C
SVR
Olsen et al., APASL 2008
Combinaison de MK-7009 et
MK-608
Résistance aux traitements
219. Prévention de la Résistance
• Réduire au maximum la réplication virale
• Augmenter la barrière pharmacologique
• Utiliser des molécules avec une barrière
génétique élevée
• Compliance
Résistance aux traitements