1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG

2. Listeria
monocytogenes
Giới: Bacteria
Ngành: Fimicutes
Lớp: Bacili
Bộ: Bacilales
Họ: Listeriacae
Chi: Listeria

3. L.Monocytogenes
nìn dưới kình
kiển vi
Nuôi
L.Monocytogenes
L.Monocytogenes
khi nhuộm gram

4. Hình thái
• Hình gậy ngắn, mảnh, gram dương, kị khí tùy ý.
Các thử nghiệm
• Co thử nghiệm catalase (+),oxidase (-) sau 20 giờ nuôi cấy.
• Có khả năng phân giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu, sinh
acid từ rhamnose nhưng không phản ứng với xylose.
• Có phản ứng CAMP (+) với Staphylococus. aureus và (-) với Rhodococus. Equi.
Tính độc
• Gây bệnh Listoriosis với 20%-30% ca tử vong
• L. monocytogenes sống rất dai và có thể phát triển ở 3 đến 450C

5. Nguồn chứa vi khuẩn L. monocytogenes

6. - Sẩy thai
- Thai chết
lưu
- Viêm
não
- Nhiễm
trùng
huyết
Gây các
bệnh -Thường không phát
bệnh, mà ủ bệnh rất
lâu
-Thời gian ủ bệnh
tung bình từ 3 tuần
– 2 tháng.
-Việc chuẩn
đoán bệnh rất
khó
- Gây ra nhiều
biếng chứng sau
bệnh
Khi bị
nhiễm

7. Triệu
chúng khi
nhiễm
• Cảm thấy mệt mỏi, đau nhức như bị cảm cúm
• Sốt nhẹ, nhức đầu, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy
và đôi khi bị chóng mặt.
Ở trẻ sơ
sinh
• Bệnh rất nguy hiểm và có thể có tử số lên đến 30%
Sản phụ
• Có thể bị xảo thai hoặc đẻ ra thai chết
Khả nang
miễn
nhiễm
• Ít thấy có hiện tượng miễn nhiễm sau khi khỏi
bệnh nhưng bệnh nhân vẫn có thể thải vi khuẩn ra
ngoài trong nhiều năm
Bệnh Listeriosis:

8. Nấu kỹ thực phẩm có nguồn gốc
ĐV
Rửa thật sạch rau, nếu quả thì gọt
bỏ vỏ
Thực phẩm phải nấu chin, nếu hâm lại
phải ít nhất 10 phút
Tạo thói quen rửa tay sạch trước khi
chế biến thức ăn
Không dung sữa tươi chưa qua
khâu khử trùng
Tránh dùng thịt cá rã dông nhều lần
Biện pháp phòng tránh:

9. Phát hiện L. monocytogenes dựa
trên phản ứng đặc hiệu với L.
monocytogenes
Phân tích L. monocytogenes với
mồi LM-F76 và LM-R543 đặc hiệu
với gen listeriolysin O (hlyA)
được thiết kế thử nghiệm đặc
hiệu với L. monocytogenes
Mồi được phát triển cho từng
loại sản phẩm thực phẩm, cho
phép phân tích một lượng
mẫu lớn với độ chính xác cao
1. Phát hiện nhanh Listeria monocytogenes
trong thực phẫm thịt, sữa.

10. Mẫu thu
nhận
Tách lấy
dịch
Nuôi cấy
mẫu
Lấy mẫu
sinh vật
sau nuôi
cấy
Chạy PCR
1.2 Quy trình phân tích:

11. Đoạn
mồi
Dựa trên các trình tự gen hlyA của các
chủng L. monocytogenes đã được công
bố trên ngân hàng gen
Hai cặp mồi là LM-F76 và LM-R543
Mồi được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi
cho sản phẩm PCR 468 bp
1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR

12. 1.2.2 Xác định tính đặc hiệu của mồi
Trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger được so sánh với trình tự
các gen đích hlyA của các L. monocytogendduowcsau sau đó dufng kĩ thuật
BLAST. Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt
cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và
không phải L.monocytogenes trong phản ứng PCR.
Khả nang băc cặp được xác định theo phương pháp Sanger

13. Bao bì, dụng cụ được khử trùng trong cồn 70 độ
Cân chính xác khoảng 25g mẫu trong điều kiện vô trùng
Cho vào túi chuyên dụng chứa 225ml môi trùng LBII
Đồng hóa mẫu trên thiết bị dập mẫu Stomacher 400
Phát hiện sự có mặt của L.monocytogenes theo từng qquy trình cho
sữa hay thục phẩm
1.2.3 Tiến hành
- Phương pháp chuẩn bị mẫu

14. 25g mẫu được trộn hay dập nát trong máy
Stomacher 400
Tăng sinh trong thiết bị ổn định nhiệt ở
37 độ
Tốc độ lắc 200 vòng/phút trong
20h-24h
1.2.3 Tiến hành
- Tăng sinh

15. DNA thu nhận từ L.monocytogenes đươc đem đi làm sạch trong chloroform
hoặc xử lí nhiệt ở 100 độ C trong 10 phút để phá màng tế bào, giải phóng
DNA
Ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, thu dịch chứa DNA sau
khi ly tâm
Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi
(0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 mM/mỗi loại).
1.2.3 Tiến hành
- Phản ứng PCR và xử lý kết quả

16. - Đánh giá kết quả: các mẫu
xuất hiện các băng DNA
tương ứng với vị trí 468bp
trong các phản ứng PCR với
cặp mồi là các mẫu bị nhiễm
L. monocytogenes
Kết quả phản ứng PCR với
khuôn DNA tinh sạch được
thể hiện trong hình 1-giếng 2
cho thấy một băng DNA có
kích thước nằm trong khoảng
kích thước sản phẩm PCR
thiết kế.
Hình 1
1.Thang DNA chuẩn
2.Mẫu chuẩn dương tính
3.Mẫu chuẩn âm tính
468 bp
400 bp

17. 2. Quy trình phân tích L. monocytogenes theo
truyền thống
2.1 Nguyên lý phương pháp
Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria
monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên
biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.
Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria
monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá
học.

18. 2.2 Dụng cụ, môi trường và thuốc thử
2.2.1 Môi trường, thuốc thử
- Nước Pepton 0,1 %.
- Thạch Oxford.
- Thạch Tryptone soya có 0,6% cao men (yeast extract)
-TSA-YE.
- Canh thang Tryptone soya có 0,6% cao men (TSB-
YE)
- Thạch máu cừu.
- Môi trường SIM.
- Môi trường Clurk-Lubs.
- Canh thang đường Manitol, Xylose, Rhamnose 5%, có
chỉ thị màu Bromocresol và ống Durham.
- Bộ thuốc nhuộm Gram.
- Hydrogen Peroxide 3%

19. 2.3 Tiến hành
2.3.1. Bước 1 :
- Đánh dấu lên đĩa thạch nồng độ dung dịch mẫu
thử.
- Dùng pipet 1ml vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ
dung dịch thử 10-1 , nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chọn
lọc đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương
ứng.
- Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy thuỷ tinh ria
đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt thạch
sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều
- Ủ ở 370C/48giờ.

20. 2.3.2. Bước 2:
Đọc kết quả sơ bộ sau 48 giờ.
- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có đặc tính: Tròn đều,
màu nâu đen hoặc xanh đen. Đường kính: 2-3 mm
và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen
với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống. Đây là đặc
điểm đặc trưng của giống Listeria.

21. Tính kết quả theo công thức (tài liệu TN Vi sinh) :
Trong đó:
-A : Số tế bào vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
trong 1ml mẫu; CFU/ml
- N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp đã
chọn.
- V: Thể tích mẫu cấy trên môi trường đĩa.
- n1 : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng ban đầu.
- ni : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng thứ i.
- fi: Hệ số pha loãng tương ứng
VfnVfn
N
A
ii

...... 11

22. 2.3.3. Bước 3: Tăng sinh thuần chủng và xác định
hình thể, tính chất bắt màu.
2.3.3.1. Tăng sinh thuần chủng:
- Lấy khuẩn lạc điển hình từ thạch chọn lọc cấy vào
môi trường TSA-YE và ủ ấm ở 370C / 24h thu được
khuẩn lạc thuần nhất tròn, trong, bóng và hơi lồi.
2.3.3.2. Hình thể và tính chất bắt màu:
Từ khuẩn lạc thuần nhất nhuộm Gram xem hình thể:
Nhuộm Gram sau 16 - 24h nuôi cấy thấy: Trực
khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm Gram. Đường
kính 0,4 - 0,5 mm và dài 0,5 - 2 mm.

23. - Soi tươi trên lam kính xem tính chất di động:
+ Lấy 1 khuẩn lạc mọc trên TSA-YE cấy vào
môi trường canh thang TSB-YE. Để ở 25oC qua
đêm.
+ Canh trùng được soi tươi trên lam kính thấy :
Hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn
nhẹ hoặc nhào lộn. Di động kiểu bơi không phải
là giống Listeria.

24. 2.3.4 Bước 4: Tính chất sinh vật hoá học:
2.3.4.1.Tính chất di động trên thạch SIM :
- Lấy canh trùng từ TSB-YE cấy vào môi trường
thạch SIM .
- Ủ ấm : 2-7 ngày ở 25oC. Thấy di động tạo hình cái ô.
2.3.4.2.Tính chất lên men đường: Xylose, Rhamnose,
Manitol.
- Dùng canh thang có chỉ thị màu Bromocresol và có
ống Durham để xác định tính chất lên men các loại
đường.
- Để các ống canh trùng thử khả năng lên men đường
ở tủ ấm 35oC / 4 - 7 ngày.
- Quan sát hàng ngày (24-48h) để xem sự thay đổi
màu (kết quả (+) màu vàng ) và sinh hơi.

25. Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes
trong thực phẩm:
Danh mục Giới hạn
(LM)
Tình trạng
GMP
Hành động cần
thiết
Thực phẩm làm sẵn, là nguyên
nhân liên kết với bệnh
Listeriosis (như phó-mát, pa-tê
gan, xà lách trộn hạn sử dụng
>10 ngày, sản phẩm thịt lợn).
> 0 cfu/50g n/ad Loại I: Thu về
đối với việc bán
lẻ.
Tất cả các loại thực phẩm làm
sẵn khác hỗ trợ cho sự tăng
trưởng của
Listeria monocytogenestrong
điều kiện làm lạnh và hạn sử
dụng >10 ngày.
> 0 cfu/25g n/a Xem xét, báo
cáo cộng đồng,
theo dõi tại nhà
máy.
Loại II: Thu hồi
sản phẩm.

26. Thực phẩm làm
sẵn hỗ trợ cho sự
tăng trưởng của
Listeria monocyto
genestrong điều
kiện làm lạnh và
hạn sử dụng ≤ 10
ngày và tất cả các
loại thực phẩm
khác không hỗ trợ
cho sự tăng
trưởng của
Listeria monocyto
genes.
<= 100 cfu/gc Đạt GMP. Xem xét, báo
công cộng, theo
dõi tại nhà máy.
Cho phép bán
<= 100 cfu/gc
Không đầy đủ
hoặc không có
GMP.
Xem xét thu hồi
loại II
hoặc ngừng bán.
Loại II: Thu hồi
hoặc ngừng bán.
>= 100 cfu/gc n/a