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Seminário - Imunologia.pptx
- 2. Introdução O vírus •Vírus da Hepatite C – HCV •Família – Flaviviridae •Gênero – Hepacivirus •Se aloja no fígado •Sofre mutações com alta frequência A doença •Uma das mais severas infecções transmitidas pelo sangue; •Cerca de 3% da população mundial está infectada; •Cerca de 170 milhões de pacientes crônicos tem o risco de desenvolver cirrose ou câncer de fígado.
- 3. A Inflamação do Fígado Infectados por HCV 75–85% Infecção Crônica 2/3 doenças do fígado 5 a 20% cirrose Existência persistente do vírus no corpo por mais do que 6 meses
- 5. Diversos estudos correlacionam a Hepatite C crônica com os elevados níveis de citocinas inflamatórias •Múltiplas vias de sinalização do sistema da imunidade inata são ativadas em resposta à infecção pelo vírus • Sabe-se que um dos mediadores fundamentais da imunidade inata contra infecções virais é o processamento e liberação de citocinas pró- inflamatórias •HCV aumenta os níveis de citocinas proinflamatórias como IL - 1β nos macrófagos do fígado via ativação do inflamassomo NLRP3 O mecanismo molecular no qual o HCV estimula a inflamação hepática ainda não foi esclarecido A Inflamação do Fígado
- 6. Citocina multifuncional Envolvida na inflamação, angiogênese e resposta imune antiviral Presente tanto na inflamação aguda, quanto crônica IL-1β
- 7. PAMPs TLR NF-kB RNAm IL- 1 β Precursores da IL-1 β Inflamassomo NLRP3 Caspase 1 Toxinas microbianas Danos na membrana lisossomal Atividade da p7 Produção de IL-1β A produção de IL-1β ativa requer 2 sinais: IL-1β ATIVA Para infecções por HCV, o mecanismo de ativação do NLRP3 não está esclarecido
- 8. A Viroporina do HCV •O HCV possui genoma de RNA •Uma única ORF que codifica uma poliproteína com cerca de 3000 aminoácidos Adaptado de Scheel and Rice, 2013
- 9. A Viroporina do HCV •63 aminoácidos •Classe II A •Possui seletividade para cátions (Ca2+, K+ e Na+) e condutância intracelular de H+ •Tem sido estudada como um potencial alvo de drogas anti-HCV Adaptado de Nieva et al, 2012
- 10. •Afeta a permeabilidade da membrana e o gradiente de pH de diversos compartimentos celulares •Ajuda na montagem e liberação do vírus Adaptado de Nieva et al, 2012
- 11. A pesquisa Propõe que: •A atividade da p7 pode fornecer o segundo sinal para a produção de IL-1β em macrófagos do fígado. •Essa atividade altera o pH intracelular, tornando-se um possível mecanismo patológico para a inflamação associada à Hepatite C
- 12. Hipótese: p7 atua como um canal de prótons, afetando o pH intracelular Método: •Construção de p7 de 4 diferentes genótipos expressadas em células HEK 293 •pH intracelular monitorado através de uma sonda com alta fluorescência em condições ácidas e em menor intensidade em condições neutras ou básicas Resultados: •A expressão de p7 reduziu significativamente a intensidade de fluorescência para todos os genótipos, comparado ao controle •Isso indica que houve perda da acidez na presença de p7 Alteração do pH intracelular
- 13. Farag et al, 2017
- 14. Produção de IL-1β Hipótese: p7 possui papel na ativação do inflamassomo NLRP3 através do transporte de H+ Método: •Construção de p7 de 4 diferentes genótipos expressadas em macrófagos RAW 264.7 com iniciador LPS •24 h após a transfecção, o sobrenadante foi coletado e a presença de IL-1β foi analisada usando o método de ELISA •Tratamento com a droga Rimantadina, para confirmar o efeito da p7 nos níveis de IL-1β •Tratamento com Monensina, um carreador que simula a atividade de p7 através da exportação de H+ Resultados: •A expressão de p7 aumentou significativamente os níveis de IL-1β nos macrófagos com iniciador LPS; •O transporte de H+, bem como a alteração do pH vesicular causada por p7 pode engatilhar a ativação do inflamassomo e contribuir para a produção de IL-1β
- 15. Farag et al, 2017 Produção de IL-1β
- 16. Farag et al, 2017 Produção de IL-1β
- 17. Conclusão O trabalho analisou o papel da proteína p7 de HCV como um canal de íon intracelular e sugere um papel desta proteína na resposta imune e subsequente inflamação à infecção por HCV; Este é o primeiro trabalho de expressão da p7 recombinante em linhagem de células de macrófagos do fígado; Confirma a hipótese de que a atividade de p7 pode fornecer o segundo sinal para a produção de IL-1β nos macrófagos; Esses resultados suportam a classificação da viroporina p7 como um importante mediador da infecção por hepatite C e sua progressão para inflamação e cirrose; Com isso, p7 é marcada como um importante alvo para o desenvolvimento de novas drogas contra a Hepatite C.
- 18. Referências Yang O., et al. Unusual architecture of the p7 channel from hepatitis C virus. Nature, 498(7455), 2013. doi:10.1038/nature12283. Scheel T. K. H. and Rice C. M. Understanding the hepatitis C virus life cycle paves the way for highly effective therapies. Nature Medicine, v. 19, n. 7, p. 837 – 839, 2013. doi:10.1038/nm.3248. Nieva J. L. et al. Viroporins: structure and biological functions. Nature Reviews Microbiology, v. 10, p. 563 – 574, 2012. doi:10.1038/nrmicro2820 . Farag et al. The p7 viroporin of the hepatitis C virus contributes to liver inflammation by stimulating production of Interleukin-1β. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1863, p. 712–720, 2017. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.12.006. Imagens https://www.liverdoctor.com/liver-problems/hepatitis-c/ http://www.abcam.com/il1-beta-antibody-ab9722.html
Notas do Editor
- ab9722 staining IL1 beta (green) in murine macrophage cells by Immunocytochemistry/ Immunofluorescence.
- PAMPs (pathogen associated molecular patterns) intracellular multimeric complex of the Nod-like receptor (NLR) inflammasome 1° sinal é induzido pelo reconhecimento dos PAMPs que estimula os receptores Toll-like Isso leva à ativação do NF-kB e aumenta a expressão de RNAm IL-1β Os precursores da citocina inflamatória IL-1β são então processados pela caspase – 1 que é ativada por autoclivagem através do inflamassomo NLR 2° é necessário para estimular o domínio de pirina da família NLR (NLRP3) que é requerido para ativação do IL-1β – diversas moléculas agem como segundo sinal, incluindo toxinas microbianas, miatotoxinas, autolisinas e nigericina. Também, danos a membrana lisossomal podem agir assim.
- Extremidades N e C terminal ficam expostas no lúmen do Retículo Endoplasmático.
- Fig. 2. Live cell fluorescence imaging of HEK 293 cells expressing genotype-specific constructs of p7. (A) Cells transfected with p7 cDNA constructs for genotypes 1a, 2a, 3a and 4a, and loaded with 2 μM LysoSensor Green DND-189 at pH 7.4 are shown.Wavelengths used were λ = 443 nm (excitation) and λ = 500 nm (emission). Controls include untransfected HEK 293 cells as well as cells transfected with glycine receptor α1 subunits (mock transfection). Images were taken in the absence and presence of 100 μM rimantadine. Images show transmission and fluorescence channels. Genotypes and treatments are indicated. Scale bar is 10 μm. (B) Co-staining of HEK 293 cells expressing p71a constructs, and untransfected cells in presence and absence of rimantadine. Cells were loaded with 2 μm LysoSensor Green DND-189 and costained with Hoechst nuclear stain (1 μg/ml for 5 min). Wavelengths used were λ = 443 nm (excitation) and λ = 500 nm (emission) for LysoSensor Green DND-189 and λ = 361 nm (excitation) and λ = 497 nm (emission) for the Hoechst dye.
- Fig. 4. P7-mediated production of IL-1β in a recombinant system. (A) LPS-primed RAW264.7 cellswere transfectedwith p7 cDNA constructs of different HCV genotypes and production of IL-1β was assayed in presence and absence of 100 μMrimantadine (Rim) by ELISA. Data presents average IL-1β levels fromthree independent experiments, each run in duplicates, (***= p b 0.001, ns=not significant, one-way ANOVA). (B) IL-1β production in LPS-primedmacrophages by tranfection of p71a constructs, ormonensin, or both. Significance of differences of monensin or monensin/p7 treatment relative to p71a alone are given (** = p b 0.01; *** = p b 0.001, ns= not significant, one-way ANOVA).