Osteoinmunología: Genómica y Proteómica @munevarjuan

1. Osteoinmunología
Profesor. Dr Juan Carlos Munévar N
Residente: Dr. Ricardo Yépez

2. Contenidos
Genómica ósea
BMPs
Proteómica ósea
Conclusiones

4. Generalidades
– La integridad ósea se mantiene por un proceso
dinámico de resorción y formación ósea
“Remodelado óseo”
• Osteoclasto única célula cuya función es destrucción
continua de lo propio
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

5. Osteopetrosis (pérdida)
Osteoclasto
Osteoporis (resorción>remodelado)
Osteoblasto
Otoesclerosis (ganancia)
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

6. Vía OPG/RANK/RANKL diferenciación osteoclástica
GC glucorticoides
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

7. Osterix y Runx2 y diferenciación osteoblástica
SP7
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

8. Regulación osteoclástica
– Derivado monocitos
– Célula gigante multinucleada
– En contacto con superficies óseas calcificadas
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

9. Regulación osteoclástica
– Factores de transcripción involucrados
• Pu.1
• C-fos
• NF B
– Tiene motif de unión a DNA
– Dímero de varias proteínas
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

10. Control genético diferenciación osteoclástica
Célula precursora mieloide
PU.1 c-Fos M-CSF
Progenitor osteoclástico Monocito/macrófago
NF
RANK c-Fos
RANKL/ODF mi
OPG/OCIF
Osteoclasto funcional ESTADO FUNCIONAL
c-Src, c-Cbl, Pyk2, catepsina K
ODF osteoclast differentiation factor
OCIF osteoclastogenesis inhibitory factor
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

11. Regulación de la maduración y función osteoclástica
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

12. Regulación osteoblástica
– Origen mesenquimal
– “Fibroblasto sofisticado”
– Función
• Formación ósea
– Deposito de matriz ósea
• Crecimiento longitudinal óseo
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

13. Regulación osteoblástica
– Genes
• Cbfa1 (papel central) / Runx2
– Diferenciación osteoblástica y depósito de matriz ósea
– Master gene
• Ihh (Indian hedge-hog)
• BMP (bone morphogenetic protein)
– Familia de TGF
• Bone sialoprotein
• Osteocalcina
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

14. Control genético diferenciación osteoblástica
Célula precursora mesenquimal
Cel. Precursora Osteo-condro
RUNX2 Ihh
Progenitor osteoblástico Progenitor osteoblástico Condrocito
Osteoblasto funcional RUNX2 Osteoblasto funcional
Osificación intramembranosa Osificación endocondral
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

15. Regulación endocrina
– Hueso reservorio del 99% de calcio sérico
– Hipercalcemiantes
• PTH
– Favorece recambio óseo y limita volumen óseo
• Vitamina D3 (1,25(OH)2)
– Favorece absorción intestinal de Ca
– Inhibidor de diferenciación osteoblástica
– Su falta = raquitismo (reversible)
• PTHrP (related peptide)
– Ligando que controla diferenciación condrocito
– Hipocalcemiantes
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

16. Regulación endocrina
– Hormonal
• Estrógenos
– Importante para prevención de osteoporosis
– No se conoce receptor de estrógenos en osteoblasatos u
osteoclastos
– Receptor intracitoplasmático
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

17. Análisis genético de función esquelética
– Otras funciones células esqueleto
• Crecimiento óseo
• Mineralización ósea
• Remodelamiento óseo
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

18. Crecimiento longitudinal
– Espículas óseas en metáfisis
• Condrocito
• Osteoblasto
– Crecen y funcionan como gato hidráulico para
mover la placa de crecimiento de manera
centrífuga
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

19. Mineralización ósea
– Bone sialoprotein y osteopontina son
insuficientes para mineralización ósea
– Calcio y fosforo pueden precipitarse de manera
pasiva sobre el colágeno (Glimcher), elastina y
fibronectina
• MGP (Matriz GLA protein)
– Presente en matríz extracelular de arterias y cartílago pero no
en hueso
– Su deleción en murinos lleva a clasificación masiva
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

20. Matriz extracelular
– Proteínas colágeno y no colágeno
– Osteocalcina
• Proteína específica del osteoblasto
– Osteopontina
• Puente entre la superficie y los cristales de
hidroxiapatita
• Motivo RGD unión integrina osteoblastos
Karsenty, Gerard. Genes & Development. 1999:3037-3051.

21. Condrocito hipertrófico
Resorción
Osteoblasto MMP9
Formación Condroclasto
Célula endotelial
Vascularización
VEGF Matriz de cartílago
Receptor VEGF Matriz reabsorbida
Vaso sanguíneo Matriz ósea
Papel del VEGF en el control del crecimiento longitudinal

23. Historia
– Descrita inicialmente como moléculas que
inducían formación de cartílago y hueso ectópico
en murinos
• Altamente conservada entre especies animales
Bubnoff, A et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

24. Estudio experimental modelo murino Urist 1971
OC osteocito
NB nueva matriz ósea calcificada
NC nueva matriz ósea no calcificada
OM vieja matriz ósea con
depósitos de minerales en
contacto con hueso nuevo

25. Generalidades
– BMPs (Bone morphogenetic proteins)
• Factores de crecimiento. Peso 30.000 Da
• Moléculas de señalización con acción local en células
diana que afectan su sobrevida, proliferación y
diferenciación
• Miembro de la familia TFG
– Exepto BMP 1 (MPP)
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

26. BMPs (Bone morphogenetic proteins)
• Acción sobre varios tipos de células
– Capacidad de inducción de formación de
» HUESO, CARTILAGO, TEJIDO CONJUNTIVO
• Aislada en más de 40 tejidos diferentes
• BMP-1 a BMP-7 propiedades osteoinductivas
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

27. BMPs y la diferenciación osteoblástica

29. BMPs
BMPRs
Proteínas Smad 1,5, 8
Patrones:
corazón, sistema
nervioso, cartílago, hueso y
esqueleto
Dental, hematopoyético, anexos, m
etabolismo hierro, hemostasia
vascular
http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna_morfog%C3%A9nica_%C3%B3sea_(BMP)

30. Función
– Diferenciación celular
– Sobrevida celular
– Proliferación celular
– Apoptosis
– Interacción con células mesenquimales epiteliales
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

31. Función
– Patterning (determinación de patrones)
• Dorsal – ventral (mesodermo embrionario temprano)
• Desarrollo de extremidades
• Generación de
– Células germinales primordiales
– Desarrollo dental
– Regulación de apoptosis
Bubnoff, A et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

32. BMPs en esqueletogénesis
– Papel importante en redes de señalización
– Diferenciación osteoblasto y condrocito
– Formación ósea
– Patterning de mesodermo
– Desarrollo craneofacial y de extremidades

33. BMPs
– Diferentes destinos
• Acción local
• Unirse a antagonistas extracelulares
• Interactuar con proteínas de matriz extracelular
– Secuestran o incrementan actividad BMP
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

34. Receptor BMP
– Tipo serina-treonina cinasa
• Tipo I
– Alk3
– Alk6
– Alk2
• Tipo II
– Se requieren de los dos receptores para la
trasducción de la señal
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

36. Vía de señalización
– Tipo serine-teonina kinasa
• Tipo I
– Al activarse reconocen y forforilan R-Smads (receptor-
regulated Smads)
– Traslocación complejo R-Smad/Smad4
– Proteínas Smads y reguladores son importantes
para la especificidad de la respuesta
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

37. Señalización BMP por vía Smad hacia núcleo

38. Vía BMP-Smad canónica y BMP-MAPK
MAPK (Mitogen-activated protein kinase)
Fosforilación
Receptor tipo I
Bubnoff, A. et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

39. Vía BMP-Smad y factores nucleares
Bubnoff, A. et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

40. Vía de señalización
– Interrelación con otras vías de señalización
• Wnt/b-Catenina
– Glicoproteinas secretadas
• Ca2+/calmodulina
– Principal receptor intracelular de Ca2+
• Wnt/Ca2+
• Erk-MAPK
– Media los efectos de algunos receptores tirosin quinasa
• JAK-STAT
– “Fast track” como en Smads
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

41. Antagonistas BMPs
– BMP pro regiones que se unen a BMP maduro
creando molécula inactiva
– Ligandos antagonistas que se unen a BMP y lo
secuestran
• Noggin, gremlin, folistatin, cordina, cerberus
– Receptores antagonistas que previenen unión a
BMP
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

42. Inhibidores BMPs
– BAMBI
• Activin membrane bound inhibitor
• Secuencias similares a TGF-
– Falta dominio intraceular kinasa
– I-Smads
• Inhibitory Smads (I-Smads)
• Incluye Smad6, Smad7
Bubnoff, A et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

43. Antagonistas BMPs
– SMURFS
• Smurf1 (Smad ubiquitination regulatory factor-1)
• Famila clase HECT (homologus to E6-associated protein
C terminus) de E3 utibuitina ligasa
– Ski
• Co represor transcripcional de señalización BMP-Smad
en el núcleo
• Producto de oncogen retroviral (v-ski)
Bubnoff, A et al. Developmental Biology. 2001;14:1-14.

44. Antagonistas BMPs
– Tob
• Suprimen crecimiento celular cuando se sobre expresa
en células NIH3T3
– Zinc finger protein OAZ (Olf-1/EBF associated zinc
finger)
• Cofactor de unión al DNA asociado directamente con
dominio MH2 de Smad1 in vitro
Rosen, Vicki. Annals of the New York Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.

45. I-Smads vía de inhibición

46. BMPs aproximación a reumatología
– BMPs tienen papel diferente de acuerdo a la
patología
• BMP7 puede inducir protección al cartílago
• Inhibición de BMP puede ser útil para limitar la
progresión del daño articular en espondilitis
anquilosante
• Opción terapéutica llamativa en osteoartritis

47. BMPs como moléculas de protección del cartílago. Inyección intra articular
BMP2 induce anabolismo y formación de osteofitos, BMP7 no induce osteofitos.
Alta expresión de GDF5 se asocia a incidencia disminuida de OA
Gen de susceptibilidad para OA
Modelos murinos

48. Remodelación ósea en artritis. BMPs inhibido por noggin tiene papel en la
formación de la entesopatía. TGF estimula la formación de osteofitos.
Inhibición de Dickkopf-1 (DKK1) estimula la formación de osteofitos.

50. Definición
– PROTEÓMICA
• Análisis de la expresión de proteínas a nivel post
transcripcional
• Cambio constante de acuerdo a las interacciones
bioquímicas con el genoma y medio ambiente
• Muy diversa
– Splicing
– Modificaciones post transcripcionales de las proteínas
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

51. Nuevas técnicas en estudio de
proteínas
– Electroforesis de dos dimensiones 2DE
– Cromatografía líquida
– Espectometría en masas
• Isotype-labeled
• Labeled-free
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

52. Papel en osteoinmunología
– Estudio de biomarcadores
– Estudio de señalización intracelular
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

53. Proteómica en enfermedad ósea
– Estudios in vitro
– Aproximación sistemática de mapeo cualitativo y
cuantitativo de un proteoma completo en
estudios de gran escala
• 2DE más MS
• Expresión de perfiles normal contra estados patológicos
• Patologías
– Sarcoma óseo, osteoartritis, osteonecrosis de cabeza femoral
– Compararlo con tejidos normales
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

54. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

55. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

56. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

57. Células mesenquimales y osteoblastos
– Ostoclastos
• Células madre hematopoiéticas
– Monocitos
• Resorción ósea
– Osteoblastos
• Células mesenquimales pluripotenciales
• Formación ósea
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

58. Células mesenquimales y osteoblastos
– Proteínas asociadas
• Sobre expresión
– Calmodulina
– Proteína del complejo T subunidad 1
• Expresión disminuida
– Receptor de mineralocorticoides
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

59. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

60. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

61. Proteómica de osteoclastos
– Células resortivas de la familia monocito-
macrófago
– Proteína de membrana
• Nheddc2; proteína de canal intercambiador Na+/H+
– Estimuladas por
• Osteoblastos
• M-CSF
• RANKL
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

62. Proteómica de osteoclastos
– Expresa proteínas para la diferenciación a
osteoclasto
• Catepsina
• Osteopontina
• Legumaina
• Proteína inflamatoria 1
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

63. Proteómica de osteoclastos
– Entender la vía de señalización OPG/RANKL/RANK
puede suministrar dianas terapéuticas para el
tratamiento de enfermedades óseas
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

64. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

65. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

66. Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

67. Aplicaciones
– Proteómica útil en la determinación dinámica de
la expresión de proteínas en patologías
• Osteoporosis
• Recambio óseo
• Señalización intracelular
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

68. Aplicaciones
– Aproximación cuantitativa de marcador de
osteoclastos
• Vacuolar
• H-ATPasa
• Catepsina K
• Marcador de maduración
– Gelsolina
– arp 2/3
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

69. Aplicaciones
– Células mesenquimales sobre expresan
• Calmodulina
• Proteína 1 a complejo T
• Tropomiosina
• Asociadas con ciclo y proliferación celular
Zhang et al. Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-111.

70. Conclusiones
Existe una variada cantidad de genes involucrados
con la biología ósea
Proteómica como herramienta de nueva generación
para diagnóstico y tratamiento de enfermedades
óseas

71. Conclusiones
BMP como moléculas de señalización que afectan la
sobrevida, proliferación y diferenciación de varios tipos celulares
BMP como miembro de la familia TFG
BMP importante en la determinación de patrones y en
embriogénesis
BMP importante en la diferenciación del osteoblasto y condrocito, y
en el desarrollo craneofacial y de extremidades
BMP tiene múltiples vías de regulación

72. Bibliografía
• Karsenty, Gerard. “The genetic transformation of bone biology The genetic
transformation of bone biology.” Genes & Development. 1999:3037-3051.
• Zhang, Hengwei, Robert Recker, Paul Lee Wai-Nang, and Gary guishan
Xiao. “Proteomics in bone research.” Expert Rev Proteomics. 2010:7;103-
111.
• Rosen, Vicki. “BMP and BMP inhibitors in bone.” Annals of the New York
Academy of Sciences. 2006;1068:19-25.
• Bubnoff, Andreas Von, and Ken W Y Cho. “Intracellular BMP Signaling
Regulation in Vertebrates : Pathway or Network ?” Developmental Biology.
2001;14:1-14.