Dokumen tersebut membahas beberapa metode analisis protein dan senyawa bernitrogen secara kualitatif dan kuantitatif, termasuk metode Kjeldahl, Biuret, dan Lowry."

1. Analisis Protein dan
Senyawa Bernitrogen
EVY ROSSI
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU
SEMESTER GANJIL 2010/2011

2. Analisis Protein dan Senyawa
Bernitrogen dapat dilakukan dengan
beberapa Methode
1.Secara kualitatif terdiri atas ;
a. reaksi Xantoprotein
b. reaksi Hopkins-Cole
c. reaksi Millon
d. reaksi Nitroprusida
e. reaksi Sakaguchi
2.Secara kuantitatif terdiri dari ;
• metode Kjeldahl
• metode spektrofotometri visible (Biuret)
• metode Lowry
• metode titrasi formol
• metode spektrofotometri UV.

3. Methode Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke
dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih
yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi
yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada
molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang
mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan
dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat.
Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium
dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole,
asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk
lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan
terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

4. 3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat
dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada
larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang
dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada
dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena
terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil
yang berwarna.
4. Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan
menghasilkan warna merah dengan protein yang
mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang
mengandung sistein dapat memberikan hasil
positif.

5. 5.Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan
natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini
memberikan hasil positif apabila ada gugus
guanidin. Jadi arginin atau protein yang
mengandung arginin dapat menghasilkan warna
merah.
6.Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH
kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji
ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa
yang mengandung gugus amida asam yang berada
bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan
reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya
warna merah violet atau biru violet.

6. Methode Kjeldahl
• Metode Kjeldahl merupakan metode yang
sederhana untuk penetapan nitrogen total
pada asam amino, protein dan senyawa
yang mengandung nitrogen.
• Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan
dikatalisis dengan katalisator yang sesuai
sehingga akan menghasilkan amonium
sulfat.

7. • Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang
terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam
larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
• Metode ini telah banyak mengalami modifikasi.
• Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab
hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang
sedikit dan waktu analisa yang pendek.

8. Prinsip
• Penetapan nilai protein kasar dilakukan
secara tidak langsung, karena analisis ini
didasarkan pada penentuan kadar
nitrogen yang terdapat dalam bahan.
• Kandungan nitrogen yang diperoleh
dikalikan dengan angka 6,25 sebagai
angka konversi menjadi nilai protein.
• Nilai 6,25 diperoleh dari asumsi bahwa
protein mengandung 16% nitrogen
(perbandingan protein : nitrogen =100 :16
= 6,25:1).

9. • Angka 6,25 berasal dari angka konversi
serum albumin yang biasanya mengandung
16% nitrogen.
• Untuk beras, kedelai, dan gandum angka
konversi berturut-turut sebagai berikut:
5,95, 5,71, dan 5,83.

10. Alat dan Bahan Sulfat pekat
Alat :
Asam
• Labu Kjeldahl 300 mL
• Satu set alat
destilasi
• Erlenmeyer 250 cc
• Buret 50 cc skala
0,1 mL
• Timbangan analitik
• Asam Chorida ( yang sudah
diketahui normalitasnya)
• Natrium Hydroxsida 40%
• Katalis campuran (yang dibuat
dari CuSO4.5H2O dan K2SO4
dengan perbandingan 1:5
• Asam borax 5%
• Indikator Bahan ( zat kimia) :
• campuran ( brom cresolgreen :
Methyl merah = 4 : 5. sebanyak
0,9 gram campuran dilarutkan
dalam alkohol 100 mL)

11. Prosedur Analisis
1. Destruksi
•
Timbang contoh sampel kering
oven sebanyak ± 1 gram ( catat
sebagai A gram).
• Masukan ke dalam labu
kjeldhal dengan hati-hati, dan
tambahkan 6 gram katalis
campuran.
• Tambah 20 mL Asam Sulfat
pekat.
• Panaskan dalam nyala api kecil
di lemari asam. Bila sudah tidak
berbuih lagi destruksi
diteruskan dengan nyala api
yang besar.
• Destruksi sudah di anggap selesai
bila larutan sudah berwarna hijau
jernih, setelah
itu dinginkan

12. 2. Destilasi
• Siapkan alat destilasi
selengkapnya, pasang
• Basakan larutan bahan dari
destruksi dengan menambah
dengan hati-hati jangan
40-60 mL NaOH 40% melalui
lupa batu didih, vaselin
corong samping. Tutup kran
dan tali pengaman
• Pindahkan larutan hasil
corong segera setelah larutan
didih, kemudian bilas
tersebut masuk ke
labu didih
• Nyalakan pemanas bonsen dan
dengan aquades sebanyak
alirkan air ke dalam kran
destruksi ke dalam labu
lebih kurang 50 mL.
• Pasangkan erlenmeyer
yang telah diisi asam borax 5%
sebanyak 5 mL untuk
menangkap gas amonia, dan
telah diberi indikator
campuran sebanyak 2 tetes.
pendingin tegak.
• Lakukan destilasi sampai semua N dalam
larutan dianggap telah tertangkap oleh
asam borax yang ditandai dengan
menyusutnya larutan dalam labu didih
sebanyak 2/3
bagian (atau sekurang-kurangnya sudah
tertampung dalam erlenmeyer sebanyak 15
mL

13. Titrasi
• Erlenmeyer berisi sulingan tadi
diambil (jangan lpa membilas
bagian yang terendam dalam air
sulingan)
• Kemudian titrasi dengan HCl
yang sudah diketahui
normalitasnya catat sebagai B,
titik titrasi dicapai dengan
ditandai perubahan warna hijau
ke abu-abu. Catat jumlah
larutan HCl yang terpakai
sebagai C mL

14. • Akhir titrasi ditandai dengan tepat
perubahan warna larutan menjadi merah
muda dan tidak hilang selama 30 detik bila
menggunakan indikator PP.
% N = ml HCl (sampel-blanko)
x B
Berat sampel (g) x 1000
B = Normalitas HCl x 14.008 x 100%
% protein = % N x faktor protein (6,25)

15. 2. Metode Spektrofotometri Visible
(Biuret)
• Methode ini adalah salah satu cara terbaik untuk
menentukan kadar protein suatu larutan.
• Methode ini memerlukan 1-10 mg protein per ml
• Dalam kondisi zat alkali (Cu 2+) yang membentuk
kompleks dengan ikatan peptida yang menghasilkan
warna ungu dengan absorban pada 540 nm.
• Hanya sedikit senyawa-senyawa lain yg mengganggu
reaksi misalnya: urea yang mengandung gugus CO dan
NH dan gula pereduksi yang mengandung ion Cu 2+
• Pereaksi : Larutan Biuret dan larutan protein standar
berupa larutan bovine serum albumin dlm air

16. Peralatan
• Spektofotometer
• Sentrifuse
•Waring Blender

17. Prosedure
Pembuatan reagen Biuret :
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan
kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml
aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30
ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok,
selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda.
Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):
Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam
aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0%
(Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) :

18. Pembuatan kurva Standar :
1. Masukkan ke dlm tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8
dan 1 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volume
totalnya masing-masing 4 ml.
2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dlm masing2 tabung reaksi dan
homogenkan.
3. Simpan tabung reaksi pada suhu 37oC selama 10 min. atau pd suhu
kamar selama 30 min. Kemudian ukur absorbannya pada 520 nm.

19. Cara mempersiapkan sampel
:
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal
albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat
kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu
Sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).
• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm
selama 10 menit, pisahkan supernatannya.
• Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan
kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml.
• Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif
kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah
dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
• Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca
absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko
yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan
adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat
mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva standar.

20. 3. Methode Lowry
Prinsip
• Reaksi antara Cu 2+ dgn ikatan peptida dan reduksi asam
fosfo monolobdad dan asam fosfotungstat oleh tirosin
dan triptofan yang akan menghasilkan warna biru.
• Warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin
dan triptofan
• Lebih sensitif (100x) dari methode Biuret.

21. Prosedur :
Pembuatan reagen Lowry A :
Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam
fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
Pembuatan reagen Lowry B :
Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml
natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam
larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1%
dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%

22. Prosedur
Pembuatan kurva Standar
Siapkan larutan bovin serum albumin dengan
konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri
konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan
komposisi berikut :
Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8
ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10
menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry
A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca
absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm
tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung
reaksi no.1 pada tabel di atas)

23. Penyiapan Sampel
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang
terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan
penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya
tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai
mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).
• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus
11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan
supernatannya.
• Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian
dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5
misal sampai 10,0 ml.
• Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan
selanjutnya seperti pada kurva standar mulai dari
penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai
seterusnya.