Reacción en cadena de la polimerasa Introduccion Concepto fundamentos Aplicaciones Materiales Etapas Ventaja/Desventada

1. Universidad Autónoma deYucatán
Facultad de Odontología
Reacción en cadena de la
polimerasa
Equipo 2
Carlos Cetina
Bibiana Dzib
Mariceli López
Conocida como PCR por, es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1987 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un
gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo
de un mínimo.
En teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Maria Jose Nuñez
Jordan Rodríguez
Aleika Romero
Miguel Villaseñor

2. Concepto
Fundamentos de la técnica
Reacción en
cadena de la
polimerasa (PCR)
Miguel Villaseñor
Utilidad
Índice
Maria Jose Nuñez
Aleika Romero
Elementos que se requieren
para realizar la prueba
Carlos Cetina
Material y Equipo
Jordan Rodríguez
Etapas de la Técnica
Mariceli López
Ventajas y Desventajas
Bibiana Dzib
Conclusión

3. Concepto

4. ¿Qué es PCR?
 La reacción en cadena de la
polimerasa es considerada
una técnica biotecnológica
cuya finalidad es la
amplificación o
reproducción in vitro de un
número de copias
La reacción en cadena de la
polimerasa fue desarrollada
en 1983 por el Doctor
Kary Mullis
Premio Nobel Química (1993)
 de una región específica de
ADNAl simular la forma en
como se replica al ADN de
forma natural

5. Sensibilidad
Eficiencia:
• se refiere a la
amplificación máxima
que se puede obtener en
un número determinado
de ciclos.
• la capacidad del test
para detectar la
enfermedad.
conceptos
Fidelidad
Especifidad
•
se puede definir la
especificidad como la
capacidad para
detectar a los sanos.
Conceptos
• se refiere a los errores que
comete la ADN polimerasa
durante la amplificación.
• Este concepto es de especial
importancia en la
secuenciación, pero en otros
casos no es tan importante. Una
buena fidelidad permite evitar
falsos positivos y/o negativos.

6. PROCESO
PCR
Partiendo de un DNA
molde, una enzima
polimerasa incorpora
nucleótidos
complementarios a
partir de la zona de
doble cadena originada
por la unión de los
cebadores al molde
En primer lugar es necesario que el DNA se
desnaturalice, O sea que las dos cadenas de
DNA se separen y para que esto pase se eleva
la temperatura aproximadamente a 90°C
•
El siguiente paso consiste en un
descenso de la temperatura para
permitir que los cebadores se unan
por complementariedad al DNA
molde
•
Temperaturas habituales en esta
fase oscilan entre 35 y 60ºC
la enzima polimerasa incorpora
nucleótidos complementarios
¿Qué se ha
obtenido tras un
ciclo de
PCR?
Únicamente
una
copia de un pequeño
fragmento del DNA
molde
La temperatura depende de
los cebadores

7. ADN
PROCESO
PCR
•Este DNA se conoce como DNA
molde.
 Componentes de
la PCR
Estos cuatro
componentes son los
elementos básicos
que es necesario
incorporar a
la reacción para que
se complete una PCR.
• El DNA a partir del cual queremos
obtener una copia de un fragmento, es
decir, el DNA que queremos amplificar.
DNA polimerasa (sintético)
•Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir
del DNA molde:
una
•La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado
para el funcionamiento de la enzima polimerasa.
Además, como
cofactores de la polimerasa se añaden cationes
divalentes, generalmente
en forma de cloruro de magnesio
cebadores o primers (sintéticos)
• Iniciadores de la reacción
• Son necesarios por tanto moléculas cortas
de
DNA de cadena sencilla.
Nucleótidos Libres
Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos
complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión
de los cebadores al molde
• las enzimas DNA polimerasas van a crear una
cadena complementaria a la cadena molde
mediante la incorporación de nucleótidos libre

8. PCR
La reacción en cadena de la
polimerasa o PCR es una
técnica fundamental para
la mayor parte de las
aplicaciones de la biología
molecular.
Conclusión
ADN
Molde
 Es una técnica de
biología molecular
desarrollada en
1987 por Dr.Mullis
que Permite
generar una gran
cantidad de copias
de un fragmento de
DNA
DNA
polimerasa
Desnaturalizar
el ADN, eleva
la temperatura
aprox a 90°C
•
Descenso
de la
entre 35 y
60ºC
la enzima
polimerasa
incorpora
nucleótidos
complementarios
cebadores
o primers
Nucleótids
Libres

9. Fundamentos de la
técnica

10. La reacción en cadena de la polimerasa
fue perfeccionada por Kary Mullis
perteneciente a la Cetus Corporation en
California, en la década de 1980.

11. Por lo general, la PCR es una técnica común y
normalmente indispensable en laboratorios de
investigación médica y biológica para una gran variedad
de aplicaciones.
Entre ellas se incluyen
La clonación de
ADN para la
secuenciación,
La detección y
diagnóstico de
enfermedades
infecciosas
La filogenia
basada en ADN
El análisis
funcional de genes
La identificación de
huellas genéticas (usada
en técnicas forenses y
test de paternidad)
El diagnóstico
de trastornos
hereditarios

13. Forma de
clonación
“in vitro”
 Sistema de amplificación que
nos permite la obtención de
un millón de copias del DNA
original en pocas horas

14. ¿Cuáles son
los
fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR
La DNA polimerasa realiza la extensión
del primer utilizando la cadena
complementaria como molde

15. Eventos de
la
replicación
del DNA
Apertura de las cadenas (origen
de replicación)
Colocacion de los iniciadores
(primers de RNA)
Sintesis de la cadena de DNA
(partiendo de los iniciadores)
Eliminación de los iniciadores
Unión de los fragmentos de DNA
(por la enzima DNA ligasa)

16. Hebra templado
Elementos
que se
requieren
en la
sintesis de
DNA por
PCR
Iniciador (cebador, primer) secuencia corta de nucleótidos
complementaria de la hebra templado.
dNTPs: desoxirribonucleótidos tri-fosfato
DNA polimerasa

17. Ventajas de
PCR sobre
otras
técnicas
Alta sensibilidad
Alta especifidad
Rapidez
Desvantajas: PROBLEMAS DE CONTAMINACIÓN

18. Utilidad

19. Objetivo:
Obtener un gran número de
copias de un fragmento de
ADN particular, partiendo de
un mínimo; en teoría basta
partir de una única copia de
ese fragmento original, o
molde.

20. Esta técnica sirve
para amplificar un
fragmento de ADN;
su utilidad es que
tras la amplificación
resulta mucho más
fácil:
 .
identificar con
una muy alta
probabilidad
virus o
bacterias
causantes de
una
enfermedad
identificar
personas
(cadáveres)
o hacer
investigación
científica sobre
el ADN
amplificado

21. Conocimiento de la estructura y
función de los genes.
Aplicaciones
en la
investigación
básica
El análisis de los niveles de los
distintos ARN mensajeros (ARNm)
presentes en una célula.
La técnica PCR puede ser utilizada,
en algunos casos, para clonar genes
cuya secuencia de bases es
desconocida.
Puede ser utilizada para cambiar la
información contenida en un
segmento de ADN.

22. Aplicaciones en el diagnóstico médico
Existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como
los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de Epstein Barr y
citomegálico.
Es posible detectar regiones del genoma del virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) a partir de sangre extraída de
pacientes seropositivos.
La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de
enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y
anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia
de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis quística.
En enfermedades oncológicas pueden detectarse mutaciones de
oncogenes.
Se han implementado métodos que utilizan la PCR destinados a la
evaluación del riesgo de padecer trastornos autoinmunes, tales como
diabetes de tipo I, enfermedad celíaca, pénfigo vulgaris, miastenia
gravis y esclerosis múltiple.

23. Elementos que se requieren para
realizar la prueba

24. Elementos que se
requieren para
realizar la prueba
Son 4
elementos
básicos

25. El DNA a partir del cual queremos obtener
una copia de un fragmento.
1) DNA molde
La concentración de la DNA molde en la
reacción depende de la fuente utilizada.
Se requieren aproximadamente de 300
nanogramos a 1 microgramo de DNA
genómico.

26. Es una enzima capaz de copiar una
secuencia de nucleótidos.
2) DNA
polimerasa
Inicialmente se utilizaba la DNA
polimerasa de Escherichia coli. →
inestabilidad térmica
Existe una gran variedad de
polimerasas con diferentes
capacidades a la hora de trabajar
con diferentes temperaturas.

27. La más habitual es la Taq DNA
polimerasa, de la bacteria Thermus
aquaticus, → capaz de funcionar a
altas temperaturas
Para conseguir una alta fidelidad es
común usar la polimerasa Phusion,
mucho más cara, pero es más
rápida y con menor frecuencia de
error.

28. También son conocidos como
oligonucleótidos sintéticos iniciadores.
3) Cebadores o
primers
Iniciadores de la reacción
La longitud de los oligonucleótidos es de 15 a
30 nucleótidos.

29. Su secuencia debe presentar la
mayor similitud posible con la
secuencia del DNA blanco, ya que
de ello depende el éxito y la
especificidad de la amplificación.
La complementariedad debe de
ser cerca de un 100% en las
ultimas 5 a 6 bases del extremo 3’
del oligonucleótido → para
asegurar la amplificación.

30. Desoxirribonucleótidos de trifosfato
(dNTPs)
4) Nucleótidos
libres
Las enzimas DNA polimerasas van a
crear una cadena complementaria a
la cadena molde mediante la
incorporación de estos.

31. Las concentraciones mínimas
disminuyen el índice de incorporación
errónea de los nucleótidos
Concentraciones muy altas disminuyen
la especificidad de la reacción.
Concentraciones entre 20 y 200 μM
proporcionan resultados óptimos.

32. Buffer:
Es una solución específica que magnifica la actividad de
la polimerasa y mantiene el pH adecuado para su
funcionamiento, normalmente contiene cloruro de
magnesio
Otros
elementos
.
Iones divalentes:
Actuan como cofactores de la polimerasa,
generalmente en forma de cloruro de magnesio
(MgCl2).

33. Utilidad
Material y Equipo

34. Termociclador
Materiales necesitamos a
nivel práctico
Microtubos.
Micropipetas
Puntas para las
micropipetas
Hielo

35. Material:
Los 4 desoxirribonucleótidostrifosfato (dNTP).
Dos cebadores o iniciadores.
Iones divalentes. (Mg2+) y
(MgCl2).
Iones monovalentes.
Una solución tampón o buffer.
ADN polimerasa o mezcla de
distintas polimerasas.
ADN molde.

36. Tipos de PCR
PCR anidada.
PCR de extención solapada.
PCR in situ.
PCR multiple.
PCR con transcriptasa inversa.

37. Etapas de y Equipo
Utilidad
Material la Técnica

38. El proceso que tiene lugar durante la PCR se
puede resumir de la siguiente forma:
partiendo de un DNA molde, una enzima
polimerasa incorpora nucleótidos
complementarios a partir de la zona de doble
cadena originada por la unión de los cebadores al
molde.
ETAPAS DE
LA TÉCNICA
¿Cómo tiene lugar esta reacción?
Como veremos a continuación los cambios de
temperatura constituyen la base para que se
completen los pasos necesarios.
El proceso se lleva a cabo en tres fases
Desnaturalización
Hibridación
Elongación

39. Desnaturalización
 En primer lugar es necesario que el DNA se
desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA
se separen. Esta primera fase se conoce como
desnaturalización y se lleva a cabo elevando la
temperatura a alrededor de 94ºC.

40. HIBRIDACIÓN
 Consiste en un descenso de la
temperatura para permitir que los
cebadores se unan por
complementariedad al DNA molde.
Temperaturas habituales en esta fase
oscilan entre 35 y 60ºC
 Especificidad de la reacción.

41. Elongación o
extensión
 Por último, en la fase de elongación o
extensión, la enzima polimerasa
incorpora nucleótidos
complementarios a partir del extremo
3’ libre de la región en que han
hibridado los cebadores. La
temperatura a la que se lleva a cabo
esta fase depende de la enzima
polimerasa empleada; si se utiliza Taq
polimerasa la temperatura de
elongación suele ser de 72ºC.

42. .
¿QUÉ SE HA
OBTENIDO TRAS
UN CICLO DE
PCR?
 Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA
molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no
tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las
cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el
que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el
momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de
añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena
formada no tiene un tamaño definido).

45. Utilidad
Ventajas y Desventajas

46. Rapidez y sencillez
de uso
 La PCR permite clonar ADN en
pocas horas, utilizando equipos
relativamente poco sofisticados.
VENTAJAS
DEL “PCR”
 Una reacción de PCR típica
consiste en 30 ciclos de
desnaturalización, síntesis y
reasociación.
 Por supuesto, el diseño y
de
los
 Cada ciclo dura típicamente de 3 síntesis
cebadores
a 5 minutos y se utiliza un oligonucleótidos
termociclador que lleva un también lleva tiempo, pero
proceso
ha
sido
microprocesador para programar este
los cambios de temperaturas y el simplificado gracias a la
aparición
de
programas
número de ciclos deseado.
informáticos para el diseño de
los cebadores.
 Una vez que se pone a punto,
la reacción puede ser repetida
de forma sencilla.

47. Sensibilidad
VENTAJAS
 La PCR puede amplificar
secuencias a partir de
cantidades ínfimas de ADN
diana, incluso a partir de ADN
contenido en una sola célula.
 La elevada sensibilidad ha
permitido:
Desarrollo de nuevos métodos
para el estudio de la patogénesis
molecular
La aparición de numerosas
aplicaciones (ciencia forense,
diagnóstico, estudios de
paleontología molecular, etc)
donde las muestras pueden
contener muy pocas células.
 Sin embargo, el hecho de
que el método tenga una
sensibilidad tan elevada
significa también que se
deben extremar las
precauciones para evitar la
contaminación de la
muestra con ADN extraño.

48.  Esto hace que el método resulte
muy adecuado para estudios de
antropología y paleontología
molecular,
 El método se ha empleado con
éxito también para la
amplificación de ADN de muestras
 La PCR permite la
de tejidos fijadas con formol, lo
amplificación de secuencias cual ha tenido importantes
específicas de material que aplicaciones en patología
contiene ADN muy
molecular.
degradado, o incluido en un
medio que hace
problemática su purificación
convencional.
Robustez
VENTAJAS

49. Necesidad de
disponer de
información
DESVENTAJAS sobre la
secuencia del
DE “PCR”
ADN diana
 Para poder construir
oligonucleótidos específicos que
actúen como cebadores para la
amplificación selectiva de una
secuencia particular de ADN se
necesita:
 Disponer de alguna
información previa sobre la
propia secuencia a amplificar.
 La región de interés ya debió
haber sido parcialmente
caracterizada, a menudo
mediante la aplicación de
métodos de clonación basados
en sistemas celulares.

50. DESVENTAJAS
Tamaño
corto de los
productos
de la PCR
 Una desventaja clara de la PCR
como método de clonación de
ADN ha sido el tamaño de las
secuencias de ADN que permite
clonar.
 La información de que se dispone
sobre la mayor parte de secuencias
clonadas por PCR sitúa el tamaño
de los fragmentos clonados entre 0
y 5 Kb, tendiendo hacia el extremo
inferior.
 Los fragmentos pequeños se
amplifican muy fácilmente, pero
conforme aumenta su tamaño ->
difícil obtener una amplificación
eficiente.

51. DESVENTAJAS
Infidelidad en
la replicación
del ADN
 La clonación del ADN en células pasa por la
replicación del ADN in vivo, proceso asociado a
una gran fidelidad de copiado debido a la
existencia, en la célula, de mecanismos de
lectura y corrección de errores.
 Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro
la tasa de errores cometidos durante el
copiado se dispara.

52. DESVENTAJAS
Peligro de
contaminació
n
 La facilidad con que se amplifica el
ADN exige evitar el peligro de
contaminación inherente al poder
multiplicador de la reacción.
 En un tubo en el que se ha realizado
una reacción de PCR hay tal
cantidad de ADN, que al salir
caliente del termociclador y abrir
este, el vapor alcanza el ambiente
del laboratorio.
 Hay peligro de contaminarse con
otro ADN incluso puede ser del
mismo investigador u otro.

53. DESVENTAJAS
 Necesidad de
primers específicos
que sean
complementarios al
fragmento que se
desea sintetizar
 La polimerización
puede tener errores
al sintetizar el ADN

54. Utilidad
Material y Equipo
Conclusión

55. Conclusión
Final
 La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una
técnica fundamental para la mayor parte de las
aplicaciones de la biología molecular. Se ha
presentado la base teórica y práctica de la PCR.
Existen muchas variantes de la PCR convencional,
como son la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa
[6] (que permite cuantificar la cantidad de producto
amplificado) o la PCR por transcripción inversa
(mediante la cual se obtiene una copia de DNA
complementario, DNAc, utilizando como molde
ácido ribonucleico, RNA). Existe gran cantidad de
información referida tanto a la PCR convencional
como a sus variantes .

56.  http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Re
acci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20poli
merasa.pdf
 http://www.cobachelr.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/h
isto/05bio/26.htm
Bibliografías
 http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_
bacterias/reaccion_en_cadena_polimerasa.pdf
 http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir2013/ir132d.pdf
 http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2010_1/tec
nicadepcr.pdf