Bài này mình sưu tầm được, một số phần bị lỗi font. Mình thấy nó khá hay, và có thể giúp ng đọc hiểu được về cơ bản PCR là gì, và cách chạy PCR ra sao. ( Rất cảm ơn người làm bài present này)

1. PCR (polymerase chain reaction)
 Chương II

2. Taq polymerase
Các bước PCR
1 phản ứng PCRNguyên tắc máy
PCR
Làm thế nào để
phân lập được
gen

3. I. Giới thiệu
Kary Mullis 1985
Nobel 1993

4. Giới thiệu
 PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp
 Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA
với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không
cần sự hiện diện của tế bào
 Phaûn öùng PCR cho pheùp khuyeách ñaïi
moät ñoaïn DNA naèm giöõa 2 moài chuyeân
bieät, nhôø men DNA polymerase

5. Nguyên tắc
• Dựa trên sự hoạt động của emzyme
• Sự hiện diện của mồi chuyên biệt
• Khả năng nối dài mồi của taq polymerase
• Các nu tự do trong môi trường

6. Máy PCR

7. Thực nghiệm
 Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ mỗi chu
kỳ gồm 3 bước
 Bước 1: Biến tính (denaturation)

94-98o
C

2-5 phút
 Bước 2: Gắn mồi (anneealing)

30-65o
C

20s-2’
 Bước 3: kéo dài (extending)

68-72o
C

20s-5’

8. Thực nghiệm
http://users.ugent.be/~avierstr/pdf/PCR.pdf

9. III. THỰC NGHIỆM
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html

10. III. THỰC NGHIỆM
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html

11. Moài (primers)Moài (primers)
= oligonucleotide ñôn maïch (18-24 b) boå sung vôùi 2 vuøng treân
trình töï DNA
Moài xuoâi (sense primer hoaëc Forward) baét caëp vôùi maïch
khuoân cuûa DNA vaø seõ keùo daøi theo chieàu phieân maõ
Moài ngöôïc (anti sense primer hoaëc Reverse) baét caëp vôùi maïch
maõ cuûa DNA vaø seõ keùo daøi ngöôïc theo chieàu phieân maõ
5’
3’
3’
5’
3’ 5’ 5’ 3’

12. THIẾT KẾ MỒI
 Nguyên tắc
 Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt
cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc
 Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không
được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C
nối tiếp nhau thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%<
G+C<70%))
 Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khuôn
 Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần
khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên
DNA
 Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá
lớn (<3000 tốt nhất là dưới 1000)

13. THIẾT KẾ MỒI
Cách thiết kế mồi:
 Mồi xuôi: cùng trình tự với mạch mã
 Mồi ngược: là trình tự ngược và bổ sung
với mạch mã
 Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

14. Polymerase chòu nhieätPolymerase chòu nhieät
Taq-polymerase : töø Thermus aquaticus
Nhieät ñoä toái öu : 72°C
Coù hoaït tính 5'->3' polymerase
Coù hoaït tính terminal transferase : theâm 1 Adenosine ôû
ñaàu 3’ cuûa maïch DNA môùi.
Khoâng coù khaû naêng söûa sai (2x10-5
, 0.25% sai sau 30
chu kyø)
Sao cheùp ~ 2000b/min. Khoâng sao cheùp ñöôïc treân 3kb
Pfu-polymerase : töø Pyrococcus furiosus
Nhieät ñoä toái öu : 72°C
Coù hoaït tính 5'->3' polymerase vaø 3’-> 5’ exonuclease
Tyû leä cheùp sai thaáp (1.5x10-6
)
Sao cheùp ~ 500b/min

15. Buffers
 Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho
từng loại enzyme.
 Một số buffer chứa chất hoạt động bề
mặt có thể ảnh hưởng đến các phản
ứng
 Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+

16. Nồng độ Mg2+ và dNTP
 Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất hiện thêm các sản phẩm
không đặc hiệu.
 Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp.
 Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase,
DNA mẫu và thành phần buffer
 gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách
mỗi bước là 0.2 mM.
 dNTPs là loại hóa chất kém bền
 Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc
tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm
PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác

17. Chất khác
 Đối với các DNA template lớn, giàu GC
thì có thể sử dụng các chất biến tính
như DMSO, formamide, glycerol, and
betaine trong thành phần PCR.
 Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần
giảm nhiệt bắt mồi xuống.
 Dầu khoáng

18. CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR
 1. DNA mẫu: (100ng-1µg)
 2. Enzyme
 3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai)
 4. dNTP: 20-200µM/ mỗi lọai nu
 5. Nồng độ Mg++
 6. Số lượng chu kỳ phản ứng
 7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng

19. Một số vấn đề thường gặp
 Không có sản phẩm hoặc lượng sản
phẩm quá thấp
 Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác
 Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ, nhiệt độ
biến tính
 Hạ nhiêt độ gắn mồi
 Primer, buffer

20. Một số vấn đề thường gặp
 Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm
mong muốn
 Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ
 Tăng nhiệt độ gắn mồi
 Thay đổi nồng độ Mg2+
 Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt
nhỏ

21.  Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp
hơn sản phẩm mong muốn
 Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt
mồi
 Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
 Giảm nồng độ DNA polymerase.
 Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.
 Tinh sạch DNA template
 Giảm nồng độ primer.
 Thiết kế cặp primer mới.
Một số vấn đề thường gặp

22. Real-time PCRReal-time PCR

23.  Moät maùy luaân nhieät
 Moät heä thoáng phaùt vaø ñoïc tín hieäu huyønh
quang

24. Quaù trình nhaân baûn saoQuaù trình nhaân baûn sao
ADN trong moät phaûnADN trong moät phaûn
öùng PCRöùng PCR
Theàm phaùt
hieän
Pha log
Pha bình nguyeân
Pha chaäm
SoálöôïngADN
Trong pha Log : Qn
= Q0
(E)n
Qn
= Soá baûn sao sau n chu kyø
Q0
= Soá baûn sao khôûi ñaàu
E = Hieäu suaát PCR
n = soá chu kyø

25. PCR coå ñieån : keát quaû chæ ñöôïc
bieát sau khi taát caû caùc voøng phaûn
öùng ñaõ hoaøn thaønh .
A-6
= 10-6
ng
A-5
= 10-5
ng
A-4
= 10-4
ng
A-3
= 10-3
ng
A-2
= 10-2
ng
A-1
= 10-1
ng
A1
= 1ng
A-6
A-5
A-4
A-3
A-2
A-1
A1
Real-Time PCR : quaù
trình nhaân baûn sao ADN
ñöôïc theo doõi tröïc tieáp
theo töøng chu kyø. Vôùi
kyõ thuaät naøy, ADN ban
ñaàu ñöôïc ñònh löôïng
moät caùch chính xaùc.

26. Tín hieäu huyønh quang ñöôïc ño sau giai
ñoaïn keùo daøi cuûa moãi chu kyø PCR
Öu ñieåm : reû, ñôn giaûn
Nhöôïc ñieåm : khoâng ñaëc
hieäu
Phöông phaùp taïo huyønhPhöông phaùp taïo huyønh
quang duøngquang duøng SYBRGreenSYBRGreen
SYBRGreen phaùt
huyønh quang khi cheøn
giöõa 2 maïch cuûa ADN
Kích thích
490nm
Phaùt quang
530nm

27. Aùp duïng cuûa PCRAùp duïng cuûa PCR
Taïo doøng DNA
Tìm hieåu möùc bieåu hieän cuûa gen (Reverse
Transcription PCR)
Chaån ñoaùn beänh (cuûa ngöôøi, suùc vaät, caây
coái)
Phaùt hieän ñoät bieán
Kieåm tra chaát löôïng (thöïc phaåm, GMO, oâ
nhieãm nöôùc…)
Phaùt hieän khaùc bieät giöõa caùc boä gen (Ña
daïng gen):

28. TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN
MỘT PHẢN ỨNG PCR
1. Thiết kế mồi
2. Chuẩn bị mẫu DNA
3. Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau:
 H2O tiệt trùng
 Buffer
 dNTP tổng số
 mồi xuôi
 mồi ngược
 taq polymerase
 DNA mẫu
1. Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp
2. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt
của thang chuẩn
3. Phân tích kết quả

29. RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA)

30. Escherichia coli : 4 x 106
Saccharomyces cerevisiae : 1,4 x 107
Drosophila melanogaster : 1,6 x 108
Caenorhabditis elegans : 108
Homo sapiens : 3,4 x 109
Arabidopsis thaliana : 108
Oryza sativa 4,3 x 108
Phaseolus vulgaris (đậu) : 2 x 109
Triticum vulgare (lúa mì) 7 x 109
Tulipa 3,5 x 1010
Kích thöôùc boä gen cuûa moät vaøiKích thöôùc boä gen cuûa moät vaøi
sinh vaätsinh vaät (pb)(pb)

31. Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Tulipa
Caenorhabditis elegans

32. Giới thiệu
Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại
ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990
(Welsh và McClelland; William và ctv.). Dùng nghiên cứu sự
khác biệt di truyền của những loài khác nhau.
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử
dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự
biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA
có trình tự bổ sung với trình tự của các primer

33. Primer RAPD
 Là đoạn ngắn oligonucleotide đơn (10mer)
được tổng hợp một cách ngẫu nhiên
 Để tìm sự khác biệt giữa các loài người ta
thường sử dụng một số lượng lớn các mồi
ngẫu nhiên
 Trên thị trường hiện nay có rất nhiều mồi
ngẫu nhiên được tổng hợp nhân tạo

34. Nguyên tắc
 Dùng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi là các sợi
oligonucleotide đơn gồm 10 mer có trình tự sắp xếp
ngẫu nhiên
 SV cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, sẽ
khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau
khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR.
 SV khác nhau ít nhiều về kiểu gen _ đa dạng về sinh
hoc, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn
DNA được khuyếch đại sẽ có kích thước khác nhau.

35. Ứng dụng
 Nghiên cứu đa dạng di truyền
 Phát hiện sự liên kết giữa gen với tính trạng
 Thiết lập bản đồ di truyền
 Phát hiện đột biến

36. Ưu điểm
 Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết
trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu,
thao tác đơn giản
 Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.
Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao
 Chi phí thực hiện thấp.
 sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để
đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân
tử có độ tin cậy cao

37. Hạn chế
 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao,
không ổn định
 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR
cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp
và độ tin cậy không cao
 Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và
có độ tin cậy không cao

38. Secuencia N° de
bandas
Partidor nucleotídica (5’-3’) totales
OPA-13 CAGCACCCAC 19
OPB-04 GGACTGGAGT 26
OPB-07 GGTGACGCAG 21
OPB-12 CCTTGACGCA 21
OPB-17 AGGGAACGAG 20
OPF-04 GGTGATCAGG 21
OPF-06 GGGAATTCGG 12
OPF-08 GGGATATCGG 12
OPF-09 CCAAGCTTCC 19
OPF-12 ACGGTACCAG 10
OPF-18 TTCCCGGGTT 13
OPF-14 TGCTGCAGGT 19
OPI-04 CCGCCTAGTC 14
OPI-07 CAGCGACAAG 29
OPI-10 ACAACGCGAG 28
OPI-13 CTGGGGCTGA 17
OPI-14 TGACGGCGGT 22
OPI-20 AAAGTGCGGG 21

39. Sản phẩm điện di RAPD

40. Hãy thiết kế mồi để khuyếch đại đoạn DNA
sau, tính Tm của mồi?
 5’aagcgtattgatgttcagaataatgaaaccactaattcaagagtattgtgtgtatgccttgttatttcttcatgatcc
aagggtttctcgcgtcaacagtatgttctgagctttttgttgttgtcatatctacttattcatgtttggaatgaaatgtcaa
ttgtctcatcttcctaaagtgtatacaagtttttgttctacaatagaactctacaacagctgaatataatgataaaaat
agatattttcttggctctttttttcattttacttttcttgacttctcatatggaaccacctccagcaacaaacggacctgtt
attgcaggttactttgctaattggtaacattgcataacaaaggcaaaaggggagcttaactcaactaactagaat
gtaataggggaatctacgatagaaaatacaatgttgttgatgtagctactcaagccaataagttgactcatatttta
tatgcatttgctaatgtccaaccggatggtcaagttgttcttggggtagtataaattattgcaagatatagaatataa
taataataattataaatataggacgcttatgcagatattgaaaagcattttccagcaagtaaaaaaataataata
aacaaatataaaacctctccctaattcatacataatatgtagaccaagcagtcaaccgaaaagaagatggatg
gaatgatccaggcaagaacctttacggtaactttaagcagttctatttactcaagcaacaacaccgtcatctcaa
agtgtcgcttagcattggcggatatacatggtccactcattttggcccggttgcgcgtgatcctcagaaacgcag
attgtttgtagatagcagcatcaaacacctagccaacttgggtctggacgggctagatattgactgggagtaccc
caaagatgatgaggaagcgttttattatgtgcatctgctctatgagttgcgactggcgcttgacagatatcaacaa
cagtgccaacaactgattcagtcgcgactattactcacagtagccgtgccttgtggccctgaccattatcgtaaat
tgagattgaccgaaatgcaaccttacgtggacctattttacctcatggcatacgactatgctggttcatgggattctt
tcgcagatcatcaagcggctgtttatggtggcagattgaatacagaacaagcagtacagcactatatcgcctgt
ggtatccctccatataagctagtcgtaggcatgcctttatatggtcgaggattctgcaatacggcggggccaggt
catcctttccaaggactgcctcgcggtacctgggaagagggtcaatttaattacaagacattgccaaaaccgg
gcgctgtagaataccacgactttaatcgactagcctcatggtcttatgaccctcaggctcgtgaatttatcacctat
gatactacgagatacattaacgt 3’

41. kết quả
 Mồi xuôi: 5’ AAG CGT ATT GAT GTT
CAG 3’
 Mồi ngược: 5’ ACG TTA ATG TAT
CTC GTA 3’
 Tm (mồi xuôi) = 4x 7 + 2 x 11 = 50
 Tm (mồi ngược) = 4x 6 + 2 x 12 = 48