CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

1. 1
Khoa Dược
BM Vi sinh - Ký sinh
  
CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN
SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH
Tên chuyên đề:
QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID
AMIN VÒNG THƠM
  
Sinh viên TH: Nguyễn Trung Châu
Số thăm: 08
Giảng viên HD: PGS. TS. Nguyễn Tú Anh
Ký tên Điểm TB
GV chấm 1
GV chấm 2
TP.HCM - 2019

2. 2
MỤC LỤC
MỤC LỤC...................................................................................................................2
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................3
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................3
1. Tóm tắt nội dung chuyên đề................................................................................4
2. Giới thiệu.............................................................................................................4
3. Quy trình sản xuất một số amin vòng thơm........................................................5
3.1. Quy trình sản xuất L-phenylalanin..............................................................5
3.1.1. Tổng quan phenylalanin [2]....................................................................5
3.1.3. Sán xuất L-phenylalanin bằng phương pháp lên men từ các chủng vi
khuẩn Brevibacterium spp. đột biến gen.............................................................8
3.2. Quy trình sản xuất L-tyrosine ..........................................................................9
3.3. L-tryptophan...................................................................................................11
3.3.1. Tổng quan về tryptophan ........................................................................11
3.3.4. Sản xuất từ 3-indolepyruic acid từ các chủng Micrococcus luteus.........13
4. Kết luận .................................................................................................................15
TÀI LIỆU KHAM KHẢO ........................................................................................16

3. 3
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Thị trường cung ứng các acid amin vòng thơm năm 1999..........................5
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC
13869). ....................................................................................................................8
Bảng 2.3 Hàm lượng phenylalanine thu được từ các chủng Brevibacterium
spp. tương ứng ........................................................................................................9
Bảng 2.4 Thành phần của môi trường MOPS...........................................................10
Bảng 2.5 Lượng Phe và Tyr ghi nhận được bằng phương pháp HPLC sau 45
giờ ở 37o
C .............................................................................................................10
Bảng 2.6 Thành phần môi trường X nuôi cấy chủng E.Coli K-12 đột biến
JP6015/pMU91 .....................................................................................................13
Bảng 2.7 Môi trường chuẩn bị tế bào khô Micrococcus luteus 398 .........................14
Bảng 2.8 Môi trường nuôi cấy tế bào Micrococcus luteus 398 ................................14
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của phenylalanin ............................................................5
Hình 2.2 Hệ thống enzym glutamate dehydrogenase và transaminase dùng để
sản xuất phenylalanin từ phenylpyruvate. ..............................................................8
Hình 2.3 Con đường sinh tổng hợp Tyrosine ở E. Coli ............................................11
Hình 2.4 Sơ đồ nuôi cấy E.Coli B10 thu Tryptophan từ glucose .............................12

4. 4
1. Tóm tắt nội dung chuyên đề
Như chúng ta đã biết, phân nhóm acid amin vòng thơm hiện nay được chia thành 3
loại là L-phenylalanine, L-tyrosine và L-tryptophan. Đây là 3 loại acid amin cơ thể
chúng ta không tự tổng hợp được mà phải lấy từ nhiều nguồn thực phẩm hay thức
ăn. Và mỗi loại lại đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền tín hiệu, là thành
phần bắt buộc của nhiều phản ứng tổng hợp và nhiều phản ứng chuyển hóa trong cơ
thể. Với lý do trên, chuyên đề “Quy trình sản xuất một số acid amin vòng thơm”
nhằm giúp mỗi chúng ta có cái nhìn bao quát hơn về các phương pháp tổng hợp
theo hướng sinh học đang được sử dụng tại Việt Nam nói riêng và trên toàn thế giới
nói chung và đồng thời cũng thấy được nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tổng
hợp hóa học vốn nhiều khuyết điểm kèm theo nhiều hạn chế. Các quy trình hiện nay
đang được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất dược phẩm được trích dẫn từ
nhiều bằng sáng chế và các bài báo khoa học trên thế giới. Đồng hành cùng với việc
nghiên cứu ra các phương pháp sản xuất mới tối ưu nhất, người ta cũng chú trọng
đến các kết quả nghiên cứu nhằm nâng cao hơn hiệu suất của từng phương pháp, cải
thiện độ tinh khiết, có các bài viết về sự so sánh giữa các chủng, loại đang được sử
dụng trong mỗi phương pháp và tính hợp lý của phương pháp tổng hợp sinh học so
với phương pháp hóa tổng hợp.
2. Giới thiệu
Hiện nay, trong tự nhiên có khoảng 20 acid amin thường gặp cấu tạo nên protein,
đồng thời chúng cũng là thành phần dinh dưỡng quan trọng của sinh vật. Chúng có
tầm quan trọng đáng kể về mặt công nghiệp, acid amin được sử dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực dinh dưỡng, thực phẩm, mĩ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp, vật liệu
polymer… Do đó, vấn đề sản xuất acid amin để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ to lớn này
đang được đặc biệt chú trọng.
Hiện nay có 3 phương pháp được sử dụng để sản xuất acid amin [1]:
- Phương pháp chiết xuất acid amin từ dịch thủy phân protein
- Phương pháp tổng hợp hóa học
- Phương pháp lên men vi sinh vật
Các acid amin thơm là một ví dụ điển hình cho các chất hóa học có thể được sản
xuất bằng phương pháp vi sinh vật sử dụng nguyên liệu tái sử dụng như D-glucose.
Trong số các hợp chất acid amin thơm, L-phenylalanine (L-Phe) khá được quan tâm
sản xuất, vì hợp chất này có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm.
Nhu cầu thị trường của L-Phe đạt 11.000 tấn / năm vào thời điểm năm 2004. Acid
amin này chủ yếu được sử dụng như là một chất bổ sung dinh dưỡng và là tiền chất
cho việc tổng hợp các chất phụ gia thực phẩm cũng như dược phẩm.. Sự tổng hợp
hóa học các hợp chất cho thấy những bất lợi rõ rệt khi được so sánh với quá trình
tổng hợp sinh học sử dụng các vi sinh vật tái tổ hợp hay nguyên thuỷ: tổng hợp hóa
học sử dụng các nguyên liệu độc hại không thể tái sử dụng và tạo ra sản phẩm là
hỗn hợp racemic của các đồng phân D và L Phe, gây khó khăn cho quá trình tinh

5. 5
chế. Ngược lại, việc tổng hợp sinh học lại là một lựa chọn hấp dẫn vì đây là công
nghệ sạch sử dụng nguồn năng lượng tái sử dụng như carbohydrate đơn giản (D-
glucose), ít gây ô nhiễm môi trường hơn. Tuy nhiên, quá trình tổng hợp các acid
amin vòng thơm nói riêng và các hợp chất khác bằng phương pháp sinh học nói
chung là cải thiện hệ số năng suất chuyển hoá (cho biết tỉ lệ giữa sản phẩm / nguyên
liệu ban đầu) và năng suất của các công nghệ sản xuất hiện tại.
Bảng 2.1 Thị trường cung ứng các acid amin vòng thơm năm 1999.
Ứng dụng Nhà sản xuất
Thị
phần
(tpa)
Giá bán (USD/kg)
Chăn
nuôi/ Hóa
học
Dược
phẩm
L- tryptophan
Thực phẩm bổ
sung, thuốc chống
trầm cảm, điều trị
bệnh pellagra, cải
thiện giấc ngủ
Ajinomoto Co., Mitsui
Chemicals, Tanabe
Seiyaku Co.,Kyowa
Hakko Kogyo,
Archer Daniels Midland.
500-600 48-54 116-133
L-phenylalanine
Thực phẩm bổ
sung, chất trung
gian cho các phản
ứng tổng hợp dược
phẩm như thuốc ức
chế protease, thuốc
kháng viêm,...
Nutrasweet Kelco,
Ajinomoto Co., Tanabe
Seiyaku Co., Yoneyama
Yakugin Kogyo Co.,
Daesang.
11000-
12000
20-24 30-40
L-Tyrosine
Tiền chất trong quá
trình tổng hợp L-
Dopa, điều trị bệnh
Basedow, bổ sung
dinh dưỡng
Ajinomoto Co., Kyowa
Hakko Kogyo, Tanabe
Seiyaku Co., Yoneyama
Yakuhin Kogyo Co.,
Amino GmbH,
Rexim/Degussa
150+ 18-20 34-35
Nguồn: Chemical Economics Handbook, SRI International, 1999
3. Quy trình sản xuất một số amin vòng thơm
3.1. Quy trình sản xuất L-phenylalanin
3.1.1.Tổng quan phenylalanin [2]
Là acid amin mạch vòng, có một nhóm –NH2 và một nhóm –COOH.
Công thức cấu tạo:
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của phenylalanin
CTPT: C9H11NO2

6. 6
Một số tính chất vật lý: Tinh thể màu trắng, bền ở nhiệt độ 20-25 °C. Phổ hấp thu ở
280nm. Điểm đẳng điện 5.5. Tỷ trọng 0.754. Tan trong nước 1-5 g/100 mL nước ở
25 °C. Ổn định trong điều kiện bình thường, không bền với các tác nhân oxy hóa
mạnh.
Phenylalanin là 1 trong 8 acid amin thiết yếu, cơ thể người và động vật không thể tự
tổng hợp được mà phải lấy từ các nguồn bên ngoài. Phenylalanin tham gia vào việc
tổng hợp tyrosine (là chất tiền thân của adrenalin) và là loại acid amin chính trong
việc tạo thành đạm tuyến giáp. Có chức năng duy trì sự hoạt động bình thường của
tuyến giáp trạng, tuyến thượng thận, tham gia tạo sắc tố và độ thành thục của tinh
trùng. Phenylalanine là một axít amin có chức năng bồi bổ não, tăng cường trí nhớ,
và tác động trực tiếp đến mọi hoạt động của não bộ. Ngoài ra, nó có thể làm tăng
lượng chất dẫn truyền xung động thần kinh, và tăng tỷ lệ hấp thụ tia UV từ ánh sáng
mặt trời, giúp tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da. Phenylalanin thường bị coi là
chất độc bởi vì nó được sử dụng làm vị ngot non-carbohydrate cho nước ngọt (được
sử dụng với aspartame) và nhiều người cho rằng nó là nguyên nhân dẫn đến sư nguy
hiểm cho trí óc, và có thể dẫn đến nguy cơ ung thư. Thừa phenylalanin dẫn đến triệu
chứng nhức đầu, cao máu, buồn nôn, đau tim và thần kinh tổn hại. Lượng
phenylalanin mỗi người trong một ngày cần 4.4 g. Từ những năm 1990 đến nay nhu
cầu phenylalanin ngày càng tăng. Trước đây việc sản xuất chủ yếu bằng phương
pháp enzym, từ cuối năm 1996 ở Trung Quốc đã sản xuất bằng phương pháp lên
men. Việc sản xuất phenylalanin trên thế giới chủ yếu ở Mỹ, Nhật, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Tây Âu. Nó được dùng trong thực phẩm, dược phẩm, sản xuất
aspartam. L-phenylalanin có trong một số loại thực phẩm như: thịt bò, cá, đậu nành,
sữa, trứng, …
3.1.2. Sản xuất L-phenylalanin từ phenyl pyruvate dựa trên tế bào
Corynebacterium Glutamicum đang tăng trưởng [3]
Nguồn nguyên liệu và giống
Bắp
Vi sinh vật
Yêu cầu chọn giống:
+ Không có khả năng sinh độc tố
+ Khả năng sinh tổng hợp sản lượng phenylalanin la lớn nhất
+ Dễ nuôi cấy, thích nghi với môi trường, tốc độ sinh sản nhanh
+ Môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền
Chọn giống vi sinh vật: trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp
phenylalanin. Tuy nhiên có giới hạn các loài có khả nămg tổng hợp lượng lớn để có
thể áp dụng cho quy mô công nghiệp. Các loài này trong điều kiện đặc biệt có thể
sản xuất lượng acid amin vượt xa nhu cầu bản thân và được tích lũy lại trong tế bào
hay thoát ra môi trường. Hiện tượng này gọi là hiện tượng siêu tổng hợp acid amin.

7. 7
Cần phải tiến hành phân lập giống, tuyển chọn, gây đột biến, khảo sát điều kiện tối
ưu cho quá trình sinh tổng hợp. Chọn loài vi sinh vật tích lũy nhiều acid amin là
khâu quan trọng nhất. Một số loài vi khuẩn và nấm men có thể tổng hợp được lượng
khá lớn phenylalanin tiêu biểu là:
+ Brevibacterium lactofermentum
+ Corynebacterium glutamicum
+ Brevibacteriumflavum
+ Corynebacterium equi
+ Escherichia coli
+ Candida boidinii
Hiện nay đã tạo ra các chủng E. coli tái tổ hợp, đột biến, có khả năng tổng hợp
phenylalanin cao. Các tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý như tia bức xạ
ion hóa hay các tác nhân hóa học, sử dụng các chất oxy hóa mạnh như etylen hoặc
các chất gây đồng vị phóng xạ mạnh. Trong quy trình này sử dụng E. coli đột biến
dị dưỡng tyrosin.
Đặc điểm E. coli: là vi khuẩn gram âm, kị khí, không sinh bào tử. Tế bào hình que
dài khoảng 2 µm, đường kính 0.5 µm, thể tích tế bào 0.6 - 0.7 µm3. Là vi sinh vật
ưa ẩm, có thể sống trong khoảng nhiệt độ 7 °C – 50 °C. Nhiệt độ gây chết 60 °C –
65 °C trong 1 phút. Có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau. Sinh trưởng trong điều
kiện hiếu khí hay kỵ khí dùng nhiều cặp oxy hóa khử khác nhau bao gồm sự oxy
hóa pyruvic acid, formic acid, hydrogen, amino acid và sự giảm cơ chất như
oxygen, nitrat, dimetyl sulfoxide và trimetylamin N-oxid.
Nguồn dinh dưỡng E. coli có thể sử dụng được:
+ Nguồn cacbon: glucose, lactose, mannitol, fructose, galactose, sorbitol, glycerol,
acid cinnamic.
+ Nguồn nitơ: NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2-H-citrat, pepton, L-asparagin, adenin,
adenosin, agmatin, L- và D-alanin, allantonin, arginin, aspartat, cytidin, cytosin,
glucosamin, glycin, glutamin, …
+ Nguồn khoáng: KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4.17H2O, MgSO4.7H2O, ZnCl2.7H2O,
MnSO4, CuSO4.5H2O, …
+ Các chất sinh trưởng: biotin, B12, B6, B1, B2, B3, vitamin K, acid folic,
pantothenic acid, thymin.
L-phenylalanin được sản xuất từ phenylpyruvate bằng chủng Corynebacterium
glutamicum đột biến (Mẫu số 026, Viện Nghiên Cứu Pasteur, Paris). Chủng vi
khuẩn này có thể đồng thời tổng hợp Valine và Phenylalanine.
Các điều kiện để tăng hiệu suất tổng hợp Phenylalanin bằng cách giảm tổng hợp
Valine:

8. 8
Glutamate
dehydrogenase
- Nồng độ Isoleucine cao hơn 250 mg/l có thể ngăn chặn con đường sinh tổng hợp
valine. Song song đó, việc giảm nồng độ ion amoni cũng góp phần làm giảm tỉ lệ
Valin: Glutamic Acid từ 6.9 về 2.2 (g/g).
- Phenylpyruvate không nên được thêm vào sớm, tốt hơn là sau 48h kể từ khi vi
khuẩn tăng trưởng (Hiệu suất đạt 41%, cao hơn so với các thời điểm khác).
Lượng phenylalaine tối đa thu được là 28 mM (4.6g/L) do khả năng hoà tan kém
của phenylpyruvate trong nước (25 g/l).
NADP
H2O GLUTAMATE PHENYLPYRUVATE
NH3 α-KETOGLUTARATE PHENYLALANINE
NADPH
Hình 2.2 Hệ thống enzym glutamate dehydrogenase và transaminase dùng để
sản xuất phenylalanin từ phenylpyruvate.
3.1.3. Sán xuất L-phenylalanin bằng phương pháp lên men từ các chủng vi
khuẩn Brevibacterium spp. đột biến gen
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy Brevibacterium lactofermentum 2256
Thành phần Hàm lượng
Glucose 13 g
(NH4)2SO4 1 g
KH2PO4 0,15 g
K2HPO4 0,4 g
Biotin 5,0 ug
thiamine.HCL 20 ug
L-tyrosine 40 mg
D, L-methionine 40 mg
soy protein acid hydrolyzate 3 ml
Acid fumaric 1.2 g
Acid acetic 0.3 ml
Calci carbonate 5.0g
Các đột biến này được tạo bằng các bức xạ ion hóa (tia cực tím, tia X, tia gamma)
hoặc các tác nhân hóa học (natri nitrit, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,
Transaminase

9. 9
diethyl sàng lọc các dòng cho các đột biến có các đặc tính mong muốn. Một số loài
được sử dụng: Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869),
Brevibacterium flavum 2247 (ATCC 14067), Brevibacterium lactofermentum
AJ 3436 và 3437.
Sau đó, điều chỉnh đến pH 7.0, Thêm vi khuẩn vào, nuôi ở 30o
C có lắc xoay trong
vòng 72 giờ. Nếu dùng chủng AJ 3699 thì phải thêm vào môi trường L-trytophan
10mg/dl.
Bảng 2.3 Hàm lượng phenylalanine thu được từ các chủng Brevibacterium spp.
tương ứng
Chủng đột biến Hàm lượng phenylalanine thu được (g/l)
No. 2256 0.00
AJ 3435 0.42
AJ 3436 0.71
AJ 3432 1.74
AJ 3437 2.20
AJ 3699 2.31
3.2. Quy trình sản xuất L-tyrosine
3.2.1. Vi nang chứa Erwinia herbicola sản xuất L-Tyrosine [4]
Chủng Erwinia herbicola (ATCC 21434) tốt nhất là đang tăng trưởng ở mức vừa
phải để đảm bảo hoạt tính cao của enzym tyrosine phenol-lyase. Các tế bào vi sinh
vật được đóng vi nang với lớp bao alginate-poly-L-lysine-alginate (đường kính
800um).Cần đạt tốc độ khuất ít nhất là 240 vòng/ phút trước khi hoạt độ của các tế
bào trong vi nang bằng với các tế bào tự do khác.
Tyrosine phenol-lyase (E.C. 4.1.99.2)- có thể được tìm thấy ở Eminia herbiwk và
Escherichia intermedia (Citmbacfer intemedius) và các chủng khác khác trong họ
các vi khuẩn Enterobaderiaceae spp. .Enzyme này xúc tác một số phản ứng sinh ra
ammonia và phenol từ sự phân huỷ tyrosine. Phản ứng này có thể đảo ngược và do
đó có thể được sử dụng để sản xuất tyrosine từ amoniac, pyruvate và phenol như
sau:
NH3 + pyruvate + phenol  Tyrosine + H2O
Đây là một phương pháp mới do sự tạo thành L-Tyrosine ngay bên trong cơ thể so
với các phương hướng trước đây. Tuy nhiên vẫn còn đang ở quy mô nghiên cứu.
3.2.2. Sản xuất L-Tyrosine từ đường Sucrose bằng chủng Escherichia coli sản
xuất phenylalanine [5]
Chủng E.coli K12 cho sản phẩm L-phenylalanine được chuyển đổi sang thế hệ sản
xuất L-Tyrosine nhờ vào việc xóa đi đoạn gen pheA mã hóa enzyme mutase/
prephenate dehydratase thay vào đó là chèn vào đoạn gen TyrA.
Plasmid pScr1(chứa các đoạn gen mã hóa cho các enzyme sucrose permease,
fructokinase và sucrose hydrolase (cscB, cscK, và cscA) được chuyển vào chủng
đột biến NST37 và DPD4193, sau đó nuôi cấu trong môi trường MOPS.

10. 10
Bảng 2.4 Thành phần của môi trường MOPS
Thành phần Hàm lượng
Ampicillin 100 µg/ml
Dịch chiết nấm men 0.05%
Glucose 0.2%
Sucrose (Nếu không dùng
Glucose)
1.2%
Tryptophan, tyrosine (NST37) 10 µg/ml mỗi chất
Tryptophan, phenylalanine
(DPD4193)
10 µg/ml mỗi chất
Bảng 2.5 Lượng Phe và Tyr ghi nhận được bằng phương pháp HPLC sau 45
giờ ở 37o
C
Chủng Nguồn carbon
Nồng độ Phe
(ppm)
Nồng độ
Tyr (ppm)
NST37/pScr1 Glucose 139 3
NST37/pScr1 Sucrose 130 3
DPD4193/pScr1 Glucose 27 165
DPD4193/pScr1 Sucrose 21 82

11. 11
Hình 2.3 Con đường sinh tổng hợp Tyrosine ở E. Coli
3.3. L-tryptophan
3.3.1. Tổng quan về tryptophan
Là acid amin chứa dị vòng indol.
Công thức cấu tạo:
DAHP synthase (aroF, aroG, aroH)
Glucose
Shikimate
Erythrose-4-phosphate + Phosphoenolpyruvate
Chorismate
4-OH-phenylpyruvate
Tyrosine
PrephenateChorismate
Tryptophan Phenylpyruvate
Chorismate
Chorismate mutase (tyrA, pheA)
(aroK, aroL,)Shikimate kinase
Shikimate-3-phosphate
DAHP

12. 12
Hình 2.4 Công thức cấu tạo của tryptophan.
Công thức phân tử: C11H12NO2
Tryptophan là một thành phần có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm có protein.
Nó đặc biệt phong phú trong sôcôla, yến mạch, chà là khô, sữa, sữa chua, pho mát,
thịt đỏ, trứng, cá, gia cầm, mè, đậu xanh, hạt hướng dương, hạt bí đỏ, tảo spirulina,
chuối, và đậu phộng. Người ta tin rằng gà tây có một hàm lượng cao tryptophan,
lượng tryptophan trong thịt gà tây điển hình cho hầu hết các gia cầm. Ngoài ra còn
có một số quan điểm cho rằng protein thực vật thiếu tryptophan. Trên thực tế,
tryptophan có mặt với hàm lượng đáng kể ở hầu hết các protein thực vật, thậm chí
một số thực vật còn phong phú tryptophan.
Đây là một trong những acid amin quan trọng nhất mà vai trò của nó liên quan chặt
chẽ với tổng hợp tổ chức, các quá trình chuyển hoá và phát triển. Cần thiết cho sự
phát triển của trẻ em, duy trì sức sống, điều hoà chức năng của tuyến nội tiết, đảm
bảo cho sự phát triển của tinh trùng, tham gia tổng hợp Hemoglobin của hồng cầu.
Tryptophan giúp làm dịu thần kinh, gây buồn ngủ do làm tăng nồng độ serotonin
trong não (tryptophan là tiền chất của chất truyền thần kinh serotonin).
3.3.2. Sản xuất Tryptophan từ nuôi cấy chủng Escherichia coli B10 từ glucose
Hình 2.5 Sơ đồ nuôi cấy E.Coli B10 thu Tryptophan từ glucose
Chủng Escherichia coli B10 với hoạt tính tổng hợp tryptophan khá cao được sử
dụng trực tiếp như một nguồn enzym để sản xuất L-tryptophan từ indole và L- hoặc
Chủng E.Coli B10 được nuôi trong nôi trường chứa 5g/L glucose và
20 mg/L L-tryptophan trong bình nón 500ml ở 37
o
C
Thu các tế bào vi sinh vật và rửa qua bằng dung dịch NaCl 0.9%.
Lắc xoay vòng với tần số 100rpm
trong 5 giờ ở 37
o
C
Lấy 0.5 g tế bào vi khuẩn + Đệm Kali phosphat + 0.2g indole + 0.2g
L-serine và 1 mg Pyridoxal-5’-phosphat
Thu sản phẩm Tryptophan

13. 13
D, L-serine. Song song đó, chủng vi sinh vật không có hoạt tính tryptophanase và L
- và D - serine deaminase cũng được nghiên cứu cho thấy âm tính trong điều kiện
sản xuất. Để tránh sự ức chế tryptophan synthetase bởi một hàm lượng indole cao,
các dung môi hữu cơ, chất hấp thụ Amberlite XAD-2 và các chất tẩy rửa không ion
hoá đã được sử dụng để hoà indole trong hỗn hợp phản ứng trong sản xuất L-
tryptophan. Đặc biệt, trong số các chất tẩy rửa không ion, Triton X-100 cho hiệu
quả khá cao. Sử dụng Triton X-100 để sản xuất L-tryptophan từ indole và L- hoặc
D, L-serine từ tế bào Escherichia coli B 10 cung cấp sản lượng L-tryptophan 14.14
g / 100 mL t với thời gian 60 giờ ở 37 ° C [6].
3.3.3. Sản xuất Tryptophan từ nuôi cấy chủng Escherichia coli đột biến
IP60l5/pMU91 [7]
Chủng E.Coli K-12 đột biến JP6015/pMU91 được nuôi trong môi trường thạch với
glucose 2 g/l , dịch chiết nấm men (5g/L) và tetracycline (5mg/l) ử ở 30o
C trong 48
giờ. Sau đó được chuyển sang bình nón 100ml + 10 ml môi trường X ủ ở 30oC 10
giờ và tốc độ quay 250 vòng/phút.
Bảng 2.6 Thành phần môi trường X nuôi cấy chủng E.Coli K-12 đột biến
JP6015/pMU91
Thành phần môi trường X Thể tích cần lấy
Glucose 20% 10 ml
MOPS (X10) 20 ml
Dịch chiết nấm men 20% 1 ml
Tetracycline 10mg/l 0.1 ml
Nước cất vô trùng 170 ml
Lấy 300 ml sản phẩm trên cho vào bình nón 2000 ml, tiếp tục lắc xoay vòng ở 30o
C
trong 24 giờ với tốc độ 700-1200 vòng/ phút. Sau 6.5 giờ glucose được thêm vào
đến ngưỡng 17g/L. Sau 32 giờ, quá trình lên men kết thúc.
Tiến hành lên men ở 33o
C, pH = 7.0 (dùng NH3 khan 25%), pO2 giữ khoảng 40%
với tốc độ gió 1/3 vvm vả khuấy với tốc độ từ 280 - 380 vòng/ phút.
3.3.4. Sản xuất từ 3-indolepyruic acid từ các chủng Micrococcus luteus
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu
Glucose: tinh bột → hòa bột → đường hóa → trung hòa → làm sach và cô đặc →
làm nguội → kết tinh → ly tâm → sấy → phân loại glucose thành phẩm.
Protein đậu nành: trích ly protein đậu nành với hàm lượng protein cao (>90%)
Dịch chiết bắp: dùng nước cứng hòa tan amino acid của bắp sau đem ủ rồi cô đạc
đến 52,5% chất khô. Thủy phân mẫu bằng HCl 6N trong vòng 18 giờ. Hầu hết acid
được loại bỏ khi chưng cất, phần còn lại được trung hòa bằng NaOH 5N. Cho
enzym thủy phân vào, định mức thể tích mong muốn, những mẫu chưa thủy phân
cho thêm HCl 6N đến pH 6.8.
Canh trường được ủ ở 37 °C trong 24 giờ, sau đó bảo quản trong tủ lạnh.

14. 14
Bước 2: Chuẩn bị tế bào khô Micrococcus luteus ATC 3998
Bảng 2.7 Môi trường chuẩn bị tế bào khô Micrococcus luteus 398
Thành phần Nồng độ
Glucose 2%
Dịch chiết thịt 0.5%
Peptone 0.5%
Dịch chiết nấm men 0.3%
NH4Cl 0.5%
NaCl 0.05%
KH2PO4 0.01%
MgSO4. 7H2O 0.01%
CaCl2 Một ít
Môi trường chuẩn bị được khử trùng trong 20 phút ở 120o
C, thêm từ từ
Micrococcus luteus ATCC 398 đã được nuôi trong nước thịt vào môi trường vào
môi trường và ủ ở 18 giờ, nhiệt độ 30o
C.Ly tấm và sấy trong tủ sấy qua đêm.
Bước 3: Tiến hành tổng hợp
Cân một lượng chính xác khoảng 400mg tế bào Miccococcus luteus ATCC 398
được thêm vào hỗn hợp có chứa:
Bảng 2.8 Môi trường nuôi cấy tế bào Micrococcus luteus 398
Thành phần Lượng cần lấy
3-indolepyruvic acid 1000 mg
Glucose 300 mg
NH4Cl 800 mg
K2HPO4 100 mg
MgSO4.7H2O 50 mg
Nước cất vừa đủ 100ml
Dùng hệ đệm phosphate để duy trì pH = 8.0.
Điều kiện: nhiệt độ 30o
C trong 10 giờ dưới điều kiện lắc rung . Người ta nhận thấy
khối lượng L-tryptophan được tổng hợp là 504mg (Sản lượng đạt 50.4% so với
lượng 3-indolepyruvic acid ban đầu).

15. 15
4. Kết luận
Hiện nay, qui trình sản xuất các acid amin vòng thơm được tìm ra và đưa vào áp
dụng ở rất nhiều nơi trên Thế giới. Nhiều bài báo khoa học công bố trên các tạp chí
Quốc tế cũng đề cập rất nhiều đến việc sản xuất acid amin nói chung và acid amin
vòng thơm nói riếng. Phương pháp chủ yếu hiện nay được dùng là lên men và dùng
enzyme vì tính tinh khiết và chi phí dùng cho sản xuất cũng không nhiều. Xu hướng
hiện nay đang hướng đến là dùng những nguồn nguyện liệu rẻ tiền, sạch sẽ và
không gây ô nhiễm môi trường để sản xuất. Tất cả vẫn đang trong giai đoạn nghiên
cứu và phát triển và chúng ta có quyền hy vọng ngành cong nghệ sản xuất acid amin
bằng nguyên liệu vi sinh sẽ tiến tới một tầm cao mới, đạt được nhiều thành tựu hơn
nữa trong một tương lai không xa.

16. 16
TÀI LIỆU KHAM KHẢO
[1] PGS.TS. Trần Cát Đông, “Acid amin và vitamin, Sản xuất nguyên liệu dược
bằng Công nghệ sinh học,” pp. 25–35, 2017.
[2] C. L. C. E. Bulot, “Selective production of Phenylalanine from
phenylpyruvate using growing cells of Corynebacterium glutamicum.
Biotechnology Letters,” pp. 93–98, 1985.
[3] F. Takayasu Tsuchida, Kawasaki, Hiroshi Matsui, Yokohama, Hitoshi Enei,
Zushi, Fumihiro Yoshinaga, “Method of producing L-phenylalanine by
fermentation. US Patent 3,909,353,” 1974.
[4] T. M. S. C. Ian Lloyd-George, “Free and Microencapsulated Erwinia
Herbicola for the Production of Tyrosine. Biomaterials, Artificial Cells and
Immobilization Biotechnology,” pp. 323–333, 1993.
[5] T. K. V. D. Monica M. Olson, Lori J. Templeton, Wonchul Suh, Philip
Youderian, F. Sima Sariaslani, Anthony A. Gatenby, “Production of tyrosine
from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes to
phenylalanineproducing Escherichia coli strains (2007) Appl Microbiol
Biotechnol,” pp. 31–1040, 2007.
[6] F. W. Won-gi Bang, Siegmund Lang, Hermann Sahm, “Production of L-
Tryptophan by Escherichia coli Cells. Biotechnology and Bioengineering,”
pp. 999–1011, 1983.
[7] J. P. Helen Camakaris, Eaglemont, Peter Cowan, Brighton, “Production of
Tryptophan by the bacterium Escherichia Coli. US Patent 5,756,345. May 26,
1998,” 1996.

17. 17

18. Mã tài liệu : 600234
Tải đầy đủ luận văn theo 2 cách :
- Link tải dưới bình luận .
- Nhắn tin zalo 0932091562