1. INGENIERIA GENETICA

2. 1.-INTRODUCCIÓN La utilización de organismos vivos o de sus componentes en la obtención de productos útiles para las personas es la base de la biotecnología . Tradicionalmente se utilizaba la fermentación de microorganismos para obtener productos como el yogur, el pan o el vino El paso de la biología tradicional a la moderna surge con las técnicas que derivan de la ingeniería genética como la tecnología del ADN recombinante La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. La ingeniería genética es una técnica que consiste en la manipulación, modificación e introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos.

3. Los organismos que han sido modificados por ingeniería genética se denominan transgénicos La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan: 1.- la tecnología del ADN recombinante : con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular. 2.- Clonación Permite la producción de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN

6. 2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINNANTE Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee : . Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina).

7. Lo primero que hay que realizar es un corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:

9. Estas uniones entre los bordes cohesivos son temporales , pero se pueden hacer permanentes en presencia de la enzima ADN ligasa La unión del ADN procedente de dos orígenes distintos produce una molécula de ADN recombinante Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

10. El segundo paso es la i nserción de los fragmentos de ADN . Esta inserción se realiza en vectores de clonación , que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN capaces de transportar ADN extraño , que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Además del origen de replicación , los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores , que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación.

11. Se suelen utilizar como marcadores, Genes de resistencia a antibióticos . Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador. Genes de luminiscencia. . En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

12. Los vectores de clonación más utilizados a) Plásmidos . Son moléculas de ADN circular bacteriano , con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación . La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación , se realiza por medio ADN-ligasas , que unen ambos trozos de ADN

13. . b) Virus bacteriófagos . El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus Así quedará el virus completo. En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCION: proceso en el cual los bacteriófagos transportan genes bacterianos desde una célula huésped a otra Son capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plásmido

14. c) Cósmidos : son vectores híbridos entre el fago λ y un plásmido , de modo que su ADN puede replicarse como un plásmido o empaquetarse como un fago D) Otros vectores: Cromosomas artificiales de levaduras, genomas modificados de adenovirus, retrovirus, cromosomas humanos artificiales.

16. b) Transducción . Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. Para poder realizar la clonación génica, el huésped debe ser: - De crecimiento rápido y en un medio de cultivo barato - No ser dañino ni patógeno - Ser capaz de aceptar ADN exógeno - Tener las enzimas necesarias para la replicación del vector Los huéspedes más utilizados son las bacterias Escherichia coli Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisae

17. . Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genómica

22. 4.- SECUENCIACION DEL ADN Se realiza con el método didesoxi de Sanger o Método de terminación de la cadena Se denomina así porque es necesaria la utilización de los didesoxirribonucleótidos que son nucleótidos modificados que han perdido el grupo OH situado en el carbono 3’y que provocan la parada de la copia del ADN por la ADN polimerasa Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

23. El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. Un cebador o "primer" Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP) marcados con una molécula fluorescente para cada uno de ellos El método básicamente consiste en: 1º Se desnaturaliza el ADN que se desea secuenciar 2º Se mezclan todos los componentes de la reacción y se forman nuevas cadenas de ADN que utilizan como molde la secuencia del ADN que se quiere secuenciar . La copia continua hasta que por azar se encuentra con un didesoxi. Al final se obtiene una mezcla de cadenas de ADN de longitudes variadas

24. 3.- Se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa un gel de poliacrilamina, de tal manera que las más cortas se mueven con mayor rapidez 4.- Se obtiene un espectrograma que nos dará la secuencia de bases complementaria de la molde

28. 6.- APLICACIONES EN LA AGRICULTURA Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas . Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados. Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular, lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los protoplastos son células desprovistas de pared celular, que se consigue empleando enzimas que destruyen la lámina media y desorganizan la parte de celulosa). PLANTAS TRANSGÉNICAS Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales, merecen destacarse:

33. Por TRANSFERENCIA NUCLEAR . Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro ,y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto.